Способ определения цитотоксического эффекта лимфоцитов крови

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ;Путем добавления лимфоцитов к клеткaмшшeням с последующим определением цитотоксического действия .по индексу лизиса клеток-мишеней,о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с це-. лью упрощения иповЕЛоения чувствие тельности способа, в качестве клеток-мишеней используют аутоэритроциты больного, причем учет реакции осуществляют в. капиллярах, а индекс лизиса определяют по отношению высоты столбиков сенсибилизированных эритроцитов к высоте столбиков конт- . рольных эритроцитов.

(19) 01) СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

М5В .А 61 В 10/00:

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н aBTOPCKOMV СаиДЕтВЪСтвм

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ И306РЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

r (21) 3345340/28-13 (22) 25. 06. 81 (46) 30.11.83. Бюл. Р 44

-(72) С.М.Лихолетов, A.С.Борзенко, Н.Г.Бакулина и С.И.Жукова (71) Волгоградский государственный медицинский институт и Волгоградский научна-исследовательский противочумный институт (53) 615 ° 375(088.8) (56) 1. Новиков Ю.К. и Новикова В.И.

Клеточные методы иммунодиагностики.

Минск, 1979, с. 92-105.

2. Морозова В.Л., Цацкина Э.С.

Модель цитотоксического эффекта для выявления гиперчувствительности замедленного типа. — "Лабораторное дело", 1980, 9 9, с. 543-547. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ

:путем добавления лимфоцитов к клеткам-мишеням с носледуюшим определением цитотоксического действия .по индексу лизиса клеток-мишеней,о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с це-. лью упрошения и повышения чувстви тельности способа, в качестве кле ток-мишеней используют аутоэритроциты больного, причем учет реакции осуществляют в, капиллярах, а индекс лизиса определяют по отношению высоты столбиков сенсибилизированных эритроцитов к высоте столбиков конт-, рольных эритроцитов. С3

1057017 ггзобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в различных областях клиническои и экспериментальной медицины для диагностики инфекционной, лекарственной и других форм ал5 лергии.

Пзвестен способ определения цитотоксического эффекта лиглфоцитов крови для выявления. состояния иммунного ответа организма путем взаимодействия Т-лимфоцитов с клеткамимишенями. В качестве последних применяют монослой.опухолевых клеток фибробласты, эритроциты цыплят или голубей. Пля учета повреждений кле-.. 15 ток-мишеней используют подсчет клеток. в гемоцитометре (1 J.

Однако данный способ сложен в исполнении, поскольку требует специальной подготовки клеток-мишеней и Zg большого количества лимфоцитов.

Наиболее близок к предлагаемому способ определения цитотоксического эффекта лимфоцитов крови путем добавления лимфоцитов к клеткам-мишеням с последующим определением цитотоксического действия по индексу лизиса клеток-мишеней. Причегл в качестве клеток-мишеней используют

Ф Р эритроциты барана, нагруженные ан- 3О тигеном, а учет реакции осуществляют на фотоэлектрокалориметре и рас-. чет индекса лизиса ведут по формуле а-б, где а и Š— оптические плотнос3 ти проб с сенсибилизированными анти- 35 генами-эритроцитами и контрольными эритроцитами Г2 3.

Однако известный способ недостаточно чувствителен, поскольку диапазон измерения степени лизиса эритро- 40 цитов на фотоэлектрокалориметре ограничен за счет оптических свойств кювет и прибора. В 103 случаев может давать неспецифические реакции. Кроме того, он сложен в исполнении, так 45 как эритроциты барана требуют специ- альной обработки и специального консерванта.

Цель изобретения - упрощение и повышение чувствительности способа. .Укаэанная цель достигается тем, .что согласно способу определения цитотоксического эффекта лимфоцитов .крови путем добавления лимфоцитов к клеткам-мишеням с последующим определением цитотоксического действия по 55 индексу лизиса клеток-мишеней в качестве клеток-мишеней используют аутоэритроциты.больного, причем учет реакции осуществляют в капиллярах, а индекс лизиса определяют по отно- Я) шению высоты столбиков сенсибилизированных эритроцитов к высоте стол-. биков контрольных эритроцитов.

Способ осуществляют следующигл образогл. 65

Получают 5-10 мл крови больного, отстаивают ее 30-40 глин при 37 С, отделяют верхний слой плазмы вместе с лейкоцитами, отмывают центрифугированием лейкоциты от плазмы, центрифугируют оставшуюся после отделения лейкоцитов кровь для получения осадка эритроцитов, отмывают их от следов плазмы, приготавливают 10%-ную взвесь эритроцитов,, соединяют их с исследуемым антигеном, инкубируют

1 ч при 37ОС, отмывают эритроциты центрифугированием от несвязавшегося антигена, соединяют взвесь сенсибилизированных эритроцитов с лейкоцитами и инкубируют 18-24 ч.при 37 С.

