Способ получения днк-полимеразы бактериофага т4 в клетках еsснеriснiа coli
.СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ БАКТЕРИОФАГА Т4 В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLI, включающий получение клеточного экстракта, осаждение ДНК стрептомицинсульфатом, фракционирование белков сульфатом аммония и хромато гр.афию, -отличающийся что, с целью повышения выхода и упрощения способа, извлечение целевого продукта осуществляют из супернатанта после осазкдения ДНК стрептомицинсульфатом .
СОКИ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРС ГВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫЩ ЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
1 (21) 3613438/13 (22) 30.06.83 (46) 07.05.92. Бюл. N- 17 (71) Ленинградский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова (72) И.В.Иевелев, В.И.Крутяков и В.И.Иахно (53) 612.015.1 (088.8) (56) Dolgagov G.È. et al. "Eur. J. of
Brochem. 1981, 114, 243 — 254.
Goulian И. et а1. J. Biol. СЬев., 1968, 243, К 3, р.р. 627 — 638.
Инфицируемая бактериофагом Т4 в клетках Е.coli ДНК-полимераза широко применяется в молекулярной биологии и в.мопекулярной генетике, в частности, для изучения матричной активности
ДНК, определения последовательностей
ДНК, решения прикладных задач генной инженерии.
Также ДНК вЂ” полимераза бактериофага Т4 может быть использована для изучения действия антибиотиков, мутагенов, канцерогенов и других соединений на клеточные процессы, изучения йункций.белков в системах п чего и in viva
Известен способ выделения ДНК-полимеразы из клеток. E.coli CR63, зараженных бактериофагом Т4, с одновременным получением полинуклеотидкийазы, ДНК-лигазы, РНК-лигазы.
Способ осуществэнется в следующем.
Получают лизат бактериофага Т4 аш
Р 82 на клетка . r. .coli CR63, концент„„ЯЛ„„1147030 А1
Щ)5 C 12 N 9/00
2 (54) (57) . CPOCOB ПОЛУЧЕНИЯ ДНК-ПОЛИИЕРАЗЫ БАКТЕРИОФАГА Т4 В КЛЕТКАХ ЕБСНЕRICHIA C0LI, включающий получение клеточного экстракта, осаждение ДНК стрептомицинсульфатом, фракционирование белков сульфатом аммония и хроматографию, - отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и упрощения способа, извлечение целевого продукта осуществляют из супернатанта после осаждения ДНК стрептомицинсульфатом. рируют его полиэтиленгликолем, получают биомассу клеток Е..coli В-23, инфицированных бактериофагом Т4 am
Р 82, получают клеточный экстракт обработкой клеток ультразвуком, прово- дят фракционирование экстракта с помощью полимина P проводят солевую элюцию полиминовых осадков, осаждают це левые продукты сульфатом аммония и .очищают Ферменты путем колоночной хроматографии. 3
Недостатками этого способа являются: бд
1..Недостаточно высокий выход ДНК- (,„.) ! полнмеразы бактериофага Т4 (18X);
2. Недостаточно высокий выход био- . массы клеток Е.coli, зараженных бак- . териофагом Т4 (250 г из 100 л куль- . туры), несмотря на использование богатой питательной среды, что также приводит к низкому выходу целевого продукта;
1147030 4
3.. Необходимость получения концентрированного фаголизата с использованием полпэтипенгликоля и последующей очисткой от полиэтиленгликоля, что усложняет процесс,"
4. Пеобходимость предварительного экспериментального определения оптимального количества полимина Р для фракпионирования экстракта в каждом конкретном случае выделения ДНК-полимеразы бактериофага Т4, что также усложняет процесс.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения ДНК-полимеразы, инфицируемой бактериофагом Т4 в клетках E.cali.
Способ включает следующие операции.
1. Получение фаголизата бактериофага Т4 аш Р 82 на Е.cali CR-63 и концентрирование его полиэтиленгликолем.
2 ° Получение биомассы клеток Е.coli В-23. инфицированных бактериофагом Т4.
3. Вскрытие клеток перетиранием со стеклянными шариками (или с алюмийиевой пастой). Операции 1,2,3 — получение клеточного экстракта.
