Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛАТИНОВЫХ МИКРОНОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, включающий получение желатиновых гранул при диспергировании водного раствора желатина в неполярном органическом растворителе , обработку гранул диальдегидами и их сепарирование, о т личающийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения технологических характеристик целевого продукта, обработку гранул проводят 1,4-1,75%-ными растворами диальдегидов одновременно с диспергированием раствора желатина, а перед сепарированием гранулы дополнительно обрабатывают восстанавливающими реагентами.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (! 9) (I 1) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ABTGPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

lO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИЙ (21) 3654129/28-13 (22) 15. 07.83 (46) 15.06.85. Бюл. Р 22 (72) В.I1. Грачев, A.Ã. Гутманис, H.À. Завальный, А.Х. Зицманис, H.Ê. Клявиньш и В.Д. Попова (53) 577.15 (088.8) (56) 1. .Патент Великобритании

Р 2059991,кл. С 12 P 5/02, 1981.

2. NiIsson K., ИовЬасЬ К. FEH9

Letters, 1980, v. 118, р. 145-150. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛАТИНОВЫХ ИИКРОНОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, включающий получе4(5!1 С 12 N 5/00 С 12 N 11/00 ние желатиновых гранул при диспергировании водного раствора желатина в неполярном органическом растворителе, обработку гранул диальдегидами и их сепарирование, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения технологических характеристик целевого продукта, обработку гранул проводят 1,4-1,757-ными растворами диальдегидов одновременно с диспергированием раствора желатина, а перед сепарированием гранулы дополнительно обрабатывают восстанавливающими реагентами.

3 11615

Изобретение относится к биотехнологии, s частности к получению микроносителей для иммобилизации и вцращизания клеток, рост которых

:вазможен на поверхности носителя.

Использование микроносителей для культивирования позволяет выращивать значительные количества клеток в одном реакторе, уйеньшает трудоемкость процесса, позволяет достичь . 10 большей стерильности и тем самым открывает возможности использования методов выращивания клеток в промышленных масштабах.

Для культивирования клеток ис- 15 пользуются различные микроносители, в частности, на основе декстрана, модифицированного коллагеном f1) .

Недостатками микроносителя являются двустадийность его синтеза, 20 невозможность его использования для культивирования некоторых типов клеток, а также ухудшение его характеристик при повторном использовании. 2S

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту являет- ся способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток, включающий получение желатиновых гранул при диспергировании водного раствора желатина в неполярном органическом растворителе (хлороформ-толуол), обработку гранул диальдегидами (глутаровым альдегидом)з н их сепарирование.

Способ предусматривает раздельное проведение всех стадий, двухкратное сенарирование, использование высоких концентраций глутарового альдегида (2), 40

Недостатками способа являются его миогостадийность, сложность, большой расход глутарового альдегида и не. достатки целевого продукта (окрашишаннв геля прн микроскопнровании, неспецифическая сорбцня но свободным альдегидным группам).

Цель изобретения - упрощение процесса и улучшение технологических S0 характеристик целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получе.ния желатиновых микроносителей дпя . культивирования клеток, включающему И получение желатиновых гранул при ..диспергировании водного раствора .желатина в неполярном органическом

48 2 растворителе, обработку гранул диальдегидами и их сепарирование, обработку гранул проводят 1 41,75Х-ными растворами диальдегидов одновременно с диспергированием раст-, вора желатина, а перед сепарированием гранулы дополнительно обрабатывают восстанавливающими реагентами.

В качестве диальдегидов можно использовать глутаровый альдегид, диальдегид азелаиновой кислоты, глиоксаль, терефталевый диальдегнд.

Обработка протекает в среде различных неполярных органических растворителей (машинного, трансформаторного масла, изооктана, толуола, ксилола, бензола, хлороформа и др.) с последующим отмыванием реакционной среды и последующим фракционированием, выделяя частицы микроносителя с оптимальными размерами 100-250 мкм. В качестве восстанавливакяцих реагентов используются реагенты, восстанавливакиць.. C=N связи и альдегидные группы, например боргидриды щелочных ме- . таллов, перекись водорода, атомарный водород, дитионит (гидросульфит) натрия и др.

Использование предлагаемого choсоба обеспечивает упрощение процесса получения носителя: уменьшается стадийиость способа получения микроносителя (отпадает необходимость в стадиях выпаривания, повторного автоклавирования и приготовления трехкомпонентной смеси), упрощается сос- . тав реакционной среды (вместо трехкомпонентной смеси по известному способу в предлагаемом используется однокомпонентная система); уменьшается общая продолжительность проведения процесса, уменьшается расход поперечно сшивающего агента (вместо использования 20 мп 25Х-ного раствора глутарового альдегида на 1,5 г желатина по известному способу в предлагаемом способе на такое же количество желатина используется

3 мл 253-ного раствора глутарового альдегида), Использование нредпагаемого способа позволяет заметно улучшить также качество микроносителя: обработка восстанавливающим рвагентом позволяет обесцветить частицы носителя (тви самым улучшаются его технологические качества) и облегчает непрерывный анализ роста кле- .

