Способ получения биомассы

 

g g! Å., .(АЯ библио(Она

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ пп 493978

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 14.09.72 (21) 1829116/28-13 (51) М. Кл. С 12с 11/00 (32) Приоритет 17.09.71 (31) 43421 (33) Великобритания

Опубликовано 30.11.75. Бюллетень ¹ 44

Государственный комитет

Совета Министров СССР

l30 делам изобретений и открытий (53) УДК 663.14(088.8) Дата опубликования описания 19.02.76 (72) Авторы изобретения

Иностр анцы

Гордон Хоумер Иванз и Жан Линдсей Шеннан (Великобритания) Иностранная фирма

«Дзе Бритиш Петролеум Компани Лимитед» (Великобритания) I (7l) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛ УЧ ЕНИЯ БИОМАССЫ

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам получения биомассы.

Известен способ получения биомассы путем выращивания дрожжей Candida lipolytica на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводород, содержащий по меньшей мере 10 атомов углерода в молекуле, при аэрировании среды в условиях оптимального давления и температуры с последующим отделением биомассы.

Целью изобретения является повышение содержания протеина в биомассе.

Для этого по предлагаемому способу из рода Candida lipolytica используют штамм

CBS 6331. При этом выращивание проводят под давлением 1,5 — 5,0 кг/см .

Питательная среда, на которой ведут выращивание, содержит в качестве источника углерода углеводород, содержащий по меньшей мере 10 атомов углерода в молекуле, водную питательную среду и газ, содержащий свободный кислород.

Предпочтительными углеводородами являются нормальные парафины, полученные из нефтяных фракций, выкипающих в областях керосина или газойля.

Нормальные парафины газойлевой фракции содержат 14 — 21, а керосиновой — 10 — 13 атомов углерода в молекуле. Наиболее пригодными являются углеводороды с прямой цепью, полученные из нефтяного сырья при обработке молекулярными ситами.

5 Процесс культивации проводят предпочтительно при 27 — 33 С и рН 4,0 — 5,5, при перемешивании и аэрации в сосуде под давлением

1,5 — 5 кг/см абс.

Высокие скорости роста поддерживают в

10 широком интервале температур и рН, например при рН 3,0 — 5,7 и 20 — 35 С.

Бактериальное загрязнение подавляют проведением процесса при рН 4,0 — 4,8 и 27 — 33 С, Новый штамм CBS 6331 представляет собой

15 мутантную производную диких дрожжей рода

Candida lipolytica в соответствии с систематическим критерием Лоддера; сдан на хранение в Centraalbureau Voor Schirnmelcultures, Ваагп, Голландия.

20 Новый штамм обладает следующими характеристиками.

Морфологические характеристики такие же, как и у Candida lipolytica CBS штамм 2078 и

СМ1 штамм 93743. Эти характеристики соот25 ветствуют стандартному описанию дрожжей

Candida lipolytica по жировому расщеплению за тем исключением, что при выращивании в чашках со средой глюкозы (экстракт дро>кжей), пептоновым агаром или на пластинах

Далмо на arape из маисовой муки колонии представляют собой окрашенный крем, однородный, име1ощий матовую поверхность, без образования складок и псевдомицелия.

Физиологические характеристики идентичны для таковых у Candida lipolytica CBS штамм

2078 и CMI штамм 93743.

Морфологические наблюдения при культивации в глюкозе дрожжевого экстракта на водном пептоне следующие.

При культивации в течение 3 дней при 25 С в глюкозе дрожжевого экстракта на водном пептоне клетки короткие яйцевидные и длинные яйцевидные 3 — 6 и 5 — 11 мк, изредка встречаются удлиненные клетки до 20 мк.

Кожица не образуется.

Лскоспоры и баллиспоры не образуются на споруляционной среде.

Штамм не ассимилирует нитрат калия, мочевину разлагает.

Сахара не сбраживает, ассимилирует глюкозу, этанол, гликоль, эритрит и янтарную кислоту.

Не ассимилирует галактозу, сорбозу, а-рибозу, I -рамнозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, треалозу, лахтозу, мелабиозу, раффинозу, мелецитозу, инсулин, растворимый крахмал, а- ксилозу, I -арабинозу, а-арабинозу, рибитол, галактитол, ññ-маниитол, а-галактол, а-метил-а-глюкозид, салицин и инозитол. желатин сжижает и пептизирует лакмусовое молоко.

Рост на среде, не содержащей витаминов,— медленный.

Стимулируется в присутствии тиамина.

П р имер 1. Candida lipolytica штамм CBS

6331 непрерывно культивируют в асептических условиях при перемешивании в аэрируемом сосуде емкостью 1800 л, выдерживающем давление.

В качестве углеродного субстрата используют смесь нормальных керосиновых парафинов, имеющих 10 — 18 атомов углерода в молекуле, полученных при обработке нефтяного сырья молекулярными ситами.

Водная азотсодержащая среда имеет следующий состав, г:

НзРОз 1,594; КС1 0,916; MgSO4.7Н О 0,521;

MnSO<.4H O 0,035; FeSO4 7Н О 0,052;

7nSO,-7Н О 0,158; CuSO4 7Н О 4,37.10 ";

Н ЯОg 0,172; солянокислый тиамин 220 мг и вода — до 1 л.

После периода инициирования в течение

16 час, во время которого культура достигает концентрации 16 г/л, процесс ведут при непрерывной аэрации со скоростью разбавления

0,16 объема/объем в час при 32 С при рН 5,5.

Поддерживают рН добавлением необходимого количества аммиака. Углеводород подают со скоростью 10 л/час, а водную питательную среду подают со скоростью 260 л/час.

