Способ выделения бактерий - продуцентов лейкоцитарного интерферона человека

 

(19)SU(11)1200578(13)A1(51)  МПК ⁵    _{C12P1/00, G01N33/53}(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯк авторскому свидетельствуСтатус: по данным на 17.01.2013 - прекратил действиеПошлина:

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ - ПРОДУЦЕНТОВ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к современным методам анализа биологических объектов, конкретно к оценке уровня продуктивности синтеза биологически активных полипептидов (в частности интерферонов человека) бактериальными клонами, полученными методами генной инженерии, и может найти применение в биотехнологии и физико-химической биологии. Целью изобретения является ускорение способа и повышение выхода целевого продукта. Способ осуществляют следующим образом. Выращивание трансформированных рекомбинантными плазмидами бактериальных клеток E.coli проводят на чашках с питательным агаром, на который помещают пористую подложку (фильтр), способную смачиваться питательной средой из агара, при этом среда становится доступной для бактериальных клеток, помещенных на поверхность подложки, и обеспечивает их рост с образованием отдельных колоний бактериальных клеток, находящихся на поверхности подложки. Далее обработку бактерий на твердой подложке мечеными антителами проводят в кислой среде при рН 2-3, при этом колонии бактериальных клеток фиксируются на подложке в месте их положения. Одновременно с фиксацией клеток происходит нарушение целостности их оболочки так, что находящийся внутри клеток интерферон становится доступным для взаимодействия с антителами. Обработанный кислотой фильтр переносят в нейтральный раствор и инкубируют с мечеными ¹²⁵I антителами к лейкоцитарному интерферону. Связывание меченых ¹²⁵I антител с интерфероном, находящимся внутри фиксированных клеток, проводят путем инкубации подложки с раствором, содержащим меченые антитела к человеческому интерферону. Эти антитела образуют прочный комплекс с находящимся внутри фиксированных клеток интерфероном и остаются связанными с ним после отмывки фильтра. Несвязанные антитела отмывают белковым раствором. Уровень радиоактивности бактериальных колоний после этих операций зависит от количества находящегося в клетках интерферона, определяют его радиоавтографией путем наложения рентгеновской пленки на высушенную подложку, экспонирования и последующего проявления рентгеновской пленки. При этом степень зачернения пленки в месте экспонирования колонии зависит от количества связавшихся с клетками меченых ¹²⁵I антител и, таким образом, количества находящегося в них интерферона. П р и м е р. Клетки E. coli К-802 трансформируют рекомбинантными плазмидами, программирующими синтез человеческого интерферона α₂, и высевают на 6 нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на LB-агар с антибиотиком по известному методу (диаметр фильтров 10 см). На каждом фильтре выросло около 2 тысяч бактериальных колоний. С этих фильтров снимают копии, на которых хранятся колонии живых клеток. После снятия с них копий фильтры переносят на фильтровальную бумагу, смоченную 0,5 М уксусной кислотой (рН 2,5), на 5 мин при комнатной температуре, затем переносят в раствор A (0,025 М фосфат натрия, рН 7,0; 0,5%-ный бычий сывороточный альбумин; 0,1%-ный азид натрия) в расчете 10 мл раствора на один фильтр. Инкубируют при комнатной температуре 5 мин, затем переносят в 0,5 М уксусную кислоту на 30 мин и затем на 2 ч в раствор A. Фильтры промокают фильтровальной бумагой и помещают на 2 ч в раствор A, содержащий (1˙10⁶ имп/мин, 5˙10⁶ имп/мин.мкг) меченные ¹²⁵I моноклональные антитела NK2 к лейкоцитарному интерферону человека. Фильтры промывают 4 раза по 15 мин раствором A, содержащим неионный детергент (0,5% -ный Tween 20), высушивают и радиоавтографируют при комнатной температуре в течение суток при помощи рентгеновской пленки РТ-1. После проявления рентгеновской пленки на полученных радиоавтограммах по степени зачернения пленки (визуально) идентифицируют в среднем по 2 клона на каждом фильтре (из 2 тысяч), вызывающих зачернение пленки, превышающее фоновое, причем степень зачернения для разных клонов различна. Полученные радиоавтограммы сопоставляют с копиями фильтров, содержащих живые клеточные колонии. Чтобы исключить возможность ошибки при идентификации клонов, дающих положительный ответ на радиоавтограммах (возможный из-за большой плотности засева фильтров: 2 тысячи колоний на фильтр), с клонами, находящимися на копиях фильтров, с последних перекалывали на отдельный нитроцеллюлозный фильтр в среднем по 10 клонов в 3 повторах (для повышения достоверности) из участков фильтра, на котором находился положительный клон. Всего было переколото на отдельные фильтры около 150 клонов. После их выращивания и обработки фильтры радиоавтографировали.

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ - ПРОДУЦЕНТОВ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, включающий выращивание их на твердой подложке и обнаружение продуцентов с помощью меченых ¹²⁵J антител методом радиоавтографии с последующим отбором целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и повышения выхода целевого продукта, обработку бактерий на твердой подложке мечеными антителами проводят в кислой среде при pH 2 - 3.