Способ получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы @ @ @

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ВНЕ1ШЕТОЧНОЙ РИБОНУКПЕАЗЫ BACILLUS INTEIttffiDIUS 7P, предусматривающий культивйрование продуцента на среде, содержащей пептон, глюкозу и минеральные соли,, о т л и чаю щи йс я тем, что, с целью увеличения активности фермента, в культуральную жидкость вносят дактиномицин в количестве 0,075-0,125 мкг/мл через 67 ,5 ч от начала культивирования в фазе замедления роста микробной популяции .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

ОВН ЛЮ

РЕСПУБЛИК

4(51) С 12 N 9/22

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPbfAO

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СЮЩЕТЕЛЬСТВУ (21) 3593685/28-13 (22) 18.05.83 (46) 07.02.85. Бюл. и 5 (72) Л.В. Знаменская, E.P. Ромахина, Г.И. Клейнер и И.Б. Лещинская (71) Казанский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. В.И.УльяноваЛенина (53) 577. 15(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

Ф 587156, кл. С 12 N 9/22, 1976.

2. Авторское- свидетельство СССР

N 1010125, кл. С 12 Ч 9/22; 1983.

3. Иау ВЛ., Walsh R;I . Klliott,M.Í.

Smeaton J.R. Mechanism of paradoxycal

stimulalion of kibonuclease synthesis

Bacillus subtilis Biochemel. Biophys

Acta, 1968, v. 169, р. 260.

SU 113 411 . А (54)(57) СНОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ

ВНЕКЛЕТОЧИОИ РИБОНУКЛЕАЗЫ BACELLUS

ENTEFJEIHUS 7Р, предусматривающий культивирование нродуцента на среде, содержащей лентон, глюкозу и минеральные соли,.о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения активности фермента, в культуральную жидкость вносят дактийомицин в количестве 0,075-0, 125 мкг/мл через 67,5 ч от начала культивирования в фазе замедления роста микробной популяции.

1138411

Изобретение относится к ферментной промышленности и касается получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы.

Известен способ получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы, предусматривающий культивирование штаммапродуцента Bacillus intermedius 7p 1.1g.

Известен способ получения щелочной внеклеточной. рибонуклеазы из культуральной жидкости Bacillus interme - 10

dius 7p в присутствии стимуляторов роста бактерий-дрожжевого экстракта или кислотного экстракта витамина В„, кормового (2).

Однако известные способы характе- 15 ризуются невысоким .выходом фермента, при этом активность рибонуклеазы в культуральной жидкости за счет. увеличения урожая клеток повышается всего на 33-44Х и достигает 5,0х104 20 условных единиц.

Наиболее близким к изобретению техническим решением является способ получения щелочной внеклеточной рибо нуклеазы Bacillus intermedius 7р пу- >5 тем культивирования продуцента на пительной среде, содержащей пелтон,глюкозу и минеральные соли, стимуляции актиномицином Д синтеза внеклеточной рибонуклеазы Bacillus subtilis(З зО

Однако известный способ связан лишь со снятием репрессирующего действия фосфора на синтез рибонуклеазы. В среде без фосфатов стимуляция синтеза фермента не наблюдается. З5

Цель изобретения — увеличение активности фермента в культуральной жидкости, Поставленная цель достигается тем, что спгласно способу получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы

Bacillus intermedius 7p, предусматривающему культивирование продуцента на питательной среде, содержащей пептон, глюкозу и минеральный соли, в культуральную жидкость вносят дактино- мицин в количестве 0,075-0,125 мкг/мл через 6-7 ч от начала культивирования в фазе замедления роста микробной популяции. 50

Сущность изобретения состоит в том, что активный синтез щелочной внеклеточной рибонуклеазы Bacillus intermedius Jp начинается по окончании экспериментального роста культуры, 55 т.е. в начальной стадии фазы замедле. ния роста, а внесение дактиномицина именно в этот период будет существенно стимулировать синтез фермента. Фаза замедления роста характеризуется падением удельной скорости роста при продолжающемся увеличении биомассы культуры (исследовано влияние внесения дактиномицина в дозах от 0,025 до 0,15 мкг/мл на 4,6 и 8 ч культивирования: 4-й час культивирования соответствует станции экспоненциального роста культуры, 6-й и 8-й часыфазе замедления роста).

