Способ получения препарата простагландина ряда , обладающего противовоспалительным действием действием

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

>639421

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 03.06.75 (21) 2142156/э8-13 (23) Приоритет — (32) 04.06.74 (31) 24660/74 (33) Великобритания (43) Опубликовано 25.12.78 Бюллетень ¹ 47 (45) З,ата опубликования описания 10.01.79 (51) М. К,7.- А 61 К 33/00

С 07 С 177/00 йсударственный комитет

СССР (то 1(effafvl изобретений и открытий (53) УДК 615.45:615. .7 7 7/.779. (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Самуэль Вилкинсон, Родерик Джон Флауэр (Великобритания) и Серджио Энрико Феррейра (Бразилия) Иностранная фирма

«Дзе Велкам Фаундейшн Лимитед» (Великобритан,ия) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧ ЕНИЯ ПРЕПАРАТА

ПРОСТАГЛАНДИНА РЯДА е, ОБЛАДАЮЩЕГО

П РОТ И ВО В ОС ПАЛ ИТЕЛ ЬН ЫМ ДЕЙСТВ И ЕМ

Изобретение относится к фармацевтичеокОЙ про мь?шло?снОсти и касается полу ?ения лекарственных препаратов, обладающих противовоспалительным действием.

Предложенный способ является Hовым, в патентной и научно-технической литерат,ре не описан.

Цель изобретения — получение препарата простагландина ряда е, обладающего противовоспалительным действием.

Это достигается тем, что смешивают соединение формулы (N), 6И1, ЕО<еа)

Ф0 УСО(Г61) где (М) — остаток иммуногенной м??кромолекулы формулы (М) — XH, (PG) — остаток простагландина и Ill его аналога формулы (PG) — СООН, выбранного из простагландинов ряда е и тех их аналогов, которые содержат характерную циклопентановую группу или у которыми эта группа замещена ци!клогексановой группой, у выбран пз — XH(CH2)„UH (1), где а — 2 — 6, — XI-1(СН )„, Z(CH.)„,IXH (11), где Ь.

5 и Ь, одинаковы или различны и каждый 00ставляет 1 — 4, à Z — О, — ХН или — СН(ОН), — !! СО - СН.%! (III), где III и Ю, одинаковы или различны и каждый oooзначает

10 группу, определс?.ную в формула. 1!I.7;I II u — ХН - СН - СО - ХН . СН, .СОФ, (11 ), где

Ж вЂ” группа, определенная в формул ?i ил?? 11, х — 2 — 4, 15 т — по крайней мере 1, ие превышае" ! исло свободных аминогрупп в исходной макромолекуле группы (М), доступных длч ацилирования, р — 0 или 1, п — 0 илп целое число, не превыша?оMce !IIIc 70 ?;ар боксильиых гру!п?т II исходной макромо7åêóëå группы (Ч), доступных для реакции с бис-амином Н вЂ” Y — Н, и составляет О, когда р равно 0 и когда сумма п больше 1, группы (РЬ) могут быть одинаковыми или различными. с гидроокисью алюминия, лиофилизируIoT Il добавляют стерильный раствор хлоЗ0 0I!стого натрия.

639421

Препарат простагландинов ряда е может быть получен люоым методом, известным в облзспи получения со лпнений ана70гич«ой структуры.

Получение препарата может вкл(очать последовате,lbHocTb стадии:

B) получение производного Л, (М) — Х Н . СО, (СН,), . СООН ((з макро. (Олекулы (М) — ХН2, например, !

)еа(кцией с соответствующим ангидридом

«!!(слоты ) 0(СН ),COj О; б) получа(гнp из производного А 7роизполного В ,М) — ХН вЂ” СО (СН,), СО . Y — Н (В) ,) гакц(ией с соответствующим бис-амином (5

Н вЂ” Y — Н; с),сочетание с производным В соответству(ощего простагландина (PG) — СООН или смеси простагландинов с получением конечного препарата.

При получении препаратов, в которых просга гландииoвая и макромолекулярные части связаны прямо, как при стадии почучения препарата, содержащих связанную

7 !)уп пу, пре (почтительно цспс),7«зу(0T олин из методов, известны.; в области синтеза "-аких соединений, лля обеспечения ооразования пеп гид«ой связи, например испо,.7ьзовние м карбодиимида, использованием ррВге.(TB K В тзарда или методом смешанных 30 а ноил р пдо в.

