Способ получения рестриктазы hgai

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Цель изобретения - повышение выхода и чистоты фермента. Для достижения цели Haemophillus gallinarum В-2203 выращивают последовательно на твердой питательной среде, в которую вводят кровь в концентрации 0,3- 1,0%, а затем - на жидкой питательной среде, содержащей вместо крови НАД и гемин в концентрациях 2 и 10 мг/л соответственно. Клетки разрушают ультразвуком и фермент выделяют последовательной хроматографией на фосфоцеллюлозе и ДЭАЭ-целлюлозе. Полученный целевой продукт обладает активностью 700 ед/мл (250 ед/г биомассы) и не содержит детектируемых тестом рестрикция - легирование - рестрикция неспецифических нуклеаз.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению рестриктаз. Целью изобретения является увеличение активности и повышение чистоты фермента рестрикции из Haemo-phillus gallinarum (HgaI). Предложенный способ заключается в том, что штамм-продуцент Н. galimarum ВКПМ В-2203 выращивают сначала на твердой, а потом на жидкой питательной среде, при этом в состав твердой питательной среды вводят кровь в концентрации 0,3 1,0% При следующем разрушении клеток ультразвуком и выделении фермента хроматографией на фосфоцеллюлозе Р-11 и ДЭАЭ-целлюлозе ДЕ-52 получают целевой продукт, не содержащий детектируемых примесей неспецифических нуклеаз, и с выходом, в 5 раз превышающим известный. Выбор концентраций крови (0,3-1%) в составе твердой среды определяется следующими экспериментальными фактами: концентрация меньше 0,3% не приводит к повышению активности и чистоты фермента, концентрация от 1 до 5% не дает никакого преимущества по положительному эффекту и в то же время удорожает процесс, а при более высоких концентрациях (выше 5%) крови в составе питательной среды наблюдается ингибирование роста микроорганизма (увеличивается время удвоения культуры) и повышение содержания неспецифических нуклеаз в целевом продукте. Предложенный способ иллюстрируется следующим примером Получение рестриктазы HgaI. Культивирование Н. gallinarum. Клетки микроорганизмов предварительно выращивают на твердой среде следующего состава, г/л: Гидролизат кильки (дагестанский НИИПС 15 КН₂РО₄ 2 К₂HPО₄ 6 Агар 15 Все ингредиенты растворяют в дистиллированной воде. Среду стерилизуют во флаконах при 121^oС, 1 атм в течение 30 мин. Перед использованием среду расплавляют и при 45-50^oС добавляют стерильную дефибринированную кровь до конечной концентрации 1% НАД (V фактор) до концентрации 0,002 г/л. Клетки выращивают при 37^oС в течение 16-20 ч. Микроорганизмы смывают жидкой питательной средой (10 мл на чашку Петри) в колбы для выращивания и используют для засева ферментера. Культивирование проводят в ферментере объемом 20-40 л при 37^oС, аэрации 20 л/мин и перемешивании 200 об/мин на среде того же состава, что и агаризованная, кроме того, что вместо крови добавляют гемин (фактор X) до концентрации 0,01 г/л и НАД до 0,002 г/л, в среде отсутствует агар. Клетки выращивают до стационарной фазы, центрифугируют при 5000 xg в течение 10 мин. Выход биомассы по сырой массе 5 г/л. Выделение и очистка рестриктазы. 10 г клеток суспендируют в 40 мл (0,01 М) трис НС1 буфера с рН 7,5, разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе 10 раз по 30 с, клеточный дебрис отделяют центрифугированием при 5000 xg в течение 20 мин. Грубый экстракт наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р-11 размером 1,5-20 см, уравновешенную 0,02 М калий-фосфатным буфером с рН 7,5, содержащим 1 мМ β-меркаптоэтанола, 0,5 мМ ЭДТА и 5% глицерина (буфер А) Несорбированный на колонке материал элюируют 100 мл буфера А и фермент элюируют 450 мл линейного градиента NaCI (0-1,0 М). Активные фракции, элюируемые при 0,3-0,4 М, диализуют против буфера А и наносят на колонку с ДЕАЕ целлюлозой размером 1,5 ·10 см, уравновешенную буфером А. Фермент элюируют 200 мл линейного градиента NaCI (0-1 М). Фракции фермента, элюируемые при 0,05-0,1 М NaCI, диализуют против буфера А и концентрируют на колонке с фосфоцеллюлозой размером 0,9·4 см. Раствор фермента, полученный при элюации 1 М NaCI, диализуют против буфера А, содержащего 50% глицерина и хранят при-20^oС. Выход продукта составляет 250 ед. на 1 г биомассы. Полученный препарат имеет активность 700 ед/мл. Активность фермента определяют в инкубационной смеси, содержащей 1 мкг ДНК фага l 0,02 М трис-HCI буфер с рН 7,5, 0,01 M·MgCl₂, 0,001 М b -меркаптоэтанол. Инкубацию проводят при 37^oС, 1 ч, после чего к реакционной смеси добавляют глицерин до 20% и пробы подвергают электрофорезу в 1-ном агарозном геле. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимого для полного расщепления 1 мкг ДНК фага l при 37^oС в течение 1 ч. Сочетание предварительного культивирования на твердой среде с добавлением 0,3-1% крови и последующего выращивания на жидкой среде с X и V факторами в 3-5 раз увеличивает активность фермента HgaI. Препарат рестриктазы HgaI, полученный предлагаемым способом, не содержит примесей неспецифических эндонуклеаз, о чем свидетельствует гидролиз ДНК фага 7 l выделенным ферментом. Отсутствие неспецифических эндонуклеаз и фосфатаз подтверждается высокоэффективным легированием линейной молекулы ДНКр BR 322 после расщепления ее полученным ферментом. Правильность восстановления кольцевой формы плазмидной ДНК подтверждается повторным гидролизом рестриктазой HgaI с образованием аналогичных фрагментов.

Формула изобретения

Способ получения рестриктазы Hgal, включающий приготовление посевной культуры Haemophillus gallinarum ВКПМ В-2203 на твердой питательной среде, содержащей питательную основу, никотинамидадениндинуклеотид, фактор роста, агар и воду, последующий засев ею жидкой питательной среды, выращивание в оптимальных условиях, отделение клеток и выделение из них целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и чистоты ферментного препарата, при приготовлении посевной культуры в качестве питательной основы используют панкреатический гидролизат кильки, а в качестве фактора роста - донорскую кровь в количестве 3,0 10,0 г/л, в твердую питательную среду дополнительно вводят однозамещенный и двузамещенный фосфаты калия.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 36-2000

Извещение опубликовано: 27.12.2000        

---