161548 4 счете на сухое вещество) 10Х желатина.

Пример 2. 200 мл 25Х-кого раствора желатина, полученного прн

50 С, суспендируют в 1 л смеси„ сос« тоящей из трансформаторного масла и изооктана (1:1 по объему), и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем, не останавливая мешалку, к смеси

10 прибавляют 75 мл 25Х-ного раствора глутарового альдегида и перемешивают еще 20 мин. Затем микроноситель отфильтровывают на сите 100 мкм и промывают иэооктаном, горячей водой

15 в присутствии поверхностно-активных веществ.н еще горячей водой. Полу- . ченный носитель заливают 500 мл

10Х-ного раствора перекиси водорода и выдерживают 0,5 ч, затем фильтруют, промывают водой и фракционируют, отбирая фракцию с размерами частиц

100-250 мкм. Получают 260 r влажного микроносителя, содержащего (в пересчете на сухое вещество) 18Х желатина.

П р .и м е р 3. 200 мл 20Х-ного раствора желатина, полученного при о

50 С,сусненднруют в 1 л ксилола и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем, не останавливая мешалку, прибавляют 75 л 25Х-ного глутарового альдегида н перемешивают еще 5 мин, Иикроиоситель отфильтровывают на сите 100 мкм, промывают петролейным эфиром, горячей водой в присутствии поверхностно-активных ве30

П р и м .е р 1. 400 мл 15Х-ного . раствора желатина, полученного при

504С, суспендикуют в 2 л смеси, состоящей иэ машинного масла и нэооктана (1:1.по объему), и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем, . не останавливая мешалку, к смеси приливают 150 мл 25Х-ного раствора глутарового альдегида конечная

) концентрация 1,46Х и перемешивают еще 20 мин. После этого носитель отфильтровывают на сите 100 мкм и промывают иэооктаном,горячей водой в присутствии поверхностно-активных SO веществ, горячей водой. Полученный микроноситель заливают 1 л 2Х-ного раствора боргидрида натрия и выдерживают 0 5 ч, затем фильтруют, промы. вают водой и фракцноннрувт, отбирая $5,,ра глиоксаля (конечная концентрафракцию с раэмерамн частиц 100250 мкм. Получают 540 г влажйого мнкроносителя, содержащего (в переМ Ю мерами частиц 100-250 мкм, Получают 200 г влажного мнкроносителя, содержащего (в пересчете на сухое вещество) 1ВХ желатина.

П .р н м е р 4. 200 ил 20Х-ного раствора желатина суспенднруют в

1 л ксилола и интенсивно перемеши-. вают в течение 3 мнн. Затем, не останавливая мешалку, к суспенэин прибавляют 50 мп 35Х- него раство« цня 1,4X) и нер мааквают еще 5 мнн.

Далее обрабатывают согласно примеру

2. Получают 195 r инкроносителя,соз 1 ток на микроносителях, обработка восстанавливающим реагентом позволяет удалить несвязанные альдегидные группы и тем самым увеличить специфичность взаимодействия носителя с клеткой использование условия получения микроносителя позволяет получить носитель, который стабилен не только при комнатной температуре (20-25 С), но и при более высоких температурах, что облегчает проведение различных операций (стерилизации, дальнейшего модифицирования) с ним.

Согласно предлагаемому способу получен микроноситель с плотностью и прозрачностью, близкой таковым у воды, значительной химической и механической стабильностью, с размерами частиц, обеспечивающими оптимальный рост клеток и шарообразной формой микросферы, обсспечивающей быстрое прикрепление клеток к поверхности мнкрокосителя и эффективный рост и распластывание клеток самого различного типа. Полученные микроносители не разрушаются обычными культуральныии средами .и поэтому они могут быть использованы многократно. Рост культур клеток на них можно осуществить как в статических условиях, так и суспензионным методом в динамических условиях, т.е. в условиях глубинного культивирования клеток. ществ и чистой горячей водой. Полу" ченный микроноснтель заливают 500 мл .

0,5Х-ного раствора гидросульфита натрия н выдерживают 1 ч, затеи фильтруют, промывают водой н фракционируют, отбирая фракцию с раз1161548 держащего 17% желатина (в пересчете на сухое вещества).

Пример 5. 200 мл 20% íîãî раствора желатина суспендируют в л смеси, состоящей из машинного 5 масла и изооктана (l:1 по объему),и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин.

