Способ выделения пропердина из сыворотки крови

Авторы патента:

C12N9 - Ферменты, например лигазы (6.); проферменты; композиции их (препараты для чистки зубов, содержащие ферменты A61K 7/28; лекарственные препараты, содержащие ферменты или проферменты A61K 38/43; составы моющих средств, содержащих ферменты C11D); способы получения, активирования, ингибирования, разделения или очистки ферментов (приготовление солода C12C 1/00)

C07K1/18 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОПЕРДИНА ИЗ СШЮРОТКИ КРОВИ, включаиирЛ спе1 |ф|1ческую адсорбцио его на зююэан, элоцюо с зимозана, акционирование 1фоперда1на на ДЭАЭ-целлктозе и элюцмо его, о т л и чающийся тем,-что, с целью получения более очищенного концентриройвняаго, активного и {шмукогемяого щюпердина из сыворотки крови круякоро 1х гатого скота и упроцетмя очистки, ф1)а1с«1«)нировани€ пропердняа на ДЭАЭ-цеягаолоэе осуществлювт в присутствии 0,02-0,05 М Na-К-фосфвтного буфера рИ 7,1-7,8, a элкщяю с ЛЭАЭ-целлюлозы проводят градиенте 0,14),4 М NaC8 в этом буфере.

6% О1) СООЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

А а и

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ASTOPCICNW СЮIWTIAhCVRV

Ммас1

5 а

1 (21) 3643464/30-15 (22) 21.07.83 (46) 30.01.85. Бюл. р 4 (72) П.А.Емельяненко и В.Е.Коряанова (71) Московская ветеринарная академия им.К.И.Скрябина (53) 577.15.07(088.8) (56) 1. Rothstein F. Some phisical

and chemical characteristics of properdin. -Vox Sang, 1963, v. 8, р. 113t15.

2. Pensky J. Rinz F. Tood Е.g.

ef. а?.Properties of hightly purified

human propudin. вЂ” J. Eamunology, 1968, v.. t00, р. 142-158.

Д 28д

ЯЮ

ФФ

ЗЮЮУ

4(51) С 07 К 7/00 С 12 9/00 (54) (57) СПОСОВ ВЫЖПКИИ1 tIP0tt8P

ИЗ СИВОРОТКИ КРОВИ, включающий специфическую адсорбцию его на зимозан, элюцию с зимоэана, фракционирование нроиердина «а ДЭАЭ-целлюлозе и злюцию его, о т л и ч а ю щ и Ф с я тем;что, с целью получения более очищенного концентрированного, активного и иммуиогепного аронердина из сыворотки крови «рунного рогатого скота и упрощения очистки, фра«ционирование йропердина. на ДЭАЭ-целлюлозе осуществляют в присутствии 0,02-6,05 Н

ga-К-фосфатного буфера рй 7,1-7,8, а элюцию с ДЭАЗ-целлюлозы проводят градиентом 0,1--0,4 И МаС3 в этом буфере.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к получению очищенных ферментных препаратов, и может быть использовано в научно-исследовательских целях в иммунологии, биохимии, терапии.

Известен способ выделения пропердина из сыворотки крови путем осаждения его с фракцией эуглобулинов и дальнейшего фракционирования на ко- 1б лонке с ДЗАЭ-целлюлозой (1) .

Однако данный способ непригоден для получения высокоочищенного пропердина.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения высокоочищенного фермента, заключающийся в специфической адсорбции пропердина на зимозан-полисахарид дрожжевых клеток (5 мг/мл) при 17 С в течение 20 о

1 ч; элюции его из комплекса зимозан-пропердин буфером с высокой ионной силой; осаждении из элюата подкислением до рН 5,610,1 центрифугированием при 53000(1 ч; растворе- 25 нии осадка в а-фосфатном буфере рН 8,0, концентрация 0,005 И и отделении нерастворившихся белков центрифугированием при 105 000 (1 ч.

