Способ получения аденозин-5 -трифосфата

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИН-5 -ТРИФОСФАТА, предусматривающий культивирование продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей субстрат и неоргани1|еский фосфат, представленный ()р.Ю, К,НЮ, и , накопление целевого продукта и его выделение , отличающийся тем, что, с целью снижения себестоимости целевого продукта , в качестве продуцирующего микроорганизма используют метанолусваивающие штаммы Protaminobacter methanol АТСС 2 1275, Corynobacterium sp. 21232 ,Bacillus cerus ATCC 14579, Methylomonas probus FERM-P-3139, Methylomonas methylovora ATCC 21369, Pseudomonas methanolira ATCC 21704. Pseudofrranas insueta ATCC 21276, Pseudomonas methanica ATCC 21439 или Protaminobacter ruber ATCC 8457, питательная среда содержит в качестве субстрата метанол или химическую субстанцию, ил.еющую такой же марщрут метаболизма , как и метанол, и представ ленную метаном, метиламином, формальдегидом, и муравьиной кислотой, а неортанический фосфат используют в количестве 4-35 г/л, рассчитанном относительно радикала фосфорной кислоты . 2. Способ по п. .1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что метанол, н метиламин вводят в количестве 0,2-4,0 об.%, а муравьиную кислоту и формальдегид-- 0,01-0,1 об.%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

PECflNi JlHH

4 15ц С 12 N 9/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЮ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н flATEHTY (21) 2933104/28 — 13 (22) 03.06.80 (31) 69800/79 (32) 04.06.79 (33) Япония (46) 07.03.85. Бюл. Н 9 (72) Масаеси Хатанака и Дайзо Таксути (Япония) (71) Куреха Кагаку Кабусики Кайся (Япония) (53) 663.15 (088.8) (56) !. Патент Японии М 41 — 17634, .кл. 36 Н 3, опублик. 1966.

2. Патент Японии Р 49 — 28996, кл, С 12 0 13/06, опублик. 1974. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИН-5 -ТРИФОСФАТА, предусматривающий

X культивирование продуцируюших его микроорганизмов на питательной среде, содержащей субстрат и неорганический фосфат, представленный (NH4)/F0<, К2НРО4 s КН2РО4 накопление целевого продукта и его выделение, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с це„,31.1„„1144619 A лью снижения себестоимости целевого продукта, в качестве родуцирующего микроорганизма используют метанолусваиваюшие штаммы

Protaminobacter methanol АТСС 2 1275, Corynobacterium яр. 21232,8acil lus cerus ATCC

14579, Jlethylomonas probus FERM — P-3139, Methy1omonas methy1ovora АТСС 21369, Pseudomonas methanol ica АТСС 21704, Pseudononas insueta АТСС 21276, Pseudomonas

methanica АТСС 21439 или Protaminobacter

ruber АТСС 8457, питательная среда содержит в качестве субстрата метанол или химическую субстанцию, и .еющую такой же маршрут Метаболизма, как и метанол, и представленную метаном, метиламином, формальдегидом, и .муравьиной кислотой, а неорганический фосфат используют в количестве 4 — 35 г/л, рас-. считанном относительно радикала фосфорной кислоты РО4.

2, Способ по п..1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что метанол и метиламин вводят в количестве 0,2 — 4,0 об.%, а муравьиную кислоту и формальдегид.— 0,01 — 0,1 об.%.

1144() 1 l0

Иэобрегснис относится к гехнической микробиологии и касастея способа получения аденозин-5 -трифосфата, использующего проI дуцирунлцие бактерии, способные ассимилировать мсгалол.

И и(остен фсрмсн(атнвный способ получения адснозин-5 -трифосфата (АТФ) путем культиви/ рования бактерии Brevibacterium ammoniage —

nes АТСС 6871 на питательной среде, содержа. щей источник фосфата, аденин или era производныс при рН среды 7,0, температура

20 — 40 С. Выход ЛТФ 3 г/л (11.

Известен 1акже способ получения АТФ, предусматривающий культивирование продуцен та Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872 на питательной среде, содержащей субстрат и неорганический источник фосфата, представл.. (ИН,,),НРО4, К,1 РО4 и КН,РО4 ри

30 С рН 6А йакопление целевого продукта г) и выделение в количестве 6,2 — 8,6 мг/мл (2).

