Способ выделения и очистки бактериальной эндонуклеазы из культуральной жидкости sеrrатiа маrсеsсеus

 

Изобретение относится к области получения ферментов , в частности внеклеточной бактериальной эндонуклеазы. Целью изобретения является сокращение длительности процесса, повышение выхода и чистоты целевого продукта . Эндонуклеазу выделяют непосредственно из культуральной жидкости за одну стадию с помощью лигандообменной хроматографии на халатных сорбентах, содержащих группировки иминодиуксусной кислоты, заряженными ионами Си. Сорбцию эндонуклеазы проводят на колонке или в объеме. После промывки хелатного сорбента исходным буфером 0,1 М Na-ацетатным с рН 6,5-6,6, содержащим 0,3- 0,5 М NaCl, Эндонуклеазу десорбируют с выходом 65-95% тем же буфером, ио с рН 4,7-5,0. 1 табл. § (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

А1

„„SU„„1392902 (5!)5 С 12 N 9/22

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ(СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (46) 07.05.90. Бюл. М- 17 (21) 4114042/31-!3 (22) 01.09.86 (71) Институт элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова (72) Г, Е, Банникова, В. П. Варламов и С. В. Рогожин (53) 577 ° 15(088.8) (56) филимонова Н. М., Баратова Л. А,, Воспельникова Н. Д., Желтова А. О. и Лещинская И. Б, Эндонуклеаза

S. аагсеввепв. Характеристика фермента. Биохимия, 1981, 4Ь, !ЬЬ0-1667, Варламов В. П., Лопатин С. А. и Рогожин С. В. Лигандообменная хроматография ферментов . I Синтез хелатных сорбентов и очистка экэонуклеазы А5 актиномицетов. Биоорганическая химия, 1984, 10,927-934.

Авторское свидетельство СССР

У 1146321, кл. С 12 N 9/22, 1983. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ БЕККАТ?А МАКСЕБСЕЧ$ (57) Изобретение относится к области получения ферментов, в частности внеклеточной бактериальной зндонуклеазы ° Uerbs изобретения является сокращение длительности процесса, повышение выхода и чистоты целевого продукта, Эндонуклеазу выделяют непосредственно из культуральной жидкости эа одну стадию с помощью лигандообменной хроматографии на хелатных сорбентах, содержащих группировки иминодиуксусной кислоты, т+ заряженными ионами Си Сорбцию эндонуклеазы проводят на колонке или в объеме. После промывки хелатного сорбента исходным буфером 0,1 М Na-ацетатным с рН 6,5-6,6, содержащим 0,30,5 M NaC1, эндонуклеазу десорбируют с выходом 65-95Х тем же буфером, но с рН 4,7 5,0. 1 табл.

02 м

Сц

35

1 13929

Изобретение относится к области получения ферментов, в частности внеклеточной бактериальной эндонуклеаэы.

Эндонуклеаза применяется в молекулярS ной биологии, биоорганической химии, а также в ветеринарии.

Целью изобретения является сокра" щение длительности процесса, повы" шение выхода и чистоты целевого про- fp дукта. Эндонуклеазу выделяют из культуральной жидкости ВКПМВ-2379 sa одну стадию с помощью лигандообменной хроматографии на хелатных сорбентах, содержащих группировки иминодиуксус- f5 ной кислоты (ИДК), ааряженные ионами

1+

Cu . Получение таких сорбентов описано в работе. Общая формула

ОН СН СОО

/ *

P-О-СН -СН-СН -И

CHfC0O где P - органический носитель и

СяаС® 30

/*

P -0-81-(СЯФ), -0-Са -СН-СН,-М С„",, СН СОО где P — - неорганический носитель.

Метод лигандообменной хроматографии основан на способности белков образовать комплексы с ионами переI ходных металлов, В процессе комплексообразования участвуют некоторые функциональные группы аминокислотных остатков поверхности белков, преимущественно имидаэольные и тиольные.

Стационарная фаза представляет собой хелатные сорбенты, заряженные ионами переходных металлов; которые взаимодействуют с разделяемыми соединениями путем образования координационных связей. В отличие от других видов хроматографии в этом процессе сорбция белков может происходить в присутствии высоких концентраций солей, неионных детергентов н некоторых органических растворителей, что позволяет выделять фермент непосредственно из культуральной жидкости.

Оказалось, что при рН Ь,5-6,6 из культуральной жидкости спрбируется преимущественно эндонуклеаэа, а прочие белки остаются в растворе. Поэто" му при выделении фермента рН культуральной жидкос ти доводят до 6, 5-6, 6.