Далее следует фракционирование про- щ пердинсодержащей фракции на ДЗАЗ-целлюлозе, уравновешенной Na-фосфатным буфером рН 8,0, концентрация 0,005 И, Активный пропердии не сорбируется на анионите, злюцию его проводят стартовым буфером. Дальнейшая очистка заключается в освобождении нропердина от примесей на колонке с катионитом KM-сефедекс С-50, уравновешенным 1а-фосфатным буфером рН 5,9,4> концентрация 0,0002 М. В данных условиях пропердин сорбируется на сефадексе и затем элюируется линейным градиентом ЙаС6 (0,1-0,4 И) в стартовом буфере. Выход фермента 4> составляет 1SX (2) .

Однако известный способ непригоден для выделения пропердина иэ сыворотки крови крупного рогатого скота, так как при фракциониравании на ДЭАЭ-цел-50 люлоэе частично очищенного препарата фермента не происходит сорбции активного пропердина и большинства примесей на ионообменнике, поэтому на выходе из колонки получают частич->5 но очищенный, сильно разбавленный пропердин. Для получения высокоочищен ного пропердина необходимы дополни"

98 тельные стадии очистки, требующие наличия дорогостоящего и труднодоступного реагента.

Цель изобретения вЂ” получение более очищенного, концентрированного, активного и уммуногенного пропердина из сыворотки крови крупного рогатого скота и упрощение очистки.

Поставленная цель достигается тем, что фракционирование пропердина на ДЭАЭ-целлюлозе. осуществляют в присутствии 0,02-0,05 M йа-К-фосфатного буфера рН 7,1-7,8, а элюцию с

ДЭАЭ-целлюлозы проводят градиентом

0,t-О,4 И ИаС1 в этом буфере.

На фиг. 1 представлен характерный профиль элюции белков, адсорбировавшихся на зимозане в первом примере выполнения способа; на фиг. 2 вЂ” то же, во втором примере выполнения.

Изменение условий разделения элюата с зимозана на ДЗАЭ-целлюлозе исключает необходимость предварительного фракционирования его путем подкисления до рН 5,610,1 и центрифугирования при 53000 g 1 ч и 105000/ ч, а также дополнительной очистки на КИ-сефадексе С-50.

Способ выделения пропердина осуществляется следующим образом.

1 5-2,0 зимозана, предварительно прокипяченного в физиологическом растворе М аС на водяной бане в течение 1 ч и осаженного центрифугированием при 1000-1500 об/мин на

ЦЛС-З, смешивают с 300-400 мл бычьей сыворотки и инкубируют при о

15-17 С 1 ч, постоянно перемешивая.

Затем частицы зимозана с адсорбировавшимися на нем белками отмывают центрифугированием при 1000 об/мин на ЦЛС-3 10-15 мин ледяным 0,0003 И веронал-мединаловым буфером рН 7,4 несколько раз общим объемом 500 мл.

Отмытые частицы суспендируют в 6070 мл 0,002 M 9 а-фосфатного буфера рН 7,3, содержащего 1 M NaCF u

0,002 И ЭДТК. Элюцию белков с зимозана проводят при 37 С в течение

15-20 мин на магнитной мешалке. Частицы зимозана отделяют центрифугированием в описанных условиях, а экстракцию повторяют снова. Элюаты соединяют и диализуют против 5 л 0,020,05 И g а-К-фосфатного буфера рН 7,1-7,8 два раза в течение суток при 4 С. После диализа проводят о концентрацию элюатов на полиэтилен3 1137098 4 гликоле (мол. масса 35000) до :полиэтиленгликоле (мол.масса 35000) конечного объема 50-70 мл. Центри- . до конечного объема 50 мл (5-6 ч фугированием при 4 С и 3000, об/мин при 4 С). Сконцентрированный материал, о о на цЛС-3 30 мин осаждают образовав- содержащий пропердин, центифугируют шийся осадок денатурированных белков. > при 3000 об/мин и 4 С на КЛС-3 30 мин