4 . Действие на клеточный экстракт стрептомицинсульфатом — осаждение ДНК (вместе с целевым продуктом).
5. Для извлечения целевого продукта используют полученный осадок. Его переводят в раствор, после чего удаляют нуклеиновые кислоты, для чего проводят автолиз. При этом частично удаляются некоторые белки.
6. Фракционирование белков сульфатом аммония.
7. Очистка целевого продукта путем колоночной хроматографии . сначала ионообменная хроматография белков на фосфоцеллюлозе, затем дополнительная очистка от остатков нуклеиновых кислот на ДЭАЭ-целлюлозе и гидроксилапатите.
Основными недостатками этого способа, как и препыдущих, является низкий выход целевого продукта (8%), а также сложность процесса, обусловленная прежде всего необходимостью проведения операции автолиза. Сложность и отрицательные последствия этой онерации общеизвестны. На стадии проведения автолиза происходит большая инактивация целевого продукта за счет высокой температуры (37 С) и действия протеаз (на что указывают сами авторы работы), а следовательно, и большие потери.
Необходимость предварительного экспериментального определения нужного количества стрептомицинсульфата (операция 4) для осаждения целевого продукта совместно с ДНК в каждом конкретном случае также усложняет процесс.
Более второстепенные факторы, также приводящие к низкому выходу продукта и усложнению процесса его получения, следующие:
1. Необходимость предварительного получения концентрированного фаголизата с использованием полиэтиленгликоля;
2. Иалый выход биомассы клеток
Е.coli, инфицированных бактериофагом Т4 (226 r из 100 л ростовой среды), несмотря на использование богатой питательной среды.
Целью настоящего изобретения яв-. ляется повышение выхода целевого продукта и упрощение способа.
Поставленная цель достигается тем, что в способе получения ДНК— полимеразы бактериофага Т4 в клетках
Е.coli, включающем получение клеточного экстракта, осаждение ДНК стрептомицинсульфатом, фракционирование белков сульфатом аммония и хроматографию, извлечение целевого продукта осуществляют из супернатанта после осаждения ДНК стрептомицинсульфатом.
Сущность способа основана на том, что извлечение целевого продукта прощ водят из супернатанта (раствора) при осаждении стрептомицинсульфатом, а не из осадка, как в прототипе и во всех известных способах. Экспериментальным путем авторами установлено, что в ра-. створе (супернатанте) присутствует в
3 раза меньше ДНК и в 10 раз больше целевого продукта. То есть осадок: значительно больше загрязнен ДНК, чем супернатант. Важно также то, что рас-О пределение целевого продукта между осадком и супернатантом при осаждении стрептомицинсульфатом остается, как . было обнаружено, практически постоянным (85-96Х целевого продукта остается в супернатанте) в широкям диапазоне концентраций стрептомицинсульфата.
То есть не требуется строгого подбора концентраций последнего, что необходимо в способе — прототипе.
30 6 ! содержащего 3 r L-триптофана и 3 г цистеина. Через 120 мин инфицированную культуру охлаждают до 15ОС и со" бирают клеточную биомассу центрифугированием в проточной центрифуге со скоростью 60 л в час. Бактериальную пасту замораживают в жидком азоте без промывания. Из 165 л. культуры получают 540 г биомассы клеток Е.coli
В-23, инфицированных бактериофагом
Т4 am Р 82 °
Для размножения бактериофага Т4 аш Р 82 на клетках CR-63 используют среду, аналогичную среде для инфекции,клеток В23. Клетки Е.coli CR-63 выращивают в--15 л ростовой среды до концентрации 2й109 клеток в 1 мл среды и заражают бактериофагом Т4 аш
Р 82 с множественностью 0,1 фаговая частица на клетку при температуре о
37 С. Через б ч концентрация фаговых частиц составляет 5х10" в мл среды, что позволяет инфицировать 150 л культуры клеток Е.coli В23 простым добав-лением 15 л фаголизата без предварительного концентрирования фаговых частиц.
ZI. Получение клеточного экстракта.