Прп примcHåíèll карболиимилB Hаиболее пi»едпочтительным является такой, как. иаи";имер, !N - (3 - диметиламинопрош(л) - Nэгилкароолиим((л и ., — (3-лиэтилам»нопропил) -этплкарбодппмил, з случа. которсп о побочны(1 продукт реакции, соответс (венно мочезина, зо IopBcTBoplfh и м,) êpт быть отлиализова « из реакционной смеси.

Подхо ящими реагентами для мет07B 4" смешанных апгlt1pII79B 5(в,ля(отс!(этилх,7opфори!!ат, изобутплхлорформиат и пзобути,7хлоркарбонат. Проводят реакцию в присуiствии третичного органического основан;!я.

TBKoIo как триалкиламин, например три0Tил ам>ин i. 7II TpH-H-б3 Tllла ми>l и,!и Х-м.тилморфо»HH. Реагент К Вудварла представляет собой Х-этч(л-5-феиилизоксазрилил-3-сульфонат.

=0

Пр|и получении препаратов, з которы; п1)исутс7)вует связующая группа, конденсация простагландина (PG) — COOH возможна и с вновь синтезированной амииогруппой (появившейся из-за включения бис-амина

H — Y — Н) и с любой из оригинальных аминогрупп.в исходном веществе (М) — КН>, которые остались свободными и peBI<(II(nltHO активными. 60

Предпочтительным является 12-кратный

|молярный избыток ангидрида по отношени!О к общему числу аминогрупп, а в Tîì случае, когда в макромолекуле (М) — МН! содержатся остатки тирозина (как, иапример, в случае сызороточного альбумина оыкз), >келательн о проводить эту стадию при слабо щелочном рН, например 8,0, лля избежания ацплирования гилроксильных групп тирозина.

Конденсация бис-амина Н вЂ” N — Н произойдет не только с вновь синтезированной карбоксильной группой (появляющейся в резулы ате возлействия ангидридом кислоты), но и с любой свободной и реакционноактивной карбоксильиой группой, присутствующей в исходном соединении (М) — ХН .

Для того, чтобы избежать поперечного сшивания продукта. бис-ампп Н вЂ” Y — Н желательно вводить в реакцию в очень большом избыт(ке.

Препарат простагланлина ряда е, обладающий противовоспалительным действием, может быть использован лля профилактики и терапии заболеваний, например язвенных колитов, нарушения соединительных тканей, неинфекциопных артритов, ревматических артритов, подагры и легенератив(!ых артритоз, болезней состояния с острыми или хроническими воспалительными изменениями, первично ооусловлепными а.7лергическими или геммунологическими причинами, например аллергический ренит, крапивница, экзема и другие аллсргпчсские кожные заболевания и в()сиалитез!ьи(! > c«cTO»ния глаз, а также расстройс7)ва> ооуc,lî.лепные аггрггацией тромбоцитоз крови.

)Келательно, чтобы макромолекулярHая час(ь препарата была HpàíòèãCнн()й Лля в-! оз, которым назначается введение этого

lH P PI I B P B T B, п 0 э т 0 м i п 17 еп а Р а т ы, It i) T o P 1>I P ирелназначг«bl лля введения челс)век, получают .из белковых фракций сыворотки

I poiBH Rp. 70IIB1 B, та(>:их I Btc сывороточный

n,7i>t)I ii1H iP oHPI4B H III сывоРоточный гJIÎ о лин человека.

Преиара г вводят люоым известным clIoсобо >1. 1«ап1) имеp полко>1(ные, !зчутрикож:! ые

«, IH ЗНГГО !МЫ(пЕЧИЬ(Е ИНЪ>ЕКЦИ.