Влияние концентрации дактиномицина и времени его внесения на биосинтез РНКазы Bacillus intermedius 7р приведено в табл. 1, Как видно из табл. 1, наибольший стимулирующий эффект для всех доз дактиномицина наблюдается при внесении его на шестой час культивирования.

Максимальная стимуляция наблюдается при внесении 0,1 мкг/мл дактиномицина на 6-й час культивирования. При уменьшении и увеличении дозы антибиотика, а также при внесении его на более ранние или более поздние сроки стимулирующий эффект снижается.

На чертеже представлен график показателей роста и накопления рибонуклеазной активности на контрольной среде а

На графике обозначено биомасса— .1, активность рибонуклеазы в культуральной жидкости 2, удельная скорость роста бактерий 3, удельная скорость накопления фермента 4.

На чертеже приведены показатели роста Bacillus intermedius 7p и накопления рибонуклеазной активности в культуральной жидкости на контрольной среде (не содержащей дактиномицина), а также кривые удельной скорости роста культуры (р.) и удельной скорости накопления фермента

Для уточнения координат оптимальной (наиболее эффективной) зоны действия дактиномицина (т.е. концентрации и времени внесения антибиотика) были поставлены эксперименты по полному факторному плану ПФЭ 3 с цент2 ром в точке с наилучшим выходом

РНКазы (0,1 мкг/мп дактиномицина, время внесения — 6-й час культивирования) с суженными по сравнению с предыдущими экспериментами интервалами как по времени внесения, так и по концентрации. Эти результаты представлены в табл. 2. На основании

1138411 только экспериментальных данных и результатов обсчета таблиц можно утверждать, что внесение дактиномицина в дозах от 0,075 до

0,125 мкг/мл в интервале от 6 до

7,5 ч позволяет получить РНКазную активность в культуральной жидкости не менее 200Х от контроля.

Пример 1. Среду, содержащую, г/л: пелтон 20,0; глюкоза 10,0, СаС1. 1р

О, 1 МКБО+ 7Н20 0.3; NaC1 3,03 МП804

0,1 рН перед стерилизацией 8,3-8,4, засевают 1Х 24-х часового инокулята, полученного при выращивании Bacillus

intermedius Jp на среде того же состава. По мере культивирования определяют урожай клеток и активность рибонуклеазы в среде. По этим данным рассчитывают удельную скорость роста (р.) и удельную скорость накопления рибонуклеазы (E ). По достижении стадии замедленного роста (6 ч) вносят дактиномицин в количестве

0,075 мкг/мл.

Пример 2. Культивирование 25 введут аналогично примеру 1, но дактииомиции вносят в концентрации

0,1 мкг/мл.

Пример 3. Культивирование ведут аналогично примеру 1, но дактино- p мицин вносят в количестве О, 125 мкг/мл.

Пример 4. Культивирование ведут аналогично примеру 1, но дактиномицин в количестве 0,1мкг/мл вносят не на 6-й, а на 4,5-й ч культивирования.

Пример 5. Культивирование ведут аналогично примеру 1, но дактиномицин в количестве 0,1 мкг/мп вносят на 7,5 ч культивирования. 4р

В табл. 2 представлены значения рибонуклеазной активности при введении дактиномицина в культуральную жидкость в разное время.

Как видно из данных табл. 2, оптимальным сроком внесения всех доэ дактнномицина является 6-й час культивирования. Иаксимальная активность достигается при внесении дактиномицина в количестве О, 1 мкг/мп.

Оптимальное время внесения дактиномицина (6-й час культивирования) характеризуется замедлением удельной скорости роста культуры (т.е. начинается стадия замедления роста) и возрастанием удельной скорости синтеза рибонуклеазы. Внесение дактиномицина в более ранний срок не приводит к стимуляции синтеза рибонуклеазы, а в более поздний приводит к меньшей стимуляции синтеза фермента. Рост культуры дактиномицином подавляется. Ингибиторный эффект увеличивается с увеличением дозы антибиотика и уменьшением срока культивации бактерий.

