3,5-диметил-2,6-дифенил-4-(фенилэтинил)-пирилий перхлорат как реагент для определения метициллина

 

3,5-Диметил-2,6-дифенил-4(фенилэтинил)-пирилий перхлорат формулы сн cio i как реагент для определения метициллина. (Л с: 0.5- ffAаз . о.г0 .1 -т- 2 -г4 ю 00 ffpfftfeHfnpoefi/Я Memuifi//7/7Uf a ff r/M/f} -т- 5 8 7О

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН г

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ, г> 1

° «,1

;а

С=-С

° С10

0,1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 3841045/23-04 (22) 03.01.85. (46) 15.07.86. Бюл. Ф 26 (71) Ростовский научно-исследовательский институт .эпидемиологии, микробиологии и гигиены и Ростовский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. М. А. Суслова. (72) Н. А. Дмитриева, Л. Н. Чернавская, С. Г. Благородов, А. П. Шепелев, А. В. Коблик и Л. А. Мурадьян (53) 547,814.03(088.8) (56) Шемякин М. М. Химия антибиотиков. М., 1961, т. 2. с. 1025 1026, Герольд М. Антибиотики. М.: Мир,.

1966, с. 107.

„„SU„„1244148 А1 (ц 4 С 07 D 309/34, А 61 К 31/35 (54) 3„5 ДИМЕТИЛ-2,6-ДИФЕНИЛ-4(ФЕНИЛЭТИНИЛ) -ПИРИЛИЙ ПЕРХЛОРАТ КАК

РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНЙЯМЕТИЦИЛЛИНА (57) 3,5-Диметил-2,6-дифенил-4(фенилэтинил)-пирилий перхлорат формулы как реагент для определения метициллина.

1244148

ИК-спектр в вазелиновом масле, см : 2210 (С С), 1610, 1590, 1570 (ароматич.), 1100 (C.EO ).

ПМР-спектр в трифторуксусной кислоте, внутренний эталон ГМДС, 6 млнд.. 2,45 (с, 6Н, 2 СН ); 7-7,65 (м, 15 Н, ароматические протоны).

Найдено, % С 69,99;

С!1 7,57

С Н z„CEOq

Вычислено, : С 70, 35; Н 4 59;

С.1! 7, 69 .

Соединение 1 плохо растворяется. в неполярных и малополярных растворителях и воде и хорошо — в полярных (спиртах, хлорорганических производных и диметилсульфоксиде).

Перхлорат 2,6-дифенил-3,5-диметил-4-фенилэтинил)-пирилия наиболее устойчив в хлороформе (окраска раствора сохраняется без изменения более 4 ч, в спиртах и хлороргани40

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к

1

3,5-диметил-2,6-дифенил-4- фенилэтинил)-пирилий перхлорату (I), который может быть использован как реагент для определения метициллина в фармакологии и медицине.

Целью изобретения является выявление в ряду производных 4-фенилэтинилпирилия нового свойства — аналитичес- !р кого реагента для количественного колориметрического определения метициллина в растворе в смеси с другими антибиотиками без предварительного отделения последних. !5

Пример 1. Получение перхлората 3,5-диметил-2,б-дифенил-4(фенилэтинил)-пирилия.

Металлируют 2,0 г (0,02 моль) фенилацетилена бутиллитием в абсолют- 2р ном эфире в атмосфере инертного газа при 34-35 С в течение 1,5 ч. К образовавшемуся фенилацетилениду лития добавляют 3 61 r (О 01 моль) перхлората 2,б-дифенил- 3,5-диметилпирилия. 25

Перемешивают при кипячении 5 мин до полного растворения добавленного перхлората. Реакционную смесь обрабатывают насьпценным раствором хлорида аммония, эфирный слой отделяют, сушат безводным сульфатом натрия и прибавляют 0,03 миль ацетилперхлората.

Выход перхлората 3,5-диметил-2,6дифенил-4(фенилэтинил)-пирилия 60 65% (3 r), Т. пл. 189-190 С. ческих растворителях, исключая хлороформ, зеленеет или буреет).

Пример 2. Методика определения метициллина в растворах неиз-, вестной концентрации.

К раствору навески метициллина в 96%-ном этаноле (объем пробы 5 мл) приливают 3,0 мл 0,05%-ного хлороформного раствора соединения ин;енсивно перемешивают и добавляют 0,5 мл 1 н. соляной кислоты. После встряхивания пробу оставляют на

1-2 ч для развития окраски. Под водным слоем окраска спиртохлороформной фазы устойчива свыше 3 сут на свету, без воды — более 5 ч. Для колориметрического определения спиртохлороформную фазу отделяют и сни-. мают экстинкцию (Е) на фотоэлектроколориметре ФЗК-56 М со светофильтром - 5 или более точно на спектрофотометре СФ-26 при длине волны

530 нм. Концентрацию метициллина опрецеляют по калибровочной кривой, построение которой описано в примере 3.