1!репарат может вкл(очать водные cycareHa1li активного ингредиента, водные рас)воры, тле волной сролой являсгся, напр;1мер, непирогенна» вода,!Ли физиологи>(еский раствор il »Bit« и»аство,)ы могут б)ьпь ир: готовлены при иеоохоли. .;.)сги добаз,!енпем водной среды к порошксобразному ингредиенту. В препарат может

«ыть вк.i lo -ip«0 Hc HO tocBTCJlbHop cpc IcTHO лля ус!(лепи» иммунной реакци,и На 1(кгивиый иш.реди I(T. Подходящими вспомогательными сре7ствами являются соли а.7(0мини»,п.ш кальция, например калиевы

-квасцы и фос(()ат кальция, раститсльиоз масло (напри".(Pp арax«coaoe) или минеральное масло, а также может б! Iть Вклlо:чеи з препарат эмульгирующий агент, суспензии убитых ба(с(ерий, например Согупе!

17а;1егII(m,ðBãëITï, буферы, предохраняющ !е средства (включая антиоксиданты) и веще-, с -ва, включенные в состав лл I того, чтобы

639421 препарат был изотоническпм по отношению к крови предполагаемого реципиента.

Пример 1.

Л. Получение препарата сывороточного альбумина быка с простагландином е (Рйе!) .

Простагландин Bf (20 лг) растворяют в 0,02 вес. % растворе карбоната натрия, в

10",о-ном водном этаноле (20 лл). I(этому раствору добавляют 46 лг бычьего сывороточного альбумина и 20 лг Х- (3-диметиламинопропил) — N — этилкарбодии)мидгпдроõ)toð!4/t и получившуюся смесь перемешивают 24 ч при комнатной температуре. 33тем смесь диализуют при 4 С 24 ч против буфера (0,005 М Ма НРО4/Na Н>РО4, р Н 7,0, 0,15 М ХаС! при рН 7,2).

Твердый остаток 315 лг, полученный лиофилизацией, содержит 2,0б лг простагландина е (т. с, около 9,б лолей РС)е на 1 люль сывороточного альбумина быка) по данным измерения молярного коэффициента экстинкции простагландиновой части препаратя в,„= 27,200) .

Б. Иммунизация крыс, Крысы «Вистар» (21 шт.) трехнедельного возраста делят на две группы. Одной группе делают подко)кные инъекции с месячными интервалами (всего 3 инъекции) препарата сывороточного альбумина быка с РС)е! (500 лкг), эмульгированного в пол-!

Ном вспомогательном средстве Фройнда (0,1 14л). Контрольной группе делают инъекции одногo вспомогательного полногс средства Фройнда (0,1 лл) по такой же временной схеме.

В. Измерения титров антител.

Через месяц после последней ин.ьскци. 1 по два животных из ка)идой группы (имму.нпзиро ванной и контрольной) aHecTezlfp) нембуталом и производят отбор крози по

2 л.г введением полой иглы в нисходящую часть дуги аорты и в трубку, содержащую

0,1 лл гепарина 5000 ед/л.г. После осторожного встряхивания кровь центрифугируют (5000 g) 20 .1!ин, удаляют плазму ц разоавляют буфером трис-НСI (трис- (оксиметпл)a itrHovfeTaHj до рН 7,5 для по1) ICHия разбавлений 1:2 и 1:5. По 0,5 1!л аликвoT неразбавленной пли разоавленной плазмы В пробирка:; смешивают с РС)е и затем пробирки 14нк .биру!От при 4 С 18 ч.

Когда инкубацию заканчивают, добавляют полпэтиленгликоль — 4000 (0,5 лл;

25 /О-ный водный раствор) и содержимое пробпро к перемешивают и переносят в о:лажденные цент: ифу)кные пробиркп. После

30-минутного центрифу! Прова ния отбп;а to-.

0,1,1f.ã супернатанита и оценивают радио2 К Т И Ь Н 0 С ТЬ 0 О Р 3 3 Ц 3 М ЕТ ОС ГО М И 3 ) (,, Н 11 Я i) 3ДИ02КТИВНОСТИ С ЖИД)СИМ СЦI)ii ГИ I;I)IT01) )М. РачНЕНИС ПОЛA ×CItTIÎÈ ВЕЛПЧИНЫ .С РаДИ02 тпвностью; введенной в начале, позволяет ,р ..счигать связывание с плазмой, т. е. ме50

66! 0 .ifг СгкцiiHII.111 ) OB3 :-1НОГСО ОВ1 1ЬС1 О CblBO

;.) ОТОННР1 0 3 lb 0 I )i! f112 02 CTBOp H IOT В 20 )!