Учет степени лизиса эритроцитов осуществляют путем заполнения взвесью капилляров, запаивания их с одного конца, центрифугирования для получения осадков эритроцитов, измерения их высоты в миллиметрах и вычисления индекса лизиса эритроцитов по формуA ле вЂ, где A и Б — средняя высота столбиков сенсибилизированных и контрольных эритроцитов соответственно.

Следует отметить, что реакцию эритроцитов с лейкоцитами ставят в соотношении 8/1-10/1 соответственно и осуществляют в среде с 10-20% аутосыворотки. Выяснена также способность аутоэритроцитов адсорбировать на себя антигены при инкубации in vitro.

Указанное выше соотношение является оптимальным для учета степени лизиса эритроцитов в капиллярах и получения столбиков эритроцитов высотой

0,5-3,0 мм. При других соотношениях эритроцитов и лейкоцитов столбик эритроцитов или совсем отсутствует, или получается столь незначительным, что его невозможно измерить в капиллярах. Кроме того, выявлена возможность использования аутосыворотки (10-203) в инкубационной среде взамен сыворотки крупного рогатого скота. Указанный процент сыворотки в среде является существенным моментогл, так как при большей ее концентрации проявляется действие антител на ход реакции.

Способ испытан на модели туберкулезной инфекции. .Из вены больного туберкулезом берут 5-10 мл крови с гепарином

25 ед/мл, отстаивают 30-40 мин при 37оС, отделяют верхний слой плазмы с лейкоцитагли, центрифугируют при 1000 аб/мин 10 мин, плазму отделяют центрифугированием и используют в дальнейшем для приготовления среды 199 с 20% аутосыворотки. При наличии примеси эритроцитов в осадке лейкоцитов их лизируют следующим образом: к осадку клеток добавляют

5 мл 0,35л-ной NaC1, осторожно пере1057017 при 1000 об/мин. К осадкам эритроцитов добавляют по 0,2 мл среды 199 с

20% аутосыворотки н затем по 0,2 мл взвеси лейкоцитов. Пробирки встряхивают и инкубируют 18-24 ч прн 37ОC.

Учет степени лизиса эритроцитов ™роводят следующим образом из каждой пробирки набирают микропипеткой по

10 мкл клеточной смеси в стеклянные капилляры длиной 40 мм и внутренним диаметром О, 7-0,9 мм. Диаметр капилляров предварительно стаидартиэируют для данного опыта с помощью иглы для пбдкожных инъекций. Один .конец капилляра эапаивают пластилином, центрифугируют,при 1000 об/мин 5 мин, монтируют их по 5 штук на предметном стекле лейкопластырем и затем измеряют в миллиметрах высоту столбика эритроцитов с помощью окулярной лупы 10 . Степень цитотоксического эффекта лейкоцитов по отношению к сенсибилизированным зритроцитам больного определяют по выаеприведенной формуле.

В табл.1 приведены результаты определения сенсибилизации к туберкулину с помощью атотоксической реакции по предлагаемому способу.

Таблица 1

39

Высота столбиков эритроцитов, мм мешивают пипеткой 30 с, добавляют

0,6 мл 5%-ного раствора NaCl, центрифугируют при 1000 об/мин 10 мин, а затем отмывают осадок два раза средой 199. Отмытые лейкоциты суспендируют в 0,8 мл среды 199 с 20% ауто5 сыворотки и хранят на холоде (при плюс 4ОС) до использования в реакции.

Для приготовления сенсибилизированных к антигену аутоэритроцитов кровь пос- о ле отделения слоя лейкоцитов центрыфугируют при 1000 об/мин 10 мин, осадок эритроцитов отмывают два раза

0,9%-ным раствором NaCl по 5 мл. Готовят 1ОВ-ную взвесь эритроцитов,разливают по 0,2 мл s четыре полистироловые микропробирки (Эппендорфа или другого типа), добавляют антигены Во

0,1 мл в первые три пробирки, а в четвертую - 0,9В-ayio NaCl (контроль).

В качестве антигенов используют ту- Я беркулин (в ампулу с сухим антигеном добавляют 1 мл 0,9%-ной NaC1 и затем разводят в соотношении 1г10 0 9%-ным раствором ЫаС1), кокцидиоидин и гистоплазмин (100 мкг/мл). Инкубируют 25 эритроциты с антигеном в течение 1 ч при 37 С затем отмывают два раза

0,9%-ной ИаС1 путем центрифувирования

Диагноз ндекс лизиса эритроцитов несенсмбилизированн к туберкулину сенсибилизированных к туберкулину

2,5 1с

2,6

1,3

2,6

2,6.