Можно проводить определение и в водном растворе метициллина. Для этого берут 0,1 мл водного раствора неизвестной концентрации, доводят объем пробы до 5 мл 96%-ным этанолом и обрабатывают пробу, как описано выше.

А . Взята навеска порошка, содержащего метициллин,,массой 6,30 мг.

Е, =0,312, E =0,302, Е „ =0,307, что соответствует по калибровочной криьой 6 мг.

Чистота препарата 95,2%..

6 . Взят 0,1 мл исходного водного раствора метициллина неизвестной концентрации. Объем доведен до 5 xh

96%-ным этанолом. EÄ=0,170, E =0,166, E =0,168, что соответствует йо калибровочной кривой 3,1 мг метицилли-; на. 0,1 мл исходного раствора содержит 3,1 мг метициллина. Содержание мет ициллина в растворе 31 мг/мл.

Как видно из примера, определение можно проводить, используя навеску или свежеприготовленный водный раствор метициллина.

Пример 3. Построение калибровочной кривой для определения метициллина.

Готовят шкалу растворов в 96%-ном этаноле с различным содержанием мети1циллина в каждой пробе (см. табл. 1).

1244148

Таблица 1

Объем КолиПроба! р спиртового чество метициллиЕ

E раствора (пробы), мл на в пробе, мг

1 5 0

2 5,0

3 5,0

4 5,0

5 5,0

6 5,0

0,055 0,040

0 095 0 100 2р

0,145 0,160

0,265 0,250

0,358

0,430

0,380

0,426

Т а б л и ц а 2

Оптическая плотность растворов, Е, при внесении l н. соляной кислоты, мл

Концентрация соединения 1,X

0,05 0,1 0,5 1,0 1,5 2,0

0,190 0,400

0,190 0,400

0,400 0,390

0,430 0,410

0 i 01

0,360 0,300

0,390 0,320.О, 02

Определение проводят по описанной методике. В качестве контроля сравнения используют 962-ный этанол, обрабатывая его, как описано в методике. 5

Результаты определения приведены в табл. 1

На чертеже приведен график покаl зывающий наличие прямой пропорцио- 30 нальной зависимости между содержанием метициллина в пробе и оптической плотностью окрашенного раствора.

П р е р 4. Определение метис циллина в смеси пенициллинов. 35

Готовят смесь карбенициллина, ампициллина, бензилпенициллина, оксациллина и метициллина (по 10 мг каждого антибиотика) и растворяют эту смесь в 5 мл 96Х-ного этанола. Про- 4р воднт определение содержания метициллина по методике, описанной в примере 2.

Оптическая плотность окрашенного раствора: Е„=0,475, Е =0,490, Е, = 45

=0.,495, что составляет по калибровочной кривой 9,75 мг метициллина.

Ошибка определения 0,25 мг, К =+5X.

Как видно из примера, испытанные пинипиллины — карбенициллин, ампициллин, бензилпенициллин и оксациллин не мешают определению метициллина.

При проведении реакции с водными растворами метициллина используют только свежеприготовленные растворы ввиду нестойкости метициллина. Нужно также соблюдать ряд условий для проведения реакции, подбор который описан в примерах 5-7 (порядок внесения компонентов, оптимальные соотношения компонентов, растворитель — реакционная среда).

П р е р 5. Влияние порядка внесения компонентов.

Готовят раствор 20 мг метициллина в 10 мл 967.-ного этанола и делят его по 5 мл в две прибирки. Первую пробу обрабатывают, как описано в методике по примеру 2, а во вторую пробирку приливают сначала 0,5 мл 1 н. соляной кислоты, а потом 3 мл 0,05X â€, ного хлороформного раствора соединения 3 . Во второй пробирке реакция не развивается. Таким образом, для развития реакции вносить компоненты необходимо в предлагаемом порядке.

Пример 6. Подбор оптимальных соотношений и концентраций компонентов реакции (соединения 1 и соляной кислоты).

Готовят .спиртовой раствор метициллина с содержанием 2 мг/мл. РазЛивают раствор по 5 мл в 54 пробирки. Готовят хлороформный раствор соединения I в пределах концентрации 0,01-0,2Х. По описанной в примере 2 методике проводят определение метициллина, изменяя в каждом ряду (см. табл. 2) концентрацию соединения 1 и количество вносимой 1 н. соляной кислоты. Нормальность соляной кислоты выбрана в связи с изученностью гидролиза метициллина.

В табл. 2 приведены результаты фотометрического определения в единицах оптической плотности (E)..