B03hh +(f03 В. f Я )ОТ z(p 2 СТ!ЗОГ)) 1 59 с .! If! !1 1 О

x,10ð1!ë 3,3-днам:.По.ц)пропиламина и 0,89 г

1 ПДРОХ101) ПД ЭТ !11Д)iЭTП 12 МIIHОП;)ОнliЛК3 ) .)О:I, .!ими.",2. PI! раС, Вора дОВОЛЯТ до 0,0 .(,)оавлен!!см 0,5 и. раствора соляной кисло Iы и реа ш)он . ю см сь и,)емешивают з тсмнотс в гсченп;- 24 ч при комнат ой тсмпературе. Раство;) дпализуют при 4 С против часто сменявшейся дистиллированной

B0+b!. Содержимое T.)) О! .И,1по(!)И,.1пз) 10т получают 80 л; бс l()f o аморф)!ого порошска (),АП-Сук-hCA).

В. По.i H .!Пе il:)(113 )ат;1 и,)ОС I аг 13fi lliH2

; ДА!1-CI к- Б) СА.

30 л простагландина B (РС)в) растворяют В. эта: оле, .содержащем 30 л.! 0,02)",,;НОГО ВОДH ОГО;) 3СТЗОР3 Ка Р ООII2Т2 H 2 ТР II ЯI.

Добавляют 60 .пг JAII-Сук-БСА и 30 лг

ГП 1DOX,ТОП П": ЭТП11!1ЭТ)113 М!)чотт!)<))т!!.));:)4)ченый прос)агл 1)д;н, Осажденпьш с оеКОМ.

Г. 11змерения зоопал)!тельной реакц и.

Измерения делают чере. месяц после последней инъекции препарата. 5Кивотных пммунпз !рованных;! OHTpo1i>ных не кор) ят

В ТЕЧСПП(ПО 1П И Н3 С 1ЕД) lоший 30Hb,ВЫЗЫвают Воспален!)е введением под подошву одной лапь, каррагинина (0,1 лл 0,5О, ) 1«>Tо раствора в физио 10ГП Ооком растворс). В

".0 же в;)емя 3 ко:)тра 13тсральную лапу Вводят подобной же инъекцие!1 0,1 лл одного физиологического !)аство1)3. Объем лапь. пзмерчют методом зь тес:!Сипя ртути и увсличсппе В результате вызванного воспаления рассч)!тыва((т вы 1П ганпем объез!2 контр .1ьной,:2!!h. Пз оьема лапы. в которую была сд лана !Гнъекц)!я каррагпнина.

П р 11 м е р 2.

Пол чеп 1е препа,)212 бычьего сыво;-оточного альбумпна с простагландином е, со1(!))Кан!ЕГО П 0)1С )КУ 10ЧНУIО СЗЯЗ iollt)!О группу.

А. Сукцпнп,lilp )Bar-:ны1! сывороточны!! альбумин быка (Сук-БСА).

I(!) IfcT2.1лпчсскпй сывороточный! альбу(мин быка 5,0 г растворяют в 100 лл воды и о faжд2ют раствор до 0 С. 5,0 " янтарного анг;!дрита il )степенно добавляют прп перемеш иван. 1:l з течение 1 ч, поддерткпвзя рН рав:!ым 8.0 дооавленпем 1,0 í. 1II3роокпсп натрия. После добавления п)дрпда смесь зыдерживзю-. для протекания реакции 30 лик. Общий расход 1 н. гпдроок;!сtt з6 нагр;!я cocT23,1IIOT 98,6 лл. Раствор диалпз)10 Г пр)! 4 (против част; ) см(ПЯвш:пс)1 дп.-тил1!!!!Оьанно!i воды. Содержимое трубI.п л iоф! I;IП311<) юT i п0,1T:12 ioT "),7 г. . 3)! ) П()— ного iiopoшкс. т!Пн!11 t )прованная рсак!1;.-:

40 показала, чго В-e (f)f: ног;)уппы в 2.1:, о, миiC ОЫ 111 П;.)ОС КЦ!1Н!11ПРОВан1>!.

Б. Р акцпЯ (гк-БСА с 3,3 дfiаxllfпддп: I ) ОП П Л 3 )1 п l! ОМ.

