Способ определения гидропероксидов липидов
Изобретение относится к биохимии . Цель изобретения - ускорение способа. Анализируемый образец вносят в инкубационную смесь и регистрируют скорость падения оптической плотности. Добавляют глутатион-S- трансферазу, отмечают оптическую плотность, регистрируют скорость ее уменьшения и рассчитывают количество гидропероксидов в пробе. (Л с со tsD Is: ел со
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИН
„.SU(e 1 2215
Ai (51)4 G 01 N 33 92 сяса@рр,@
I
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3892842/28-14 (22) 30.04.85 (46) 07.07.87. Бюл. У 25 (71) Всесбюзный кардиологический научный центр (72) В.З.Ланкин, А.К.Тихазе, Ю.Г.Осис и А.М.Вихерт (53) 616.07(088.8) (56) Anal. Biochem., 1976, v.76, N 2, р. 184-191. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИДРОПЕРОКСИДОВ ЛИПИДОВ (57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения — ускорение способа. Анализируемый образец вносят в инкубационную смесь и регистрируют скорость падения оптической плотности. Добавляют глутатион-Sтрансферазу, отмечают оптическую плотность, регистрируют скорость ее уменьшения и рассчитывают количество гидропероксидов в пробе.
1322153
Составитель И. Емельяненко
Техрер, А.Кравчук Корректор И,.Муска
Редактор С.Патрушева
Заказ 2856/39 Тираж 776 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, Изобретение относится к экспериментальной биохимии, конкретно к ме. торам анализа биологически активных веществ, и может быть использовано в клинической биохимии и медицине 5 при диагностике ряда заболеваний, Целью изобретения является ускорение способа за счет использования в качестве фермента — восстановителя глутатион-S-трансферазы.
Способ осуществляется следующим образом.
Анализируемый образец в количестве не более половины конечного объема испытуемой жидкости вносят в инкубационную смесь, содержащую (конечные концентрации) 5 ммоль ЭДТА, ммоль восстановленного глутатиона, 0,2 ммоль восстановленной формы нико" тинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ-H) и 1 ед/мл глутатион-редуктазы.
В течение 5 мин регистрируют скорость падения оптической плотности при 340 нм (Ч,). Затем добавляют
5 ед. глутатион-S-трансферазы, отмечают оптическую плотность при 340 нм (А,) и, регистрируя скорость ее уменьшения, отмечают время (Т), необходимое для достижения скорости Ч вЂ” величину оптической плотности при
350 нм (А ) в момент времени Т.
Количество гидропероксидов (М„„ ) в пробе (моль) рассчитывают по формуле 35
Ат=A=Vî Т гп 340 500 где Е 340 — коэффициент молярной. экстинкции при 340 нм (339 нм), равный 6,3"
-I -t х10 М см
Пример 1. Определение содержания гидропероксидов линолевой кислоты. К 16,9 нмоль гидропероксида линолевой кислоты добавляют 10 мкмоль
ЗДТА, 2 мкмоль восстановленного глутатиона, 0,4 мкмоль НАДФ-Н, 2 ед. глутатионредуктазы. Объем доводят буфером (50 ммоль К, Na-фосфатный, рН 7,4 и 50 ммоль СаС1 ) до 2,0 мл и проводят определение.
Результаты рассчитывают по указанной формуле А,=О; А =0,054; V
=0,0002; 7=5 мин; M,„ =16,8 10 моль.
Коэффициент корреляции 957. Процент ошибки 0,57..
Таким образом, способ обладает большей точностью и чувствительностью, чем известный ферментативный способ с использованием глутатионпероксидазы и в то же время является более специфичным, что существенно расширяет область его применения.
В инкубационной смеси не требуется присутствия фермента каталаэы, а количество основного (восстанавливающего гидроперекиси) фермента требуется в 50 раз меньше для проведения анализа готового образца за меньшее время. Кроме того, не требуется гидролиз этерифицированных гидропероксидов жирных кислот до свободных жирных кислот, что значительно уСкоряет проводимый анализ.
Формула и з обретения
Способ определения гидропероксидов липидов путем их ферментативного восстановления с последующей спектрофотометрией пробы, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью ускорения способа, в качестве фермента-восстановителя используют глутатион-Sтрансферазу.
