Способ получения эндо- @ -1,3- и эндо- @ -1,6-глюканаз

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДО-/31 ,3- И ЭНДО- -1,6-ГЛЮКАНАЗ, включающий гомогенизацию исходного съфья в буферном растворе, центрифугирование с последующим хроматографическим разделением ферментов, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, гомогенизации подвергают кристаллические стебельки промыслового моллюска Patinopecten yessoensis, а хроматографическое разделение ферментов проводят на карбоксиметилцеллюлозе с элюцией линейным градиентом NaCI от О до 1М в буферном растворе. СП с о со О5 4 Ы ранцич

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3(5В С 12 М 9/42

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К AGTOPCHQMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Об

1 Ы

00. дб

Ъ М »

0.2

7И

)М ррсцщии

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3581649/28-13 (22) 26.01.83 (46) 15.06.84. Вюл. В 22 (72) E.Â. Сундукова и Л.А. Елякова (71) Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного научного центра AH СССР (53) 577 ° 15(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

У 574469, кл. С 12 N 9/42, 1976.

2. Fleet G.Í., Phaff Н.J. Lysis

of yeast се11 walls. Glucanases from

Bacillus circulans NI.-12. — ф . Bacter 1974, v. 119, р. 207-219.

„„ЯЦ„„1097674 А (54) (57) СНОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДО-Р1,3- И ЭНДО-/Ь-1,6-ГЛЮКАНАЗ, включающий гомогенизацию исходного сырья в буферном растворе, центрифугирование с последующим хроматографическим разделением ферментов, о т л и ч а ю— .шийся тем, что, с целью упрощения процесса, гомогенизации подвергают кристаллические стебельки промыслового моллюска Patinopecten уеавоепа1s, а хроматографическое разделение ферментов проводят на карбоксиметилцеллюлозе с элюцией линейным градиентом

NaC1 от 0 до 1И в буферном растворе.

1097674

Изобретение относится к способу выделения ферментов, а именно к способу одновременного получения Р -1,3" н

8-1,6-эндоглюканаз, которые могут использоваться в качестве биохимических 5 реактивов (для установления структуры углеводсодержащих биополимеров), в медицинской практике (для разрушения клеточных стенок-патогенных микроорганизмов), в промышленности (для

t0 получения глюкозы из водорослей или их отходов).

Известен способ выделения эндо-р1,3-гл|оканазы из кристаллических стебельков моллюска Chlamys ablidis включающий стадию хроматографии на акрилексе П-30 (1 ).

Однако с помощью этого способа может быть выделена только эндо-р1,3-глюканаза, а не обе глюканазы.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ получения эндо-р-1,3-и эндо-ф-1,6-глюканаз, вкл|очающий гомогенизацию исход25 ного сырья в буферном растворе, центрифугирование и хроматографическое разделение двух ферментов на сефадексе < =100 L2 3.

Способ заключается в выделении двух глюкачаз из Bacillus cixculaus

WL-12. При этом р-1,3- и р -1,6-глюканазные активности полностью разделяются. Элюаты двух хроматографических разделений объединяют и получают

8-1,3-глюканазу (выход) 43Х с очисткой в 3 раза и р -1,6-глюканазу с очисткой в 29 раз (выход 807).

Однако известный способ является многостадийным, так как требует вы- 40 ращивания культуры-продуцента и последующей обработки сырья в течение длительного времени. Продолжительность всего процесса составляет около

8 сут. 45

Кроме того,для выделения ферментов требуется большое количество различных реактивов.

Целью изобретения является упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения эндоР-1,3- и энда-р-1,6-глюканаз, включающему гомогенизацню исходного сырья в буферном растворе, центрифугирование с последующим хроматографическим разпелением ферментов, гомогенизации подвергают кристаллические стебельки промыслового моллюска Patinopecten

yessoensis, а хроматографическое разделение ферментов проводят на карбоксиметилцеллюлозе с элюцией линейным градиентом NaC1 от 0 до 1М в буферном растворе.

Способ выделения эндо-р-1,3-и эндо-8- t,á-глюканаз заключается в том, что кристаллические стебельки моллюсков гомогенизируют с 0,05 M ацетатным буфером (рН-5,2), центрифугируют и полученный супернатант подвергают ионообменной хроматографии на колонке с карбоксиметилцеллюлозой.

На чертеже представлен профиль элюции глюканазных активностей с колонки КМ-целлюлозы.

На чертеже приняты следующие обозначения: 1 — белок, 2 -с(-1,4-;

3 — p --1,6-, 4 — p -1,3-глюканазные активности; 5 — линейный градиент

NaC1; фракции 90-110 — препарат эндо-р-1,6-глюканазы; фракции 160220 - препарат эндо-р -1,3-глюканазы.

Поглощение при 280 нм регистрируют постоянно с помощью Увикорда-П (фирма ЛКБ, Швеция). Активность глюканаз оценивают методом НельсонаСомоджи по нарастанию восстанавливающей способности с применением в качестве субстратов ламинарина (p1,3-глюкан), пустулана (p- 1,6-глюкан), амилопектина (г -1,4-глюкан) и растворимой KM-целлюлозы (p-1,4 глюкан).

Использование кристаллических стебельков промыслового моллюска— морского гребешка Patinopecten yessoenз1з позволяет упростить процедуру получения глюканаз, а также утилизировать отходы, образующиеся при разделке моллюсков.

Пример. 20 г кристаллических стебельков морского гребешка гомогенизируют на мешалке 4 ч со

100 мл 0,05 М ацетатного буфера (рН 5,2). Получвнный вязкий раствор центрифугируют 15 мин при 10000 х g, осадок отбрасывают, а супернатант (120 мл) наносят на колонку с карбоксиметилцеллюлозой (2,6 х 15 см), предварительно уравновешенную указанным буфером. Несорбированный белок отмывают тем же. буфером, а глюканазные активности элюируют линейно возрастающей концентрацией хлористого натрия (от 0 до 1М) в 1 л буфера.

1097674

Составитель В. Муронец

Редактор Л. Веселовская Техред Ж.Кастелевич, Корректор. А. Тяско

Тирах 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 4152/24

Филиал ППП "Патент", г. Уагород, ул. Проектная, 4

В ходе ионообменной хроматографии происходит разделение эндо-ф-1,3- и эндо-р-1,6-глюканазных активностей.

Получают 29,8 мг эндо-р-1,3-глюканазы с выходом 49Х н очисткой в 44 раза, и 29,7 мг эндо-(3-1,6-глюканазы с выходом по активности 22Х и очисткой в 19 раз. Препарат эндо-р-1,3глюканазы не содержит других глюканазных активностей, а препарат эндо- 10 -1,6-глюканазы не содержит р -1,4глюканазную активность, но имеет примесь р-1,3-глюканазы (18X) и с(1,4-глюканазы (13X), которые могут быть в случае необходимости отделе- 15 ны гель-хроматографией, Предлагаемый способ по сравнению с известным имеет следующие преимущества.

Время выделения ферментов составляет менее двух суток, а число стадий уменьшено до трех. Использование на последней стадии выделения ферментов ионообменной хроМатографии (вместо гель-фильтрации) позволяет обрабатывать весь материал сразу, без деления на порции, что существенно упрощает технологический процесс.

При получении зндо-р-1,3-глюканазы предлагаемым способом степень очистки увеличивается в 14 раз.