Способ выделения фермента, катализирующего превращение креатинина в креатин и фермента, катализирующего превращение креатина в саркозин и мочевину

 

Союз Советских

Социалистииеекии

Реслубпик (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 04.05.72 (21) 1781172/13 (23) Приоритет (32) 05.05,71. (31) Р 2122298.0 (33) ФРГ (43) Опубликовано 15.10.76. Бюллетень _#_ 38 (45) Дата опубликования списания 25,07,77 (51) M, Kn С 07 6 7/02

Гасударственный иамитет

Соавта Министров СССР па делам изасретений и открытий (53) УДК 577.155.38 (088.8) Ипост1эанцы

Ханс Меллеринг и Кллс Боками (ФРГ) Михаель Нельбек- Хохштеттер (Австрия) и Ханс Ульрих Б ер гма йер (ФРГ) Иностранная фирма

"Берннгер «Маннхайм ГмбХ (ФРГ) (72} Авторы изобретения (71) Заявитель

СПОСОБ ВЬЩЕПЕНИЯ ФЕРМЕНТА, КАТАЛИЗИ1 УЮЩЕГО

ПРЕВРАЩЕНИЕ КРЕАТИНИНА В КРЕАТИН, И ФЕРМЕНТА, КАТАЛИЗИРУ10ЩЕГО ПРЕ11Р,ЩЕ11ИЕ КРЕАТИНА В САРКОЗИН

И МОЧЕВИНУ

Изобретение относится к производству ферментных препаратов.

Предложенньй способ, ранее в патентной литература,не описанный, заключается в том, что клетки

А! са! igenes spec WS 51400 или PeniciI I I èï Ч 48 90001 разрушают, например, ультразвуком или дисперсией высокого давления отделяют балластные белки, осаждатот активную фракцию органическим растворителем, например изопропанолом и выделяют и очиатают целевой продукт известными приемалаь

П.р и м е р 1.. Выделение креатишш-амидогидролазы высокой чистоты.

Культуру Alcaiigenes spec WS 51400 выращивают в обычных условиях на среде, содержащей креатинин, отделяют клетки (1 кг на сухое вещество), заливают 20 л 0,1 M буферного раствора фосфата калия с рН 8,0 и разрушают без охлаждения при давлении приблизительно 800ати. Экстракт смешивают с 5 объемами 10%-ного раствора полиэтиленимина (молекулярньй вес около 1800) с рН 8,0 (около 1 л). После добавления HCI (0,01 М конечная концентрация) и NH4CI (0,1 М конечная ко щентрация) на 1 л экстракта в течение

10 мин добавляют 0,8 объема 907-го иэопропаиола и перемешивают 30 мин при комнатной темлсратуре. Осадок отделяют центрифугированием. К надосадо а1ой жидкости добавляют 0,45 объемов на 1 л

90%-ного нэ. Образовавшийся осадок, которьй содержит креатинин-амидогидролаэу и креатин-амндиногидролазу, отделяют и заливают

400 мл 0,02 М буферного раствора фосфата калия с рН 8,0. Нерастворенньй осадок отделяют, а раствор подают на уравновешенную тем же буфером колонку с 3ЕАЕ- Сефадексом (3,5 см. 1 м). Колонку а промывают 1 объемом 0,1 М буферного раствора фосфата калия с рН 8,0 и затем элюируют целевой продукт 0,2 М буферным раствором фосфата калия с рН 8,0. Содержащие креатинин-амидогидролаэу фракщгп объединяют при рН 8,0, доводят концентрацию сульфата аммония до 2,2 М, ссажденньй фермент отделяют центрифугированием и растворяют до 100 мл, в 0,02 M буферном растворе дно этаноламнна с рН 8,0н в течение 4ч при плюс 4 С подвергают диалиэу против того же буферного д) ра ство ра.

Обший выход препарата 64% с удельной активностью 303 единицы/мг (см. табл 1).