Для получения клеточного экстракта оттаивают 100 r клеточной пасты, доводят до 300 мл 0,05 м калийфосфатным буфером рН 7,0, с 10 мм — меркаптоэтанолом. Гомогенизуют в ножевом размельчителе тканей PT-1 за 30 с при
8000 об/мин. Клетки разрушают в процессе Френча при давлении 500 кг/см, пропуская дважды;л. Добавляют еще
250 мл 0,05 калийфосфатного буфера с
10 мм меркаптоэталоном и осаждают обломки клеток центрифугированием (здесь и далее все центрифугирования проводят на центрифуге J-21С "Beckшап" США 30 мин при 10000 g при 4 С).
Получают 550 мл экстракта.
Далее все операции очистки целевого продукта проводят при 4 С.
III. Осаждение ДНК стрептомицинсульфатом.
К 550 мл клеточного экстракта добавляют за 30 мин при перемешивании а магнитной мешалке 100 мл 12Х растора стрептомицинсульфата, который готовят непосредственно перед употеблением. Через 45 мин отделяют осаок центрифугированием. В супернатане остается около 952 ДНК-полимеразы актериофага Т4.
Благодаря такому осаждению ДНК трептомицинсульфатом отпала необхо5
Вследствие вышеуказанных причин отпадает необходимость в проведении автолиза (упрощается процесс), а также значительно увеличивается выход целевого продукта с более высокой
S удельной активностью.
Кроме того, предложение изменить последовательность хроматографической очистки: сйачала очищать от нуклеиновых кислот, затем от белкаобеспечивает повышение выхода целевого продукта. Это объясняется тем, что удается максимально очиститься от . остатков нуклеиновых кислот, которыемешают ионообменной хроматографии белков.
Заявляемый способ включает следую, щие операции.
1. Получение биомассы клеток Е.coli В-23, инфицированных бактериофаroM Т4.
2. Вскрытие клеток.
Операции 1-2 — получение клеточного экстракта. 25
3. Действие на клеточный экстракт стрептомицинсульфатом - осаждение
ДНК.
Использование супернатанта для извлечения целевого продукта.
4. Фракционирование белков суль30 фатом аммония.
5. Очистка целевого продукта "iiyтем колоночной хроматографии: сначала от остатков нуклеиновых кислот, потом от белков. 35
Способ подтверждается следующими примерами.
1. Получение биомассы клеток E.coli В-23, зараженных бактериофагом
Т4 аш Р 82. 40
Для получения биомассы клеток Е.
coli В-23, инфицированных бактерио: фагом Т4 am Р 82 (мутант, сохранивший все функции, кроме,.способности лизировать клетки E.coli В), исполь- 45 зуют модифицированную среду M9:
:Na Культуру E.coli В-23 выращивают в в .лабораторном 4ерментере емкостью 250 л до концентрации 1к10 клеток в р 1 мл среды и заражают фагом Т4 am 55 д :Р 82 с множественностью 5 фаговых т частиц на клетку при температуре б ,37 С. Перед внесением фаговых частиц в ферментер заливают 300 мл раствора, . с 114 димость в проведении автолиэа и удалось почти без потерь очистить ДНКполимераэу бактериофага Т4 от значительной части ДНК. IV. Фракционирование белков суль-, фатом аммония К фракции III добавляют при перемешивании эа 30 мин сульфат аммония из расчета: (NH<) wV1 мл . Через 20 мнн отделяют осадок центрифугированием и к супернатанту добавляют за 30 мин при перемешивании сульфат аммония из расчета: (ГШФ)г804 (21 = 0,078Гг/мп1хЧ1мл). Через 45 мин отбирают осадок центрифугированием и ресуспендируют в 40 мл 0,02 м калийфосфатного буфера рН 6,2 с 2 мм ЗДТА и 10 мм Р-меркаптоэтанолом (буфер А) и диализуют 16 ч против 5 л буфера А (а супернатант досали- " вают до 707. сульфатом аммония и используют для выделения ДНК вЂ” полимеразы I). V. Хроматография на ДЭАЭ целлолоэе — от нуклеиновых кислот и некото - рых белков а. Колонку с ДЗАЭ целлюлозой (6 см х 15 см) уравновешивают буфером А. Наносят отдиализованную фрак цию IV и смывают белок линейным градиентом от 0,02 до 0,3 м калийфосфатным буфером А (800 мл) со скоростью 120 мл/ч. Собирают все активные фракции ДНК вЂ” полимеразы бактериофага Т4, концентрируют высаливанием 707 сульфатом аммония, переводят в 15 мл 0,05 м N -ацетатного буфера рН 5,8 с 2 м ЗДТА и 10 MM P-меркаптоэтанолом (буфер Б} и диализуют 12 ч против 5 л буфера Б, б. Хроматографическая очистка от остатков нуклеиновых кислот на сефакрил С-200 Колонку с сефакрилом С-200 (9,5 см у 110 см) уравновешивают буфером Б и наносят отдиализованную фракцию Ча. Элюируют белки буфером Б со скоростью 60 мл/ч. Активная фрак ция ДНК-полимераэы бактериофага Т4 выходит при элюции примерно 400 мл буфера Б, а остатки нуклеиновых кислот при этих условиях связываются с . сефакрилом и смываются элюцией 0,1 м NaC1. Собирают все активные фракции ДНК-полимеразы бактериофага Т4, диалиэуют эа 12 ч против 10 л буфера А (co сменой буфера через каждые 4 ч). На стадиях III-Va удалось значительно освободиться от остатков нук- 7030 8 леиновых кислот А 280 (А 260 меняется от 0,65 во фракции IV до 2,26 в VI фракции), сохранив почти без потерь активность ДНК-полимеразы бактериофага Т4. в. Ионообменная хроматография белков на карбоксиметилсефадекс Г-25 Колонлу с карбоксиметилсефадексом Г-25 (4,5 см х 30 см) уравновешивают буфером А и наносят отдиализованную фракцию Чб. Со скоростью 120 мл/ч элюируют 800 мл линейного градиента 6yhepa А от 0,02 до 0,25 м калийфосфатного буфера. Фракции; содержание ДНК-полимеразную активность, концентрируют диализом против 50Х раствора полиэтиленгликоля (EI.В.20000) и диализуют 12 ч против 5 л 0,05 м трисНС1 буфера рН 8,0 с 2 мм ЗДТА и 10 мм 5-иеркаптоэтанолом (буфер В). После диалиэа добавляли NaC1 до 0,05 м. . ) ° . ° . ° 1 . . ) I ДНК вЂ” полимераза бактериофага Т4 25 . на этой стадии является íà 95Х гомогенной (из данных по электрофорезу в полиакриламидном геле). r. Дополнительная гель-фильтрация на сефакрил С-200 — очистка от белков Колонку после стадии Чб промывают 30 и уравновешивают буфером В с 0,05 м NaC1 фракцию Va наносят и элюируют этим же буфером со скоростью 60 мл/ч. Фракции с полимеразной активностью больые 200 единиц активности в мл 3 концентрируют диализом против 507 раствора полиэтиленгликоля (И.В. 20000), диализуют к 507 глицерину с 0,05 м трис-НС1 буфером pEI 7,5 с 0,1 м (NH<) 4ф и хранят при -20 C. Электрофореэ в полиакриламидном геле дает единственную полосу, соответствующую ДНК вЂ” полимеразе бакте риофага Т4. Загрязнений остатками нуклеиновых кислот не обнаружено. Таким образом, заявляемый способ по отношению к прототипу обладает следующими преимуществами: 1. Повышается выход целевого про- . щ дукта при сохранении его высокой удельной активности (64X). В литера,туре и практике не известно ни одного .способа получения ДНК - полимеразы бактериофага Т4 в клетке со столь высоким выходоме 2. упрощается процесс за счет устранения операции автолиза K дополнительным преимуществам ., следует отнести то, что авторы, полу- Редактор Е. Гиринская Техред JI,Îëèéíûê Корректор M. Самборская Заказ 2434 тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 9 1147030 10 чают в 1,3 раза больше биомассы кле- ния концентрированного фаголизата и ток Е. coli, инфицируемых бактериофа- на отечественных реактивах, гом Т4, без предварительного получе