11едостатком известных способов является то, что обязательным условием биосинтеза продуцента является наличие в среде аденина или его производного, такого как аденозин, используемого в качес) ве субстрата.

Цель изобретения -- снижение себестоимости. целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что при способе получения аденозин-5 -трифосфа1а. предусматривающем культивирование продупи30 руюших его микроорганизмов на питательной среде, содержащей субстрат и неорганический фосфат, представ.)енный (ИН4)е НРО4, КЕНРО и КН РО, накопление целевого продукта и его выделение, в к честве продуцирующего микроорганизма используют метанолусваивающие штаммы Protaminobacter methanol АТСС

21276, Corynobacterium sp, 21232, Bacillus

cerus АТСС 14579, Methy1omonas probus

FERM Р— 3139, Methylomonas methylovora

АТСС 21369, Pseudomonas methanolica АТСС

21704, Pseudomonas insueta АТСС 21276, Pseudomonas methanica АТСС 21439 или

Protaminobacter ruber АТСС 8467, питательная среда содержит в качестве субстрата метанол или химическую субстанцию, имеющую такой же маршрут метаболизма, как и метанол, и представленную метаном, метиламином, формальдегидом и муравьиной кислотой, а неорганический фосфат используют в количестве 4—

35 г/л, рассчитанном относительно радикала 50 фосфорной кислоты РО>, Метанол и метиламин вводят в количестве

0,2 — 4,0 об.%, а муравьиную кислоту и формальдегид — 0,01 — 0,1 об.%, Сущность изобретения заключается в том, 55 что один из перечисленных метанолусваиваю щих штаммов культивируется в среде, содержащей метанол или химическое вещество, 9 2

I имснццее Tot же метаболический путь, чго и метанол, н неорганический фосфат в количестве 4-35 г/n, рассчитанном по числу РО(.

Метанол или указанное химическое вещество используют в качестве источника углерода в среде, однако слишком высокая концентрация этого вещества в среде неблагоприятно сказывается на росте бактерий. Конценграция указанного вещества в среде обычно должна быть в пределах 0,2 — 4 об.% в слу ае метанола и метиламина и в пределах 0,01-0,1 об.% в случае муравьиной кислоты и формальдегида. Если использутот метан, то его концентрация соответствует его растворимости.

Подобный источник углерода может быть добавлен целиком одновременно в среду в начале культивирования, однако лучший резуль тат по отношению к выходу АТФ получают путем первоначального поддерживания в среде низкой концентрации источника углерода и дополнительного добавления в среду источника углерода по мере его потребления в процессе культивирования.

При этом важно иметь неорганический фосфат, содержащийся в среде в концентрации

4 — 35 г/л, рассчитанной по числу РО4, в дополнение к указанному источнику углерода. Такая концентрация неорганического фосфата в среде превышает в несколько десятков раз концентрацию в обычной бактериальной культуре и является совер)ценно специфической.

Если концентрация неорганического фосфата (рассчитанная по числу Р04),) в среде ниже

4 г/л, то не происходит увеличения выработки

АТФ, при концентрации выше 35- г/л рост

АТФ-продуцируюшей бактерии замедляется, что приводит к уменьшению выхода АТФ.

Неорганический фосфат в высокой концентрации препятствует секретированин) продуцированной АТФ бактериальными клетками и разру. шению АТФ фосфотазой. Неорганические фосфаты, используемые в изобретении, принадлежат к соединениям, обычно применяемым при приготовлении ферментационцой среды, и включают, например, (1ЧН4) НГ04 КН РО4, и К НРО, . Состав, используемый для приготовления среды, может включать, кроме названньгх источника углерода и неорганического фосфата

) и неорганическу)с соль (соль калия, магния, железа, марганца и т. д.) и в некоторых случаях неорганическую соль металла, такого как цинк, кобальт, молибден и других, также как и источник азота (аамиак, соль аммония, мочевина, нитрат и т. л.) . Возможно также добавление поверхностно-активного вещества, антивспенивателя и других добавок. з 11446

Состав используемой. среды следующий, г/л:

5 — 45 (3,5 — 32 по числу

4)

0,5 — 2,5 (0,35 — 1,75 по числу PO4)