При разрушении клеток с помощью ультразву25 ка выход креатинин-амидогидролаэы можно повью

532341

Таблица1

Результаты активности и выхода препарата цы (25 С) П

Дисперсное разложение

2,8 10

98,6

2,8

100

Верхний слой полиэтиленими66,2

2,6 1ф на

32,6

6,6

Вторая добавка изопропанола (осадок) 28,5

1,97 10

6,9

Хроматография на ДЕАŠ— Сефадекс (эл ваты) 1,8 10

0,59

Таблица2

Разделение креатинин-амидогидролазы и кРеатин амнднно гидролазы на анионообменной смоле ДЕАŠ— Сефадекс

ot ццролаза

Белок,мг

Стадия

После стадии осаждения изопропанолом

0,25

4,9

860

175

ДЕАŠ— Сефадекс— промывная вода

0,20 М, рН 8,0 (Элюаты) 27

787

0,50 М, рН 8,0 (Элюаты) 3,0

0,13

1,8

13,7 апь приблизительно в 2,5 раза при одинаковой удельной активности.

Полученная как описано вьппе, креатинин-ами,.рищролаза имеет константу равновесия к2еатин

=127 (37 С; рН 80) креатинин

Константа Михаэлиса дня креатиннна как суб. страта КМ = 3,3 10 М (37 С; рН 8,0) .

Пример 2. Разделение креатинин-амидогид. ролазы и креатин- -амидиногидролазы.

Вьщеление проводят, как в примере 1. Однако, после злюирования креатинин-амндогидролазы;, с ионообменной колонки элюируют креатин-ами. диногидролазу при помощи 0,2 М буферного раствора фосфата калия с pH80, содержащего0,3

NaCI (см. табл. 2).

Первая добавка изопропанола (верхний слой) 2,16 10

Пример 3. Первый этап выделения проводят, как в примере 1, 100 г осажденного изопропанолом сырца растворяют в 100 мл 0,02 М буферного раствора . фосфата калия с рН 8,0 и смешивают с

ДЕАЕ- Сефадексом, Ионообменную смолу отфильтровывают, промывают приблизительно

100 мл 0,08 М буферного раствора фосфата калия с рН 8,0 и для общего элюирования обоих ферментов перемешивают 15 мин при плюс 4 С со 100 мл о 0,2 М буферного раствора фосфата калия с рН 8,0, содержащего 0,3 М KCI и затем отфильтровывают.

В элюате находятся оба фермента, Осаждением сульфатом аммония можно получать препарат с 31,5 ед мг креатинин- амидогидролазы и 1,1 ед мг креатин — амнднногидролазы (см. табл. 3) .

Таблица 3

Выделение креатинин-амидогидролазы и креатин-амнднногидролазы из

100 г на сухой вес Alcaligenes spec. WS 51400

Стадия

Белок, лаза

2,4 10 0,92

6 102

26,1

0 023

Разрушение

Вторая добавка изопропанола (осадок) 1 98 104 139

3,8 10а 0,265

1,43

ДЕАЕ-Сефадекс злюат0,5 М рН 8,0

1,16 104 31,5

4,1 10 1,1

0,370

Формула изобретения

Составитель С Щенева

Техред Il. Аидрейчук

Коррекгор A Лакала

Редактор Л. Рюрина

1137/686 Тираж 575 l !оииисиое

ППИИПИ Государственного комитета Совета Микис)р н СC(Р ло делам изобретений и откры1ий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. д. 4/5

Заказ

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ выделения фермента, катализирующего превращение креатинина в креатин, и фермента, катализируищего превращение креатина B саркозин и мочевиH),, из клеток Alcaligenes spec WS 51400 или Penicillium WB 90001, отличающийся тем, что клетки разрушают, отделяют балластные белки, осаждакл активную фракцию органическим растворителем, например изопропанолом, и выделяют и n÷èùaíí целевой продукт известными приемами.