639421

Формула изобретения

ИН (СЬ I CH III - CO 3)I, C0rea1„, 1М1(fC.0 АСЬ (Рб)) „ — XH (СН2) „NH (I), где а — 2 — 6, Составитель С. Малютина

Техред С. Антипенко

Редактор T. Загребельная

Корректор И. Симкнна

3a к. 962/1517 Изд. М 346 Тираж 661 Подписное

НПО Государственного коми-.ета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент» бодипмида, рН доводят до 6,8 добавлением

0,5 н. раствора карбо-Iara натрия и смесь .перемешивают прп комнатной температуре в течение 24 ч. Раствор диализуют !

НрН 4 С лротпв 4 смей буфера (0,005 М

Ха 11РО /МаН Р04, 0,15 М ХаС1, доведенный до рН 7,0 добавлением 1,0 н. раствора гпдроокиси натрия) в течение 24 н. Содержимое трубки лпофилизуют и получают 310 лг белого а,морфного порошка. 10

Содержание простагландина в препарате оцени вают crleêòðîôотометрически.

Пример 3. Приготовление препарата дл я и нъе кани.

Дпализо ванную смесь из примера 1 ана- 15 лпзируют. Затем этот ра створ сте рплпзуют фильтрацией через мембранный фильтр с размером .пор 0,22 як,н. Объемы стерильного фильтрата, содержащие эквивалент 5 лг бычьего сыворогочного алыбумина раопре- 20 деляют с сохранением а септических предосторожностей по йредварительно стерилизованным склянкам и затем лиофилизуют.

После этого склянки закрывают стерильными резиновыми пробабками. Вакцину в таком состоянии хранят до тех пор, пока она не пот;ребуется, Инъекцйю приготавли вают растворением лиофилизованного материала в 1 лл стерилыного раствора хлористого натрия

0,9 вес. %.

Инъекцию приготавливают добавлением в одну склянку с лиофплизованной,вакциной 0,2 лал стерильной суопензпи ультрамелкой гидроокиси алюминия, содержащей 35 приблизителынс 7,0 лг алюминия. Эту смесь оставляют на короткое время и разбавляют до объема 1 пл добавлением, стерильного

;раствора хлористого натрия 0,9 вес. % для введения внутримышечной или подкожной 40 инъекции.

П р и,м е р 4. Диализованную смесь из примера 2 анализируют. Затем этот раствор стерилизуют фильтра ци ей через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мк.и. О бъе- 45 мы стерилизованного фильтр,ата, содержащие эквивалент 1 лег и репарата, распределяют по предварительно стерилизованным склянкам, затем лиофилизуют и запечатывают как в при мере 3. Вакцину приготавлп- 50 вают аналогично примеру 3.

Предлагаемый способ обеспечивает получение препарата простагландина ряда е, обладающего высоким противовослалительным дей!ст1вием. 55

Способ получения препарата простагландина ряда E., обладающего противовоспалительным действием, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что смешивают соединение формулы где (М) -- остаток иммуногенной макромолек .лы форм < лы (М) — КН2,. (PCi) — остаток простагландина ил<и его аналога формулы (PCi) — COOH, выбранного из простагландинов ряда е и те их аналогов, которые содержат характерную цеклопентановую пр упп у,,или у .которых эта группа замещена цикл огексановой группой; у выбран из — ХН (СН ) l,, Z (СН )», NH (11), где Ь и 62 одинаковы или различны и каждый составляет 1 — 4, а 7.— О, — NH или — CH(OH), — %СО . CHgWI (III) (где W и %1 одинаковы или различны и каждый обозначает группу, определенную в формулах I или 11 и — NI- СН . СО NH CH2

СОФ2 (в) где Ю, — группа, определенная в форму;Iax 1 или II, х — 2 — 4, m — по крайней мере 1, не превышает число свободных аминогрулл в исходной маиромолекуле группы (М), доступных для ацилпрования, р — Оили 1, и — О или целое число, не превыша|ощее число карбоксильных групп в исходной макромолекуле группы (M), доступных для реакции с бис-амином Н вЂ” Y — Н, и составляет О, когда р равно О и когда сумма и больше 1, группы (Pb) могут быть одинаковыми или различными, с гидроокисью алюминия, лиофилизируют и дооа вляют стерильный раствор хлористого натрия.