Способ детектирования аминокислотпри хроматографическом анализе

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик ц8197.12 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 190376 (21) 2335778/23-25 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет (51)М. Кл.

G 01 N 31/08

Государственный комитет

СССР по делам изобретений н открытий (53) УДК 543. 544 ° (088.8) Опубликовано 070481.Бюллетень М 13

Дата опубликования описания 17. 04 . 81

М.JI.Àëåêñàíäðoâ, В.Г.Мальцев, Н.Н.Комаров, Н.Н.Сударев», В.Б.Мелас и. Б.Г.Беленький (72) Авторы изобретения

Ордена Трудового Красного Знамени институт высокомолекулярных соединений AH СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ АМИНОКИСЛОТ

ПРИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

Изобретение относится к области аналитической биохимии и может быть использовано при хроматографическом анализе аминокислот.

Известен способ хроматографического анализа аминокислот, включающий обработку элюата нингидриновым реагентом следующего состава: нингидрин 20 г/л 5пС12.2Н О 0,38.г/л, растворитель метилцеллозольв + ацетатный буферный раствор рН 5,50 (3:1) и фотометрическую регистрацию окрашенного продукта (1) .

При данном способе реакция аминокислот с нингидрином завершается в течение 15 мин при 100 С в проточном реакторе, откуда окрашенный продукт поступает для регистрации в проточную кювету фотометра.

Известен также способ детектирования аминокислот при хроматографическом анализе на капиллярных колонках, включающий обработку элюата нингидриновым реагентом и фотометрическую регистрацию окрашенного продукта. Данный способ является близким к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату.

В известном способе нингидрированную реакцию с реагpHTÎM проводят при 120-135ОС, а во избежание закипания растворителя ставят на, выходе из капилляра гидродинамическое сопротивление, обеспечивающее давление в реакторе д 2,5 атм. В этих условиях время завершения реакции сни>кается до 6 мин прп 120 C и 1,5 мин при 135ОС. При температурах выше

130 С стабильность нингилрированного реагента понижается, что проявляется.в выделении осадка, засоряющего жидкостные коммуникации(21 .

Недостатком известных способов является длительность реакции и низкая чувствительность.

Цель изобретения — ускорение и повышение чувствительности.

20 Поставленная цель достигается тем, что в способе, включающем обработку элюата нингидриновым реагентом и фотометрическую регистрацию окрашенного продукта, используют

25 нин риновый реагент, содержащий

23-25 г/л нингидрина и 0,70-0,75 г/л

5пС1 . 2Н О в ацетатном бу4>ерном растворе с рН 4,8-5,2.

Экспериментальные исследования

ЗО показали, что нингидриновый реагент

819712

Реакция осуществлялась в проточном реакторе из фторопластового капилляра с внутренним диаметром

0,8 мм, на выходе которого находилось гидродинамическое сопротивление — капилляр 0,3 мм, длиной 3,5 м, что достаточно для создания в реакторе давления 3 атм. Время реакции задавалось скоростью подачи реагентов в смеситель (1 мл/мин для раствора аминокислоты и для нингидринового реактива) и изменением длины реактора (10 сек при 33,5 см 1,5 мин при 302 см и 15 мин при 3 10 см).

Прореагировавшая смесь на выходе из реактора охлаждалась и направля15 лась в детектор-спектрофотометр с длиной кюветы 1 см, где измеря лась раэййца оптических плотностей продукта реакции и разбавленного вдвое нингидринового реагента на

g() длине волны 570 нм для валина и

440 нм для пролина.

Изобретение позволяет ускорить, время завершения нингидриновой реакции и повысить чувствительность хроматографии аминокислот.

1,5

135

20 0,38 5,50

3,8

115

2 20 0,38 6,0

3 . 20 0,38 4,8

2,3

150

125

2,5

4 20 0,70 5,50

5 20 0,70 4,8

6 23 0,70 4,8

170

0,5

165

0,3

0,17

23 0,70 5,2

165

175

8 23 0,70 4,2

1,2

Способ детектирования аминокислот при хроматографическом анализе на капиллярных колонках, включающий обработку элюата нингидриновым реагентом и фотометрическую регистрацию окрашенного продукта, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью ускорения и повышения чувствительности, 6(} используют нингидриновый реагент, ВНИИПИ Заказ 1371/23 Тираж 907 Подписное филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 предложенного состава термически более стабилен, чем нингидриновый реагент известного состава. Использование предлагаемого реагента позволяет поднять температуру детектирования до 160-165ОС, причем в этих условиях реакция завершается за более короткое время (см. таблицу), что обеспечивает малый вклад размывания в реакторе в общее размывание хроматографической эоны и позволяет повысить чувствительность.

Иэ таблицы видно, что температура реакции 160-165 С является оптимальной, так как при дальнейшем по-. вышении температуры возрастает тер модеструкция окрашенного продукта.

С другой стороны в области рН 4,85,2 температура термодеструкции максимальна, а нингидриновый реагент отличается наибольшей стабильностью.

Исследовалась реакция с нингидрином аминокислоты валин (концен- . трацйя 5 ° 10 И) и иминокислоты пролин (концентрация 10 M). х — режим по прототипу, хх — оптимальный режим

Формула изобретения содержащий 23-25 г/л нингидрина и

0,70-0,75 г/л SnCl 2Н20 в ацетат2 ном буферном растворе рН 4,8-5,2.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. S.Noore, D.Н.Spackmon, W.Н.Stein

Anal. Chem. 1958, 30, 1185.

2. N.G.Anderson, R.Н.Stevens, I.W,Holleman, Anal. 8iochem,, 1968, 26,. Р 1, 104 (прототип).