КНРО 0,5-2,5 (0,275-1,37 по числу РО4) 2 .4

I (1<1Н4) $О4 0 10

MgSO4 ° 7 Н О 0,5 — 5,0

FeS04 ° 7Н О 0 05 — 0 5

l0

CaC I ° 2Н О . 0 — 0,2

Мп$О ° 4Н О 0 — 0,2

Источйик углерода 0,05 — 2 об.%

Культ ир ванне наэваннь«х АТФ-продуциру- 15 ющих бактерий в указанной среде предпочти-, тельно вь1полняют при следующих условиях: рН 5,8 — 9,0, предпочтительно 6,0 — 8,0, температура 15 — 50 С, предпочтительно 20 — 40 С, и уровень о о аэрации 05 — 4,0 V.×.М (объем воздуха, л.объем раствора культуры л/мин), перемешивание при 40 — 600 об/мин, в течение 2 — 9. дней. Для доведения рН среды культуры могут быть использованы щелочное вещество (аммиак), кислое вещество (серная кислота), буферный агент (фосфатный буфер) или другие пригодные вещества, такие как мочевина, углекислый кальций и т. д. В случае использования щелочного вещества наибольшее предпочтение отдается аммиаку, поскольку он может служить источником азота, Если указанные бактерии

ЗО форментируют при указанных условиях культивирования согласно изобретению, АТФ накапливается в среде в высокой концентрации

2 — 12 г/л. После завершения ферментации микробы удаляют и продуцированную АТФ отделя-. 35 ют и выделяют известным способом. Например, после удаления бактериальных клеток из ферментапионной среды (бульон) супернагант подвергают комбинации фракционирования и концентрирования-осаждения путем адсорбции и элюции с использованием активированного угля и анионообменной смолы, в результате чего происходит выделение продуцированной АТФ

Согласно изобретению АТФ продуцируется и накапливается в среде культуры в высокой 45 концентрации свыше 2 г/л без добавления в среду аденина или его дериватов.

Количество продуцированной АТФ в случае каждом примере определяют путем использования принципа реакции между АТФ и люцифе- 50 рин-.люциферазой, который выражается следующим образом: «

1) Люциферин+люцифераэа+АТФ вЂ” аденизлюциферин-пирофосфат;

2) Аденил -люциферин - аденйл-оксилюци- 55 ферин.

Интенсивность свечения флюоресцирующего продукта второй реакции в интервале длин волн

l9 4

560---580 нм измеряют в течение данного периода времени с использова<:чем С11ЕМ--GLOW

PHOTOMETER J4 — 7141 (American Instrument

Со) и полученный результат соотносят с предварительно полученной калибровочной кривой стандартных растворов АТФ. в результате чего определяют количество АТФ в растворе культуры.

Пример 1. Основная среда готовится растворением 7,0 r (NH4)

1,0 r К НРО4, 1,0 r Мд$04 ° 7Н О,и 1,0 r

FeSO4 7Н О в 1 л ионообмен««ой воды;

100 мл этои основной среды отмеряют пипеткой в каждую из 300-миллилитровых Эрлеимейеровских колб, после стерилизации в каждую колбу добавляют 1,6 г метанола, В приготовленную таким образом среду засевают Methylomones probus FERM Р— 3199, к<,<орый предварительно культивируют на скошенном агаре с указанным составом, после чего колбы встряо хивают при 30 С. На 4-й день после засева среды в растворе культуры продупировано и накоплено 2,8 г/л АТФ.

1 л этого раствора культуры подвергают нагрсваш«ю при 80 С в течение 5 мин, и после охлаждения центрифугHpoBBHH«0 для осаждения бактериальных клеток, после чего супсрнатант, доведегпплй до рН 3,5 3 н. соляной кислотой, обрабагы»ают активированным углем лля адсорбции АТФ и затем адсорбированную на акгивнрованном угле АТФ элюируют 50!.-ным раствором алкоголя, содержащим

1,47 аммиака. Это элюат конце««.<рируют при ° пониженном давлении и при низкой температуре для удаления избытка аммиака, доводя рН до 80.

Затем концснтриро»анный раствор пропус: кают через колонку сильнооеновной анионооб менной смолы Do

Cl-тига, в результате чего ЛТФ адсорбирустся на колонке. Адсорбат промывают ионообменной смолой и элюируют смесью соляной кисло. ты и хлористого натр<:я (О. М р ст»ор NaCI, полученный растворением 0,2 М раствора НС I рН 1,7), в NaC1) и фракцию АТФ отделяют.