1,2. 1,2

2,8

Активный 1,1 туберкулез легких

2,5

1,2 .

Среднее 2,6

Среднее 1,2

Здоровый донор

2,4

«2s,3 7 1 03

2,30

2,2

2,3

2,2 2,4

2,2

2,2 2,6

2,4

Среднее 2,30

Среднее 2,37

Иэ таблицы видно, что в случае положительной цитотоксической реакции высота столбиков сенсибилиэированных аутоэритроцитов в капиллярах составляет в среднем 1,2 ьм, несенсибилизированных - 2,6 а индекс лизиса эритроцитов - 0,52.

Для проверки специфичности цитотоксической реакции применяют также тест-блокады цитотоксического действия лимфоцитов. Для этого-выделенные иэ крови больного с активным туберкулезом лейкоциты инкубируют .с антигеном (к 10 6 клеток добавляют

100 мкг туберкулина) a течение 18 ч при 37ОС, отмывают от несвяэавшего° ся антигена центрифугированием,соединяют с аутоэритроцитами больного, Ю сенсибилизированными туберкулином, и определяют индекс иэ лизиса по предлагаемому способу.

В табл.2 приведены результаты определения блакады цитотоксического 5 действия лейкоцитов на клетки-мишени. 1057017

Таблица 2

Лейкоциты от больного туберкулезом в активной форме

Высота столбиков эритроцитов, MM

Индекс лизиса эритроцитов несенсибилиэированных к туберкулину сенсибилиэированных к туберкулину

До инкуба.ции с туберкулином 1,1

0,9

2,0

2,3

2,1

2,0

Среднее 2,1

1,0

2,4

0,9

0,43

Среднее 0,9

После инкубации с туберкулином 1,9

2,0

1,8

2,1

2,2

2,2

2,0

2,2

1,9

2,1

0,87

Среднее 1,9

Среднее 2,18

Таблица 3

Диагноз

Цитотоксический эффект лимфоцитов в способе

Количество обследованных лиц предлагаемом известном

Туберкулин

Гистоплаэмин

Туберкулин

Кокцидиоидин

Кокси- Гистодиои- плаздин мин

0 0 13

14 2

Активный туберкулез

Неактивный туберкулез

Здоровые доноры

0 0

tl р и м е ч а н и е. 4 - число лиц с положительной реакцией.

Из таблицы следует, что после инкубации лейкоцитов больного с туберкулином происходит блокада цитотоксического действия лимфоцитов на клетки-мишени.

Таким образом, цитотоксическое действие лимфоцитов больных туберкулезом на аутоэритроциты, нагруженные туберкулином, имеет иммунологическую природу и обусловлено сенсибилизацией лимфоцитов к антигенам возбудителя туберкулеза.

Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет достичь большей чувствительности определения

I у сенсибилиэации: в 10% случаев дает возможность дополнительного обнаружения лиц с сенсибилизацией к туберкулину в группе с активным туберкулезом, в 15% - в группе больных с

35р неактивным туберкулезом и в 5% — среди здоровых лиц. Это позволяет применять предлагаемый способ для оценки степени извлеченности больных от инфекции.

В табл.3 приведены результаты выявления цитотоксического эффекта лимфоцитов крови у больных туберкулезом по сравнению со здоровыми донорами.

1057017

Составитель Г.Крюкова

Редактор Т.Иермелштейн Техред H.дсталош Корректор A.Тяско.Заказ 9415/5 Тираж 713 Подписное

ВНИИБИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðîä, ул.Проектная, 4

Как следует из таблицы, предлагаемый способ позволяет выявить сенсибилизацию к туберкулину у двух больных с неактивным туберкулезом и у одного здорового донора. При клинико-рентгенологическом обследовании у них подтвердилось наличие активации туберкулезного процесса.

Исследование цитотоксического эффекта лимфоцитов с гетерологичными аллергенами кокцидиоидином и гистоплазмином показало специфичность предлагаемого способа (отсутствие реакции у всех обследованных), в то время как известный способ вызывал иногда появление неспецифических реакций с указанными аллергенами, сенсибилизация к которым у больных и здоровых лиц отсутствует.

Таким образом, предлагаемый способ обладает большей чувствительностью определения сенсибилизации организма и позволяет точнее осуществлять

° диагностику, например туберкулеза. о .Кроме того, способ прост и достоверен, так как не требует специальных приборов, реагентов и позволяет одновременно проводить пять и более повторностей.