Способ определения активности лизосомальных ферментов

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛИЗОСОМАЛЬНЪК ФЕРМЕНТОВ путем лабилизации мембран лизосом с последующим определением ферментативной актйвйости,о т л и ч а ю щ и и тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве лабилизатора используют углеводород антраценового ряда, выбранный из группы: 1,2-бензпирен; 3,4-бензпирен; 9,10г . диметил ,2-бензатрацен; антрацен . в концентрации 20-200 мкг на 100 мкг белка лпзйс.ом. . .

. СОЮЗ СОВЕТСНИХ

ШИЦВ

РЕСПУЬЛИН (1Ю (и) А

ЗСЮ .СО! Й 33 48 .ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ с

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССОР

flO /АЛЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ H ОТКРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕЛ.ЛЬСТВУ (21) 3282287/28-13 (22) 21 04.81 (46) Î7.11.83. Вюл. В 41 (72) Т.К. Дарчия, М.А. Царцидзе, .М.Г. Гегечкори, И.И. Асатиани, М.И. Джалябова и В,А. Ломсадзе (71) Тбилисский ордена Трудового

Красного Знамени государственный университет (53) 616.07(088.8) (56) 1. Мещпер Д. Химические, реакции

s живой клетке. Биохимия, т 2. N.

1980.

2. Покровскйй А.А., Тутельян В,А..

Лизосомы. М., "Наука", 1976, с, 130133 (прототип), (54) (57) СПЖОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛИЗОСОИАЛЬНыХ ФЕРМЕНТОВ. путем лабилизации мембран лизосом с последуюшим определением ферментативной активйости, отличающийся тем, что, с целью повышения чувстви-:. тельности способа, в качестве лабилизатора используют углеводород ант" раценового ряда, выбранный из группы:

1,2-бензнирен; 3,4-бензпирен; 9,10". дйметил-1,2-бензатрацен; антрацен в концентрации 20-200 мкг на 100 мкг белка .лизосом.

Для этого к 1,5 мл субстрата- 3глицерофосфата, рН 4,9 приливают

0,5 мл I мл сахарозы и помещают,на

l5 мин в водяную баню при 31 С, пос-.. ле чего добавляют 0,2 мл гомогената и инкубйруют 10 мин на водяной бане. Затем инкубационную смесь ох лаждают и реакцию останавливают добавлением 2 мл холодной !О -ной три- . хлоруксусной кислоты, смесь цент" рифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

К 2 мл надосадочной жидкости добав- ляют 0,5 мл молибдата аммония и

1 мл 1Х аскорбиновой кислоты. Через

5 мнн определяют оптическую плотность на ФЭК-е при длине волны

635 нм.

По увеличению активности кислой фосфотазы судят о степени лабилизации мембраны.

Hp и и .е р 1. Лизосомы печени крыс инкубируют с 1,2-бензопнренрм н с известным лабилиэатором витаьяном А. В каждой отдельной пробе концентрации 1,2-бензопирена составляла 20, 100, 200, 300, 400, 500, 550 мгк/100 мкг белка лизосом, а концентрация витамина А - 100, 200, 300, 400, 500 и 600 мкг/ 100 мкг . белка лизосом. Условия инкубации и определенйе активности кислой фосфатазы (степени лабилизации мембраны приведены выше), Результаты типичных измерений представлены в табл. 1.

Пример 2. Лиэ осомы печ еии крыс инкубируют с 1,2-бензпиреном, 3,4-.бенэапиреном, .9,!О-диметил- 1,2бензантраценом, антраценом и вита-. мином А в концентрации 150 мкг лабилизирующего агента на 100 мкг бел" ка.

Результаты приведены в табл. 2 (условия инкубации и измерения ана- . логичны примеру 1)., Полициклические углеводороды антраценового ряда вызывают лабилизацию мембран лизосом в 2-3 раза более интенсивную, чем известные природные лабилизаторы и могут быТь использованы в самых разнообразных биохимических и медицинских экспериментах, связанных с лабилизацией биомембран . для определения активности лизосо мальных Ферментов.

Ъ

Ф 1053004

Изобретение относится к фармако- логии и может быть использовано в биохимии, биофизике и онкологии при определении ферментативной активности ферментов, локализованных s мембранах лиэосом.

° Известен способ определения ферментативной активности мембранных ферментов" путем обработки мембранной фракции детергентами, поверхностно- 10 активныье веществами fl) .

Однако поверхностно-активные вещества существенно нарушают нативные свойства изучаемых ферментов, а также затрудняют определение фермента- . 15

"тивной активности.

Известен способ определения ферментативной активности лизосомольных. ферментов путем лабилизации мембран лизосом витамином А j2) . 20

Однако данное соединение вызывает лишь незначительную лабилизацию мембраны, причем активные концентрации лабилизатора должны значительно превышать концентрации измеряемых ферментов.

Необходимость высоких концентраций лабилизатора снижает чувстви тельность известного способа.

Цель изобретения — повышение чув-. ствительности способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения активности лизосомальных ферментов путем лабилизации мембран лаосом с последующим определением фермен- . М тативной активности, в качестве лаI билизатора используют углеводород антраценового ряда, выбранНый из группы: 1,2- бензпирен; 3,4-бензпирен; 9,10-диметил-?,2-бензатрацен; антрацен в концентрации 20-200 мкг ,на 100 мкг белка лизосом.

Способ осуществляют следующим

;образом.

К суспензии лизосом, выделенных

/ из печени крыс (1 мл суспензии.лизо-.. сом в 0,25 м сахароза) добавляется

0,1 мл полициклияеского углеводорода, растворенного в этиловом спирте {конечная концентрация от 20 до Ю

200 икг на 100 мкг белка лизосом).

Смесь инкубируется при кометной температуре 30 мин. Затем в суспензии лиэосом определяют активность,,кислой фосфотазы.

Таблиц а 1053004;

Активность фермента, Концентрация

1,2-бензпирена, мкг

Концентрация Активность витамина А; фермента мкг

Контроль

0,024-

Контроль

0,024

0,044!

0,058

100

0,028

200.

0,03б

01049

0,042

300

0,040

0,035

0,050

0,028

500

0,058

550

0,025

0,065 Т а бЬ и ц.а 2

Активность фермента (фосфор мкмоль/мин/мг белка) Вещество

Исходные мембраны

Витамин А

0,024

0,031

l,2-Вензпирен

0,054

0,072

3,4-Бензпирен

9,10-Диметнл-1,2-бензантрацен

0,092

0,08б

Антрацен

1 ..Составитель С. Котелевцев

Редактор Я, Ковалева Тех11ащ :П.ЗЬкеы .. Корректор О. Тигор

Заказ 8863742 Тираж 873 . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений:и открытий

113035 Москва Ж- Ра аская каб, Б, 4/5

Филиал ППП патент, г; .Уигород, ул. Проектная, 4