Затем, не останавливая мешалку, к суспензии прибавляют 50 мл 40%-ного раствора терефтальевого диальдегида (конечная концентрация 1,6%) в диоксане и перемешивают еще

60 мин. Полученные гранулы отфильтровывают на сите 100 мкм и промывают изооктаном, горячей водой в присутствии поверхностно-активных веществ и еще раз горячей водой.

Полученный материал запивают 500 мл

ВХ-ного раствора перекиси водорода и выдерживают 0,5 ч, фильтруют, промывают водой и фракционируют, отбирая фракцию с размерами частиц

100-250 мкм. Получают 180 r микроносителя, содержащего 17% желатина (в пересчете на сухое вещество) .

Пример 6. 300мл 20%ного желатина суспендируют в 1 л смеси, состоящей из машиннога масла и иэооктана (1:1 по объему), и интенсивна перемешивают при комнатной темперачуре в течение 3 мин. Затем, не останавливая мешалку, к суспензии прибавляют 80 мл 28%-ного раствора свежеприготовлелного диальдегида азелаиновай кислоты (конечная концентрация 1,75%) и перемешивают

20 мин. Полученные гранулы отфильтровывают на сите 100 мкм и промывают изооктаном, горячей водой в присутствии поверхностно-активных веществ и еще раз водой, Гранулы заливают 500 мп 8%-ного раствора перекиси водорода и выдерживают

0,5 ч, фильтруют, промывают водой и фракционируют, отбирая фракцию с размером частиц 100-250 мкм.

Получают 190 г микроносителя с содержанием 17Х желатина (в пересчете на сухое вещество).

Микранасители, полученные согласно примерам 1-6, содержат 10-18% желатина (в пересчете на сухое вещество) имеют сходные свойства и могут быть применены (для размножения клеток) с одинаковым успехом.

Выращивание различных типов клеток на предлагаемых микроносителях протекает следующим образом.

10 мл плотного осадка микроносителей (предварительно стерилиэованных автоклавированием), что обеспечивает культуральную поверхность около 2500 см, и 40.20 све6 жеизолированных клеток куриных эмбрионов 9-дневного возраста суспендируют в 100 мл питательной среды 199 с 0,15% гидролизата лактальбумина, 5Х телячьей сыворотки, 0,1% галактозы, 20 мм буфера HEPES (рН 7,4) и антибиотиками.

Культивирование проводят в сосуде объемом 250 мл с подвешенной мешалкой при 37 С. В первые сутки культивирования число оборотов мешалки составляет 10 об/мин, на вторые и третьи сутки- 20-30 об/мин и далее 50-60 об/мин. Через 48 ч культивирования заменяют 50-70% среды на свежую . Спустя 4-5 сут после начала культивирования на частицах микроносителей формируются плотные культуры клеток куриных эмбрионов.

Концентрация клеток к этому времени достигает (2,6+10,3) млн. кл/мл, т.е. за 4-5 сут их число возрастает в среднем в 6,5 раза.

Клетки почек зеленых мартышек (КПЗМ) первого субпассажа культивируют на микроносителях в условиях, аналогичных описанным в примере 1, с той разницей, что посевная концентрация клеток в данном примере сос6 тавляет 1, 5 ° 10 кл/мл, концентрация сыворотки 10%.

Через 4-5 сут культивирования концентрация клеток достигает (1,5 0,22) млн. кл/мл, возрастая в среднем в 10,8 раза.

Клетки диплоидной линии М-?1 эмбриона человека, взятые на уровне

24 и 28 пассажей, выращивают на микроносителях, как описано выше, с той разницей, что вместо среды

199 используют основную среду Игла.

Через 5 сут культивирования число клеток увеличивается в среднем в

7,6 раза, концентрация клеток при этом достигает (1,14 0,11) млн кл/мл.

Таким образом, преимущества при использовании предлагаемого способа заключаются в том, что он проще известного в осуществлении: меньше стадий, однокомпонентная система, Составитель В. Муронец

Техред А.Бабинец Корректор A. Зимокосов

Редактор Н. Киштулинец

Тираж 525 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 13035,Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4!5

Заказ 3938!31

Филиал ППП "Патент", r..Óæãîðîä, ул, Проектная,4 уменьшена продолжительность, процесса;позволяет экомить сырье (уменьшен расход глутарового альдегида); улучшить качество целевого продукта так как полученный микроноситель стабилен в широком диапазоне температур (до 120 С), не содержит сво1161548 8 бодных альдегидных групп) которые обуславливаот неспецифическув адсорбцию компонентов среды), прозрачен (что позволяет проводить визуаль5 ный контроль культур клеток на иикроносителях); может быть использован для выращивания клеток многократно.