1?44148

Продолжение табл.2

Оптическая плотность растворов, Е, при внесении 1 н. соляной кислоты, мл

Концентрация соединения 1,Х

1,0 1,5 2,0

0,5

0,205 0,460 0,500 0,470 0,360 0,330

0,220 0,480 0,525 0,500 0,395 0,380

0,03

0,04

0,05 0,220 0,490 0,530 0,490 0,400 0„400

0,,06 0,220 0,480 0 505 0,480 0,370 0,360

0,270

0,07

0,400 0,420 0,4IО 0,400 0,380

0,10 0,275 0,380 0,400 0,405

0,395 0,390

0,390 О, 390

О, 20 О, 290 0,390 0,390 0,390!

Из табл. 2 видно, что максималь ная величина экстинкций наблюдается

1 в пределах концентрации соединения1 от 0,03 до 0,067. (оптимум при 0,05X) и в пределах количества внесенной

1 н. соляной кислоты от 0,1 до 1,0 мл (оптимум 0,5 мп).

Оптимальное соотношение компонентов (0,05Х-ного хлороформного раствора соединения 1, спиртового раствора метициллина и 1. н. соляной кислоты) по объему. соответственно 3:5:

:0,5 °

Пример 7. Влияние растворителя (реакционной среды) на развитие реакции соединения 1 с метициллином.

Установлено, что реакция соединения I с метициллином происходит в среде низших спиртов — метилового и этилового, хуже — в среде пропилового спирта. В спиртах с углеродной цепью больше, чем С, реакция не развивается. Прочие растворители, 45 кроме диэтилового эфира в слабой степени, также не дают развития реакции. В среде этанола образуется продукт малиновой окраски, в среде метанола — зеленой. ° 50

Пример 8. Определение чувствительности реакции соединения 1 с метициллином в чистом виде и в сыворотке крови.

Аналогично построению калибровоч- 55 ной кривой готовили ряд проб с содержанием метициллина менее 1 мг в пробе (см. табл. 3). По описанной метоцике проводили определение метициллина.

В опыте использовали сыворотку, полученную из донорской, абортной и плацентарной крови, а также смесь этих сывороток. Готовили ряд пробирок, наливая в них по 0,9 мл любой из названных сывороток крови. Отдельно разводили в физиологическом растворе матициллин и делали серию разведений, как при построении калибровочной кривой (содержание метициллина от 10 до 0,625 мг/мп). Из разведений брали 0,1 мл и вносили количество метнциллина в сыворотку крови. Содержание метициллина в пробе сыворотки соответствоваЛо его содержанию в 0,1 мл физиологического раствора из разведений.

Каждую пробу сыворотки обрабатывали для экстракции 5 мп смеси спирта с диэтиловым эфиром (1:1) или с хлороформом (1:1). Выбор растворителей обусловлен тем, что для экстракции пенициллинов из водных растворов используют именно эти растворители, как наиболее доступные, причем коэффициент распределения пенициллина в органической и водной фазе составляет для эфира 14:1, для хлороформа 37:1.

Через 2-3 ч экстракт фильтровали для удаления осадка и проводили с надосадочной жидкостью цветную реакцию по методике, описанной в примере .2. Результаты определения оптической плотности на СФ-26 приведены в табл . 3.

1244148

Т а б л и и а 3

Калибровочная шкала

Содержание метицилЭкстракт из сыворотки

E Е Е

Еь

Е лина в пробе, мг

0,056 0,050 0,040 0,050 0,045 0,043

0,025 0,030 0,030 0,025 0,025 0,020 .0,012 0,015 0,015 0,015 0,011 0,011

0,006 0,005 0,005 0,005 0,007 0,005

Не обнаруживается Не обнаруживается

1,0

0,5

0,25

0,125

0,063

Составитель В. Тихонов

Редактор К. Волощук Техред О.Сопко Корректор С. Шекмар

Заказ 3770/26 Тираж 379 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР. по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Как видно из табл. 3, чувствитель- 2б ность определения метициллина в сыворотке крови соответствует чувстви-тельности самой, методики и составляет 0,125 мг в 5 мл 96Х-ного этанола или экстракта (для последнего это 25 соответствует содержанию в 1 мл сыворотки крови).

Пример 9. Определение содержания метициллина .в сыворотке крови в модельном опыте на животных (in ЗО

vivo).

Кролику вводили внутримышечно 1 r метициллина и не позже, чем через

25-30 мин, брали кровь. Получали сыворотку крови и 1 мл ее обрабатывали, как описано в примере 8 (элюировали, фильтровали и проводили цветную реакцию с раствором соединения 1 ).

Определяли оптическую плотность (Е) окрашенной неводной фазы: Е, =0,058, Е =0,063, Е, =0,061, что составляет по калибровочной кривой 1,25 мг метициллина. Содержание метициллина в сыворотке крови 1,25 мг/мл.

Таким образом, возможно определение метициллина в сыворотке крови теплокровного животного.