Сорбцию эндонуклеаэы на хелатном сорбенте проводят на колонке с соотношением белок:сорбент 6 ед.А :1 см при скорости 15-20 мл/ч илн в объеме с соотношением белок:сорбент 1 0-12 ед.

А, :1 см . После промывки хелатного сорбента исходным буфером 0,1 М Naацетатным с рН 6,5-6,6, содержащим

0,3-0,5 М NaC1 эндонуклеаэу десорбируют с выходом 65-95Х тем же буфе" ром, но с рН 4,7-5,0. Наличие в используемых буферах 0,3-0,5 М NaC1 обеспечивает подавление ионообменных взаимодействий. Использование более высоких концентраций NaCl нецелесообразно.

Пример 1. К 3 мл ИДК-агароэы (29 мкмолей/мл), заряженной ионами

Си и промытой 0,1 М Na-ацетатным буфером рН 6,5, содержащим 0,5 М йаС1, добавляют 30 мл культуральной жидкости (7,5 ед. А /мл и 7400 ед. акт/мл) и рН 6,5 и перемешивают при комнатной температуре на качалке в течение

0,5 ч. Переносят в колонку и со скоростью 17 мл/ч промывают 0,1 М 11аацетатным буфером рН 6,5, содержащим

0,5 M NaCl, до отсутствия поглощения при 280 нм. Десорбируют эндонуклеаэу тем же буфером при рН 5,0. Выход по активности 95Х, степень очистки 50 раэ, удельная активность 182000 ед. акт./мл белка.

Пример 2 ° На колонку, содержащую 1 мл хелатного сорбента ИДКтойоперла HW-55 (36 мкмолей/мл), уравновешенную О > I М Na-а цета тным б уфером рН 6,6 с 0,3 М NaCl со скоростью 15 мл/ч наносят 10 мл культуральной жидкости (5,4 ед. А,,/мл и

5600 ед акт/мл) с рН 6,6, отмывают

0,1 М Na-ацетатным буфером рН 6,6, содержащим 0,3 М NaC1 до отсутствия поглощения при 280 нм. Десорбируют эндонуклеаэу тем же буФером при рН

4,7. Выход по активности 80Х, удельная активность 200000 ед, акт./мг белка.

Пример 3. Аналогично примеру 2, но в качестве хелатиого сорбента используют ИДК-силохром (19 мкмолей/мл). Выход по активности

65Х, удельная активность 10()000 ед. акт./мл белка.

1392902

Формула изобретения

Сопоставительная таблица

Способ Длительнос ть

Удельная активВыход, Х процесса, ч ность ед.акт/мг белка

Предлагаемый

7-10

65-95 200000

Известный 80-100 30-50 60000

Составитель Н. Ходврев

Техред М. Ходанич Корректор А. Эимокосов

Редактор О, Филипова

Тирах 478

Подписное

Заказ 1542

ВНИИЛИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ухгород, ул. Проектная, .4

П р н и е р 4. Аналогично примеру 2, но сорбцию фермента проводят при рН 6,0, в десорбцию при рН 5,5.

Выход по активности ЗОХ, удельная ак- 5 тивность 150000 ед. акт/мг белка.

П р и и е р 5. Аналогично примеру 2, но сорбцню фермента проводят при рН 8,0 в 0,005 М трис-НС1 буфере, содерхащем 0,5 М NaС1, а десорбцию 10 при рН 4,0, О,! М Na-вцетатным буфером, содерхащим 0,5 М NaC1. Выход по активности 28Х, удельная активность

60000 ед. акт/мл белка.

Таким образом, проведение процесса сорбции нуклеаэы нв хелатнои сорбенте в объеме позволяет значительно сократить время выделения фермента до 6-7 ч и с выходом 65-95Х получить препарат, содерхвщий не менее 75Х 20 нуклевэы (определяют сканированием гелей после электрофореэа).

Способ выделения и очистки бактериальной эндонуклеазы нз культуральной хидкостн 8erratla шагсеасепв штамма ВКПМ В-2379 с использованием . методов хроматографии, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью сокращения длительности процесса, повыщения выхода и чистоты целевого продукта, выделение и очистку проводят непосредственно из культуральной хидМости лигандообменной хроматографией на хелвтных сорбентах, содерхащих ииинодиуксусные группировки, sa2+ ряхенные ионами CU при этом сорбцию ведут при рН 6,5 - 6,6, а десорбцию при рН 4,7 - 5,0 натрий-ацетатньм буфером, содерхащим 0,3 — 0,5 Н хлористый натрий.