Надосадок, содержащий пропердин для осаждения денатурированных бели 4-6 белков-примесей, служит мате- ков. риалом для нанесения на колонку Полученный раствор наносят на (2,2 58 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, урав- колонку (2,2.58 см) с ДЭАЭ-целлюлоновешенной буфером для диализа. 10 зой,.уравновешенной буфером для

Материал наносят на колонку со ско- диалиэа. После того, как весь матеростью 30 мл/ч..После того, как весь риал войдет в колонку, начинают проматериал войдет в колонку, начинают пускать стартовый буфер для вымывания пропускать стартовый буфер (1,5- несвязавшихся с анионитом белков.

2,0 объема колонки) для вымывания 15 Выход белка контролируют измерением несвязавшихся с колонкой белков. . оптической плотности раствора при

Затем элюируют связанный с ионообмен- длине волны 280 нм на СФ-16 (спект.ником пропердин стартовьм буфером, рофотометр). содержащим 0,1-0,5 М МаСь. При со- После выхода первого белкового держании в буфере 0,3 и 0,4 М йаС 20 пика (необходимо чтобы Д равняt 280 последовательно элюируются обе фрак- лась нулю) начинают элюцию проперции пропердина, которые собирают в днна. Для этого через колонку про пускают около 300мл: стартового буфе"Пример f. Берут t 5 r пред- ра, содержащего 0,1 М ЩаС, при варительно измельченного в ступке + этом выходит второй белковый пик, знмоэана, кипятят в 100 мл физиоло- состоящий из небольшого количества гического раствора ЯаС на водяной функционально.неактивных, но с сохбане ане в течение 1 ч, отмывают 200 мл раненной антигениой структурой фрактого же раствора центрифугированием ций пропердина (идентифнкацию пропри 1000 об/мин, 10 мин на ЦЛС-3. з< водили юимунохнмическим методом)., 300

0 мл бычьей сыворотки крови, ох- Затем пропускают последовательно лажденной до 15 С, смешивают с зимо- по 1,5-2,0 объема колонки стартового зановым осадком и инкубируют при той, буфера, содержащего 0,3, 0,4 и 0,5 М же температуре 1 ч, постоянно номе- ИаС3 . шивая. Комплекс зимозана с белками Характерный профиль элюции белков ос аждают центрифугированием при 4 С адсорбировавшихся на эимозане, из

0 35 и 1000 об/мнн на ЦЛС-3. 20 мин. Час колонки с ДЭАЭ-целлюлозой представ, тицы отмывают троекратно ледяным лен на фиг. 1.

0,0003 N веронал-мединаловым буфером

4 (общим объемом

Элюцин белков с зимозана п ово ят следующим образом. имо íà проводят Идентификацию белковых циклов проводили титрованием проперднна зимозаОсажденные частицы зимозана суспен- новым методом ПиллемеРа. В РезУльтадируют в 60 мл нагретого до 370С те хРоматогРафи полУчают гомоген0,002 M 1а-фосфатного буфера рН 7,3 45 ные фоРмы (-пРонеРдина (около 15 мл) содержащего 1 М й.аС и 0,002 M ЭдТК, и -пРопеРдина (около 20 мл) с Удельсуспензию инкубируюг при 37оС 15 . ной ак ивнос ьо соотве с венно 6,32

20 мин, перемешивая. Вновь частицы зимозана осаждают, надосадок сливают i Пример 2. Условия выделения в отдельную посуду, а экстракцию .0 нропердина аналогичны примеру 1. белков повторяют. Оба надосадка сое- После того, как элюаты с зимозана диняют вместе, помещают в диализный сконцентрированы, проводят диализ мешочек, непроницаемый для белковых . против 5 л 0,035 М я а-К-фосфатного молекул, и диализуют. против 5 л, буфера рН 7,5 два раза в течение

0,02 М Да-К-фосфатного буфера рН 7,1 И 24 ч при 4 С на магнитной мешалке. два раза в течение 24 ч при 4 С на После этого материал концентрируют о магнитной мешалке. После этого про- на полнэтиленгликоле (мол.масса водят концентрацию материала на 35000) до конечного объема 60 мл.