Этот элюат нейтрализуют едким натром, пропускают через колонку. набитую активированным углем, элюируют 15 :r.»îé аммиачной водой и получе«шый элюат кошгснтрируют при нагрева нии для отгонки аммиака. Путем добавления метанола к этому концентрированному раствору получают 2,2 г к1тисп<лло» натрисвой соли ЛТФ.

Пример 2. 20 л среды, нри<отовленной растворением 7,0 г (М114) ПР04, 1,0 r KH РО4, 1,0 r К НРОц, 2,0 МАМБО, 7П О и

0,2 FeSO4 7Н„О и 0,2 мл антивслснивателя

К вЂ” 66 в 1 л ионообменной воды загружают в

44619 6

1 в среде увеличивают до 20 г/л..Через 96 ч пос« ле начала культивирования в растворе культуры лродуцируется и накапливается 12 г/л АТФ, которую выделяют по примеру 1.

5 Пример 4. Повторяют процесскульти- вирования по примеру 2, однако используют

30 г/л (NH4)2HPO4 для приготовления среды.

Через 96 ч после начала культивирования продуцируется и накапливается 7 г/л АТФ, которую выделяют по примеру 1.

Сравнительный пример 1.

Культивирование проводят по примеру 2, однако количество (NH4) НРО4в среде уменьшено по 3 г/л. Через 96 ч йосле начала культивиро I5 вания в растворе культуры продуцировано только 0,2 г/л АТФ.

Сравнительный пример 2.

Культивирование проводят по примеру 2, однако количество (NH4) НРО4 увеличено до 50 г/л, 20 Через 96 ч после начала культивирования в растворе культуры.продуцировано только

1 г/л АТФ.

Пример 5. Культивирование проводят по примеру 3, с использованием штаммов

25 указанных в таблице!!!тамм

Выход АТФ, г/л

Methyl omonas methy1ovora АТСС 21369

3,5

Pseudomonas insueta

АТСС 21265

ATCC 21704

3,1

Pseudomonas methano1ica

3,6

Pseudomonas methanica

АТСС 21439

3,2

ЛТСС 8457

Protaminobacter ruber

ATCC 21372

ATCC 21232

ATCC 14579

2,5

Protaminobacter candidus

Corynobacterium sp.

2,3

Baci1 lus cerus

2,2

Achromobacter methano1oðh! 1а ATCC 31?75

2,4

П:р и м е р 6. Methylomonas probus FERM

F Е ЯМ вЂ” P — 3193 культивируют по примеру 2, однако в качестве компонента питательной

50 среды вместо метанола испольэуют метиламин, После культивирования микроорганизмов в течение 20 ч 4,5 г/л адсноэин — S - рифосфата получено и накоплено в культурной среде, ВН14НПН Заказ 956/46

Филиал П!1П "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

30-литровьй сосуд-ферментер и стерилизуют при 120 С давлении 1,2 кг/см в течение и 2

30 мин. После охлаждения к указанной среде добавляют 200 мл метанола, и среду засевают

2%-ной культурой (Methyl omonas probus

РЕЯМ вЂ” P — 3193), которая культивирована на укаэанной среде (с последующей аэрацией на уровне 20 л/20 л (жидкое количество)/мин (0,5 V.V.М ) при псрсмсшивании со скоростью

500 об/мин при 35 С. Уровень аэрации повышают до 20 л/20 л /мин (1,0 V.V,M.) с ростом бактерий, и культивирование продолжают в течение 96 ч рН среды автоматически контролируют в пределах 6,0 — 7,2 с помощью аммиачной воды в течение культивирования, в то же время потребление метанола измеряют газохроматографичсски, при.этом устанавливают автоматическую подачу метанола с тем, чтобы его концентрация постоянно находилась на уровне 0,3—

2,0 o. Через 96 ч после начала культивирования в растворе культуры продуцируется.и накапливается 5,3 г/л АТФ, которую выделяют по примеру 1.

Пример 3. Культивирование проводят по примеру 2, однако количество (NH4) НР04 накопленный таким образом.аденоэин-5 -трифосфат отделяют и изолируют по примеру 1.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение целевого продукта без использования аденина или его производных, что снижает себестоимость аденоэин-5 -трифос/ фата.

Тираж 525 Подписное