Способ определения изоферментов креатинфосфокиназы в тканях

 

iii957105

Оп ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советски«

Социалистически«

Респубиик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 15.08.80 (21) 297 1166/28-1З (51)М. Кл.

G 018 ЗЗ/48 с присоединением заявки № (23) Приоритет

3Ъеуаврстеаеы1 кемктет

CCCP ав делам «зеервтевкй и от«рмт«й

Опубликовано 07.09.82. Бюллетень № ЗЗ.

Дата опубликования описания 09.09.82 (53) УДК 616.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

E.Ì. Хватова, Т. С. Семенова, И. H. Балакина и И. Н. ялирина а

Горьковский медицинский институт им. C. Q.,Кирова (7l ) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОФЕРМЕНТОВ

КРЕАТИНФОСФОКИНАЗЫ В ТКАНЯХ

Изобретение относится к биохимии, в частности к определению иэоферментов креатинфосфокиназы в тканях, предпочтительно в сердце и мозге.

Известен способ определения изофер5 ментов креатинфосфокинаэы в тканях путем экстракции креатинфосфокинаэы из образца с последующим электрофоретическим разделением экстракта, при этом экстракт наносят на ацетатцеллюлоэный носитель. Этот способ предусматривает насыщение ацетилцеллюлозного носителя электродным трис-вероналовым буфером (рН 8,8) с добавлением тиолредуцирующего агента, нанесение на носитель. образца исследуемой ткани> проведение электрофореза, идентификацию среды глицилглицинового буфера (рН 7,2), креатинфосфата, АДФ, АМФ, НАДФ, гексокиназы, 2о глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, фенозинметасульфата, нитросинего тетразолия, ионов магния с последующим денситометрированием

Носитель замачивают в трио-вероналовый буфер (рН 8,8) с добавлением в качестве тиолредуцирующего,агента дитиатрейтола. Электрофореэ проводят в течение 45 мин при 15оС .и градиенте потенциала 250 В/см. Затем электрофорвзные ленты располагают на стеклянной пластине и сверху на них накладывают другие ацетатцеллюлозные ленты, выдержанные предварительно 10 мин в инкубационной смеси (для приготовления инкубационной смеси к 15,мл 0,05 М глицил-глицинового буфера (pH 7,2) прибавляют 0,11 мМ глюкозы, 0,15 мМ

АДФ, 5,2 мМ НАДФ, ЗЗ мМ. креатиаросфата, 10 мл (160 ед. Бюхера) гексокиназы, 10 мл (80 ед. Бюхера) глюкозо-6-фосфатдегйдрогеназы. Далее на каждую пару лент накладывают ленты, выдержанные 10 мин в темноте в индикаторной смеси (для получения индикаторной смеси готовят раствор фаэозинметосульфата (1 мг/мл), хранят цри — 10 С, затем готовят раствор тетразолия питрого;.убого, 105 4

Нктросиний тетразолий, . мМ 0,31-0,61

Хлористый магний, мМ 10,0-31,6

Способ осуществляется следующим об5 разом.

Полоски ацетатцеллюлозной пленки

"Владипор замачивают на 10-15 мин в электродный тряс-вероналовый буфет (рН 8,8), содержащий 10 мл глутатио10 на. Затем избыток влаги удаляют фильтровальной бумагой. Полоски помещают в камеру для электрофореза, натягивают их ,к включают напряжение на 10 мин. 3атем ток выключают и наносят образцы

15 исследуемой ткани. Проводят электрофоретическое разделение в режиме, определяемом видом исследуемой ткани.

Для проведения креатинфосфокиназной реакции, используемой для идентификации

20 изоферментов,. полоски ацетатцеллюлоэы предварктельно пропитывают 10 мин инкубационной смесью следующего состава: глицил-глициновый буфер 10 мл (рН 7,2); креатинфосфат 40 мг; АДФ 6 мг; АМФ

И 50 мг; НАДФ 3 мг; гексокш аза 0,2 мг; глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа .10 ед.; фенозинметалсульфат 2 мг; нитросиний тетразолий 3 мг; М(С >130 мг.