Таким образом, можно утверждать (с надежностью 95X), что уровень активности более ЗООХ от контроля до стигается при внесении дактиномицина в дозе 0,1 мкг/мл в интервале времени культивирования 5,5-7 ч, более 250Х вЂ” в дозах 0,075-0,125мкг/мл от 5 ч. 40 мин до 6 ч 40 мин, более

200Х вЂ” в тех же дозах от 5 ч 15 мин до 7. ч 10 мин, т.е. внесение дактиномицина на 4,5 ч культивирования во время экспоненциального роста культуры, не вызывает заметной стимуляции активности, а даже снижает ее при внесении дактиномицина в дозе О, 1О, 125 мкг/мл. Внесение дактиномицина в дозе О, 1-0, 125 мкг/мл в начале стадии замедления роста (между 6 и

7,5 ч культивирования), т.е. до достижения максимального значения удельной скорости синтеза фермента, приводит к стимуляции синтеза РНКазы не менее, чем в два раза.

ll3841l

100

1,2

7,9

135

0,025

11,8

167

3,9

115

188

10,1

О, 050

9,6

218

10,6

171

0,2

О, 100

3,4

360

4,3

220

0,3

О, 150

3,3

190

2,7

160

Доза дактиномицина, мкг/мл

Время внесения, ч

РНКазная активность, 24-часового культи; вирования 9, %

Таблица 1

Стандартное

5 ï, Х

2238422

СС 1 1

Х Э C 1

Х E" Рч 1

Э Х 1

Р О ° 1

М Ф 1 х с 1, а

1 1

1 — — 3 сп

V O СЧ СЧ

С1 iО CV . CrI С i СЧ

Э о н

Ф

Э

Фй Ч CV х «

r r

Х Рч л сЧ

CV

С4

@г

С ) «г

Д.

1 л 4 сч

Х а л л

CO о

СЧ

1ÐÐE

1

1 Э

1 Х

1 1 )

1

1 а — 3

СЧ ц:> т Cv) и

СЧ и о

СЧ л 1

Щ

Н с 1 и . СЧ ! а о о сч о а а

» О С 1

СЧ

1 . 1

СЧ

Со О

СО с"1

СЧ

Ю

I . 1

СЧ О1

О сч О

\!

CV (r

l о л а

+4 WI

СЧ

СЧ

1

17(f)

+I

I 1)

I I

1- — 3

«h

СЧ

+I

О ь

Ю

o o о о о о

Ю

° К) о о о с о о со

СО

СЧ

o o о,.о

o o

СЧ

О

О

О

СЧ

С

О

О

О сЧ 1

1 о о о +

I 1

Г 3

I °

I м и л л л л о о с л л A л л л

О О О О О О л

1 Е

1О

Ф о

С4 о

1 т

1 М

О + 1 О О О + о л

О Л

1 0

I cd

I, CCl

v e - e. e

A н о о х х

E х

«4

I

1 1

1 Э

I 2 х

I Х Pl

I Э с6

I л

I ц о

1 Э cd

C °

1 l)о Р

»1

1 1 Р I а х х

I CO OI I

СЧ л

Р ) «О а

+I «О.

o. + о л

СЧ (Х) сО л

Ol л ,О л

М +I

О . О

1О б

С ) СЧ а оо

СЧ л а и со

СЧ +I

+I 01

Я т О 1 О Crl CV

O о о о о

СЧ о

С

1 а л а

СЧ СЧ СЧ

Ф ° » 1 а л л о о о

1

1 / л ) I

1

1 оО

I>- 1

СЧ

СЧ C о

С»

1

1

I

1

1

1

СЧ

С к и

1 1 1

А !

A 1 н

Х 1 о

))384)) Составитель Ф.Кононков

Техред М.Надь Корректор А. Обручар

Редактор И. Дербак

Заказ 10634/18 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4