Ферментационную массу аэрируют 1,50 объема/объем в минуту, давление внутри ферментатора поддерживают 2,5 кг/см абс.

Выходной коэффициент равен 0,88 (т. е. весу продукта дрожжей, деленному на вес использованного дрожжами углеводорода) . жидкая среда содержит 23,6 r/÷ сухих клеток.

Процесс ведут 1000 час. При этом жидкую среду анализируют через каждые 24 час, а культуру исследуют на изменение штамма.

Образцы помещают на пластины с SabouraмГз декстрозным агаром (oxoid) и Malt

Extract Agar (oxoid), где oxoid — зарегистрированное торговое наименование.

Пластины инкубируют 3 дня при 30 С.

Полученные колонии представляют собой окрашенный крем, гладкий, с матовой поверхностью без складок.

При всех ферментациях изменения культуры при пробах на пластинах не наблюдается.

При микроскопическом исследовании псевдомицелл не наблюдается.

Содержание сырого протеина (белка) определяют через определенные промежутки времени по известной методике.

Дрожжи дают 63 — 65вес. % сырого протеина от сухого веса дрожжей.

Для сравнения подвергают в идентичных условиях культивации штамм Candida lipolytica CMI 93743, при этом содержание сырого белка в дрожжевом продукте составляет

54вес. % от веса сухих дрожжей. Выходной коэффициент — 0,58.

П р им е р 2. Candida lipolytica CBS штамм

6331 культивируют в тех же условиях и при той же скорости разбавления 0,07 объема/ объем в час под давлением 1,5 кг/см абс. как и CMI штамм Candida lipolytica, описанный в примере 1.

Выходной коэффициент равен 0,73, содержание сырого белка составляет 59 вес. % от веса сухих дрожжей.

Пример 3. Candida lipolytica штамм 6331 инокулируют в водной питательной среде и в углеводороде, как источнике питательного углерода при перемешивании, аэрации в сосуде под давлением с рабочим объемом 55 л.

Углеводород представляет собой смесь нормальных газойлевых парафинов, имеющих

11 — 18 атомов углерода в молекуле, преимущественно 14 — 17 атомов углерода, полученных при обработке молекулярными ситами газойлевого нефтяного сырья.

Водная питательная среда имеет следующий состав, г: Н Р04 1,455; K SO4 0969;

MgSO4 7Н О 0,470; ZnSO4.7Н О 0,138;

FeSO4 7Н О 0,047; MnSO4.4Н О 0,041; (NH4)gO4 0,500; CuSO4 5Н О 4,13 10 —, солянокислый тиамин 0,203; вода — до 1 л.

После периода начального роста проводят непрерывную аэрацию со скоростью разбавления 0,14 — 0,15 объема/объем в час при 32 С и рН 4,5, поддерживая рН на необходимом уровне добавлением аммиака. Углеводород подают со скоростью 220,5 мл/час, а водную питательную среду — 7,42 л/час.

Предмет изобретения

Составитель А. Бражникова

Текред E. Подурушнна

Корректор И. Позняковская

Редактор Е. Шепелева

Заказ 137/19 Изд. № 2039 Тираж 559 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Ферментационную массу механическй r1åðåмешивают, аэрируют 0,75 объема/объем в минуту, давление внутри ферментатора поддерживают 1,5 кг/см абс, Через 240 час после начальной инокуляции культуры дрожжей к ферментационной жидкости добавляют инокулят, содержащий пять видов бактерий, принадлежащих к видам

Acinobacter, Escherichia, Paracolobactrum u

Pseudomonas.

Подсчет бактерий осуществляют через интервалы в одну сотую и одну восьмую часа; образцы, отобранные из ферментационной жидкости, показывают, что число жизнеспособных бактериальных клеток колеблется в пределах 300000 — 2.500000 в миллиметре жидкости.

После окончания процесса в течение 330 и

402 час плотность клеток дрожжей Candida

lipolytica штамм CBS 6331 составляет 23,5г/л.

Выходной коэффициент — 0,99.

Дрожжевой продукт содержит 0,59 вес. % сырого протеина от веса всех сухих клеток.

Затем рН жидкости повышают до 4,5 4,8 в период 520 †6 час. Проводят подсчет бактерий в период 800 †12 час, количество их составляет 109 †10в клеток в миллилитре.

Число клеток Candida lipolytica примерно равно числу клеток бактерий.

Между 1122 и 1218 час работы вес сухих клеток дрожжей составляет 21,3 г/л, а выходной фактор — 0,96. Содержание сырого протеина составляет примерно 59 вес. от общего веса сухих клеток, 6

После 1218 час рН увеличивают до 5,0, причем работа ферментера становится неустойчивой, контроль затруднителен и изменяется выходной коэффициент.

5 В это же время число бактерий увеличивается и превышает число дрожжевых клеток.

Данный пример показывает удовлетворительную непрерывную работу при ферментации дрожжевой биомассы с использованием

10 нового штамма Candida lipolytica CBS 6331 в присутствии значительного по уровню бактериального загрязнения, Выясняется, что производство дрожжевой биомассы не является удовлетворительным, когда ферментацию про15 водят в неасептических условиях при рН 5 и выше.

1. Способ получения биомассы путем выращивания дрожжей Candida lipolytica на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводород, содержащий, по

25 меньшей мере, 10 атомов углерода в молекуле, при аэрировании среды в условиях оптимального давления и температуры с последующим отделением биомассы, отличающийся тем, что, с целью повышения содержания протеина

30 в биомассе, из рода Candida lipolytica используют штамм СВS 6331.

2. Способ по п. 1, о тл и ч а ю щи и с я тем, что выращивание проводят под давлением

1,5 — 5,0 кг/см .