Затем полоски плотно накладывают на

50 полоски с образцами тканей, вынутые кз камеры для электрофореза. Такие двойные

- полоски инкубируют в термостате при

37О С 10 мин. Проявленные полоски осветляют вазелиновым маслом и десито35 метр яр уют.

Предложенным способом проведено 25 опытов с электрофоретическим разделением изоферментов креантинфосфокинаэы в тканях сердца и мозга. Во всех случаях предлагаемый способ позволил получить

4 фракции:иэ сердца - ММ МВ, 8В и митохондриальную фракцию и 2 фракции из ткани мозга — ВВ и мктохондриальную.

0,65-0>98

3 987 для чего 27 мг тетраэолия нктроголубого и 2 мМ Ма-(ОАс)g 4Н>О в 100 мл глкцилглипинового буфера (рН 7,2) филь руют и хранят при 8оС, непосредственно перед опытом 0,4 мл раствора фенозин метасульфата смешивают с 10 мл раствора тетразолия голубого) к инкубируют 1ч при 37о С. Окрашенные пятна денситометрируют (1).

Недостатком известного способа является малодоступность носителя, а также дитиотрейтола, используемого в качестве тиолредуцирующего агента. Кроме того, известный способ длителвн, так как про.должительность анализа 3 ч, в частности много времени занимает идентификация вследствие того, что ннкубацию проводят дважды (по 1 ч каждый раэ).

Кроме того, известный способ имеет недостаточную разрешающую ппособность, так как в исследуемых образцах он позволяет обнаружить только 3 иэофермента КК.

Пелыо изобретения является ускорение способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения изоферментов креатинфосфокинаэы в тканях путем экстракции креатинфосфокиназы иэ образца с последующим электрофореткческим разделением экстракта, при этом экстракт наносят на ацетатцеллюлозный .носитель, предварительно насыщенный буфером с добавлением тиолредуцирующего агента, получ етую электрофорограмму инкубируют в среде, содержащей глицил-глици« новый буфер с РН 7,2, креатинфосфат, АДФ, АМФ, НАДФ, гексоккназу, глюкозу, глюкозо-б-фосфатдигидрогеназу, фенозинметасульфат, нитросиний тетраэолий, хло-. ристый магний с последующей денситометрией окрашенных участков форограммы, в качестве носителя используют пленку

"Владипор", в качвстве тиолредуцирующего агента — гаютатион, инкубируют в течение 6-14 мин, а компоненты инкубационной среды взяты в следующих количествах:

Крваткнфосфат, мМ 11,0-33,0

АДФ, мМ, 1,1-1 5

АМФ, мМ 11 0-13,0

НАДФ, мМ 0,37-0>82

Глюкоза, мМ 7,0-20,0

Гексокиназа, МЕ 5-7

Глюк оэо-6-фосфатдегидрогенаэа, ME 5-7

Ф енозинметасульфат, мМ

Пример 1. Применение предлагаемого способа для разделения иэофермен тов креатинфосфокиназы в сердечной мышо це.

Полоски ацетатцеллюлозной пленки

50 Владипор" М 5 на 10 мин замачивают в электродный тряс-вероналовый буфер, содержащий 10 мл глутатиона. Затем помещают в камеру для электрофореза, натягивают их, включают рабочее напряжение на 10 мин. Ток выключают и наносят

55 образец ткани - экстракт сердечной мышцы, электрофорез проводят при напряжении 200 В 70 мин. Затем полоски с образцом ткани вынимают кз камеры

5 957 l для эпектрофореэа и накладывают на них полоски ацетатцеллюлоэы, предварительно пропитанные инкубационной смесью.