1137098

Сконцентрированный материал, содержащий проперции, центрифугируют при

4 С на ПЛС-3 30 мин при 3000 об/мин для осаждения денатурированных бел-. ков. 5

Полученный раствор наносят на колонку (2,2 58 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной буфером для

;диализа. После того, как весь материал войдет в колонку, начинают про- .10 пускать стартовый буфер для вымывания несвяэавшихся с ионнообменником

1 белков. Выход белка контролируют измерением оптической плотности раствора при длине волны 280 нм на 15 приборе СФ-16 (спектрофбтометр}.

После выхода первого белковбго пика {необходимо, чтобы Д В равнялась нулю) начишают элюцию пропердина. Для этого через колонку пропус-И кают около 300 мл стартового буфера, содержащего О,t М NaCf, при этом выходит второй белковый пик, состоящий из функционально неактивных, но с сохраненной антигенной структурой 25 форм пропердииа. Затем пропускают последовательно стартовый буфер, содержащий 0,3, 0,4 и 0,5 И йаСЕ.

Характерный профиль белков, адсор- бировавшихся на зимозане, из колонки 3Q с ДЭАЭ-целлюлозой приведен на фиг. 2.

Скорость тока а колонке 35 мл/ч, объем собираемых фракций 6-8 мл, Идентификацию белковых пиков проводили титрованием процердина зимозановым методом Пиллемера. В результате хроматографии получают гомогенные фракции формы (-пропердина (15-20 мл) и -продердина (20-25 мл) с удельной 4в активностью соответственно 6,25 и

13,0 ед/мг.

Пример 3. Усговия адсорбции

-проиердина на зимозан и элюции его с зимозановых частиц аналогичны гри- 4 меру 1. Затем элюаты соединяют, помещают в диализный мешочек, непроницаемый для белковых молекул, и диализуют против 5 л 0,05 М Яа-К-фосфатногд буфера рН 7,8 два раза в течение суток при 4 С на магнитной мешалке.

После этого проводят концентрацию материала на полиэтиленгликоле (мол.масса 35000) до конечного объема 70 мл. Сконцентрированный материал центрифугируют при 3000 об/мин и 4@С на ЦЛС-3 30 мин для осаждения денатурированных белков.

Фракционирование частично очищенного пропердина проводят аналогично примеру 1, применяя 0,05 И Na -К-фосфатный буфер рН 7,8. График элюции белков с ионообменника идентичен графику на фиг. 2.

Скорость тока в колонке 35 мл/ч, объем собираемых фракций 6-8 мл, идентификацию пропердина проводят по методу Пиллемера. В результате получают f --пропердин (10-14 мл) с удельной активностью 6,25 ед/мг, (-пропердии (15-20 мл) с удельной активностью 13,0 ед/мг.

В табл. 1 дается характеристика предлагаемого способа выделения пропердина, а в табл. 2 вЂ” характеристика известного способа выделения. нропердина.

По известному способу пропердин не удалось выделить в значимых количествах из сыворотки крови крупного рогатого скота. При этом полученный пропердин малоактивен и содержит примеси. Таким образом, известный способ не может быть использован для получения пропердина, пригодного для приготовления специфической антисыворотки, из сыворотки крови крупного рогатого скота.

Предлагаемый способ позволяет получить высокоочищенные, концентрированные, активные и иммуноreнные (получена антипропердиновая сыворотка) фракции пропердина в две стадии очистки.

1137098 таблица 1

Общий белок, мг

Степень очистки

Выход,Ж v, ил

Общая . активСтадии очистки ность ед активность, ед/мл

1120 О,И

100

Бычья сыворотка 400 33600 2,80

Злюция белков с зимозана

13,4 35

150 1,05

120 143 1,25