Двойные полоски инкубируют в термостате прк 37оС 10 мин, затем осветляют вазелиновым маслом к денситометркруют.

Предлагаемый способ позволяет выделить иэ сердца 4 фракции изоферментов КК, ММ, МВ, ВВ и митохондриальную фракlO цию.

Пример 2. Разделение изоферментов креатинфосфокиназы в тканк мозга.

Полоски ацетатцеллюлоэной пленки

"Владипор" 34 5 на 10 мин замачивают

1% в электродный трис-вероналовый буфер, содержащий 10 мл глутаткона, затем помещают в камеру для электрофореза, натягивают их и на 10 мин включают рабочее напряжение. Затем ток выключают и наносят экстракт ткани мозга. Электрофореэ проводят при напряжении 130 В

70 мин. Потом полоски с образцом ткани вынимают из камеры для электрофореза и накладывают на них полоски ацетатцел- 23 люлозы, предварительно пропитанные инкубационной смесью, и инкубируют при

37оС 10 мин. Проявленные полоски осветляют ваэелиновым маслом и денсктометрируют. Получают 2 фракции изофер-ЗО ментов.КК, ВВ и митохондркальную, которые по данным литературы характерны для креатинфосфокиназы мозга.

Предлагаемый способ обеспечивает по сравнению с известным ускорение процес- 35 са, прк этом анализ занимает 90100 мкн, а в известном — 180 мин.

Предлагаемый способ обеспечивает сокращение времени идентификации изоферментов с использованием предпагае- щ мой инкубационной смеси с 2-х ч до

l0 мин по сравнению с известным.

Предлагаемый способ позволяет повысить разрешающую способность к выделить из ткани сердечной мышцы 4 изо-,ц фермента, тогда как по известному способу 3 изофермента.

Предлагаемый способ доступен за счет использования в качестве носителя ецетат--целлюлозной пленки "Владкпор"

М 4 и 5 и в качестве тиолредуцирующего агента электродного. буфера вместо

05 6 труднодоступного дитиотрейтола по известному способу

Предлагаемый способ не требует для приготовления инкубационной смеси больших количеств редких реактивов.

Формула изобретения

0,31-0,61

10,0-31,6

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Trainer Thomas О., Graenig David. Arapid method for the ana1ys s

of creatine phosphokinase isoenzymes":

С!in. Chim. acta, 1968, 21, и 1, р. 151-154.

Способ определения иэоферментов креатинфосфокиназы в тканях путем экстракции крватинфосфокиназы из образца с последующим электрофоретическим разделением экстракта, прк этом экстракт наносят на ацетатцеллюлоэный носитель, предварительно насыщенный буфером с добавлением тиолредуцирующего агента, полученную электрофорограмму кнкубируют в среде, содержащей глицил-глицкновыи буфер с рН 7,2, креатинфосфат, АДФ, АМФ, НАДФ, гексокиназу, глюкозу, глюко-зо-б-фосфатдкгидрогенаэу, фенозинмета» сульфат, нитросиний тетразоний, хлористый магний с последующей денситометрией окрашенных участков форограммы, о т л и ч а ю щ и и с s тем, что, с целью ускорения способа, в качестве носителя используют пленку "Владипор, в качестве тиолредуцирующего агента - глютатион, инкубируют в течение 6l4 мйн, а компоненты инкубационной среды взяты в следующих количествах:

Креатинфосфат, мМ 11,0-33,0

АДФ, мМ 1, 1-1,5

АМФ, мМ 1 1,0-13,0

НАДФ, мМ 0,37-0,82

Глюкоза, мМ 7-20

Гексоккнаэа, МЕ 5-7

Глюк оэо-6-фосфатдегидрогеназа, МЕ 5-7

Фенозинметасульфат, мМ 0,65-0,98

Нитросиний тетразолий.-; мМ

Хлористый магний, мМ

ВНИИПИ Заказ 6589/32 Тираж 887 Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 1