Способ определения аргинина

 

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к определению аргинина (Arg)B смеси аминокислот . С целью повьппения специфичности определения и упрощения способа анализируемый раствор предварительно нейтрализуют до рН 6,9-7,1, затем добавляют хлороформ.Полученную смесь обрабатывают раствором бромтимолового синего с рН 4,0, перемешивают до стабильности окраски. После расслоения фаз отделяют хлороформный слой, обрабатывают часть его 0,1 М раствором NaOH, а после расслоения смеси фотометрированию подвергают водный слой. Процент откры.- тия добавленного Arg находится в пределах 94,4-100%, 6 табл. (Л

COOS СОВЕТСКИХ

СООИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСГ!УБ ЛИК

yI) 4 С 01 N 21/78

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4124521/28-04 (22) 11 ° 07.86 (46) 23.05.88.Бюл. !! 19 (7I) Винницкий медицинский институт им,Н.И.Пирогова (72) А.А.Пентюк, Б.А.Борисенко

В.И.Гуцол (SU) и Рамадан Хусейн

Аль-Хадур ($1 ) (53) 543.432 (088 8) (56) Асатиани В.С. !!абораторные методы исследования. — М.: Медицина, !

965, с.186.

Коренман И.M. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений. — М.: Химия, !975, с.80.

„„SU„, /397808 А (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АРГИНИНА (57) Изобретение относится к аналитической химии, в частности к определенив аргинина (Arg)в смеси аминокислот. С целью повьппения специфич.ности определения и упрощения способа анализируемый раствор предварительно нейтрализуют до рН 6,9-7,1, затем добавляют хлороформ. Полученную смесь обрабатывают раствором бромтимолового синего с рН 4,0, перемешивают до стабильности окраски. После расслоения фаз отделяют хлороформный слой, обрабатывают часть его

О,l М раствором NaOH, а после расслоения смеси фотометрированию подвергают водный слой. Процент открытия добавленного Arg находится в пределах 94,4-100Х 6 табл.!

397808

15

Таблица I

3,0 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5 0 6,0 рН раствора

Оптич,плотнос ть

0,05 0,24 0,37 0,30 0,40 0,38 0,24 0,23 0,20 аргинина

Изобретение относится к биохимическим методам исследования и может быть использовано при определении аргинина в смеси аминокислот, например в лекарственной смеси "Альвеэин" или искусственных питательных средах.

Цель изобретения — повышение спе-, цифичности определения и упрощение способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Реактивы: 0,05Х-ный водный раствор бромтимолового синего с рН 4,5 (для доведения значения рН до 4,5 используют 0,01 И НС1)1 хлороформ;

0,1 М раствор гидроксида натрия.

Смесь аминокислот "Альвеэин" доводят по рН-метру до рН 7,0 (исполь- 2р зуют 0,01 М раствор НС1 или 0,01 М раствор гидроксида натрия). Отбирают пробы с примерным содержанием аргинина 0,12 — 0,6 мкмоль, прибавляют 3 мл хлороформа и 2 мл 0,05Х-но- 25

ro раствора бромтимолового синего с рН 4,5. Перемешивают пробы перевоПеремешивание смеси аминокислот, 40 хлороформа и раствора бромтимолового синего ведут до образования постоянной окраски хлороформного слоя, что свидетельствует о полном извлечении гидрофобного комплекса аргинина и 45 бромтимолового синего в хлороформ.

Эту операцию можно контролировать визуально по отсутствию нарастания желтой окраски хлороформного слоя при перемешинании. 50

Перемешивание ведут путем переворачивания пробирок, избегая вспенивания проб, поскольку это приводит к завышению реэупьтатов. Экспериментально установлено, что для полного извле 55 чения комплекса аргинин-бромтимоловый рачиванием пробирок (40 переворачияаний).После полного расслоения фаэ отбирают из хлороформного слоя (цижней фазы) 2 мл окрашенного в желтый цвет раствора и перенося г в другую пробирку, содержащую 3 мл 0,1 II раствора щелочи, и встряхивают до полного обесцвечивания хлороформного слоя

После полного расслоения отбирают ок— рашенный в синий цвет верхний слой и фотометрируют при 590 нм в кювете с длиной светового пути 1 см иа спектрофотометре или колориметре против xo- лостой пробы (которую готовят так же, но вместо смеси аминокислот обрабатывают такой же объем воды).

Зависимость чувствительности способа определения аргинина от значении рН раствора бромтимолового синего приведены в табл.1.

0,053-ный раствор бромтимолового синего должен иметь значение рН н пределах 4,0-4,6, поскольку в этом интервале значений рН достигается максимальная чувствительность метода (табл 1) 1 синий в хлороформ необходимо ие более

40 переворачиваний пробирок. Обнаружено также, что гидрофобный комплекс аргинин-бромтимоловый синий полностью переходит в хлороформный слой и в том случае, если пробы, не перемешивая, оставить на сутки и более.

Специфичность определения аргинина по предложенному способу была проверена по отношению к другим аминокислотам при различных значениях рН раствора бромтимолового синего (табл.2). Иэ табл.2 следуе<, ч:.о в укаэанных условиях определения метод практически полностью специфичен для

1397808

Таблица 2

Оптическая плотность при различных значениях рН раствора бромтимолового синего

Аминокислоты

4,5

4,6

4,4

4,0

0,005

0,007

0,006

0,01

Лизин

0,009

Нор-валин

0,01

0,006

0,010

Цис теин

Орнитин

Триптофан

Алании

0,008

Гистидин

О, 016

0,0I 6

Валин

Серии

Нор-лейцин

0,002

0,004

0,005

Глутаминовая кислота

Фенилаланин

0,008

0,004

Аспарагин

Глутамин

Лейцин

0,005

О, 010

0,001

0,008

Аспаргиновая кислота

0,002

0,004

0,OI 0

Глицин

Пролин

Метионин

0,012

Треонин

О, 014

0,381

0,022

0,408

Бета-алании

0,366

0,398

Агни

П р и м е ч а н и е. Растворы аминокислот доведены 0,01 М раствором едкого натрия до рН 7,0. Для исследования взяты пробы аминокислот, содержащие по 0,6 мкмоль каждой аминокислоты.

0,015

0,015

0,010

0,012

О, 015

0,010

О, 009

0,009

О, 010

0,006

0,011

О, 001

0,002

0,008

0,011

0,009

0,002

0,002

0,004

1 397808

Таблица4

Оптическая плотность

Ко а ргинина мкмоль мкг

0,090

0,170

0,260

0,350

0,12

О.?4

20.9

41,8

Т а б л Р ц а 3

62.8

0,36

Параметры тическая плотчость

0,48 83,8 проб

104, 7 0,430

0,60

Х вЂ” О 486

0,50„

0,500

8 — Ϋ0204

0,46О

0,505

0,455

0.495

О 4ЯГ, Содержание аргинина

«;,пр, -"C. J

Ъ предложенным жения способом

3«3 г/л

3, 15 г/л 95,4i. ошибка.

S — соедняя

«вацоатическая ошибка.

V — коэ хЬициРоспроизводимость метода определенияя аргинина проверена при папал-! ельных опрепел н ях одной ч той же пр->бы (0,7 «»<«no ) аргинина (табл.3)

П лученние денчые свийРтельствуи т с досяточио хороших метрологических =раметрах способа определения арги.ч: а (низкий разброс данных в парал\

«нных оппеделениях) « - « а н и Р: Х-Гоепчяя арн мети .еская ент вариации.

Чувствительность метода определения аргинина в указанных условиях

"ncтавляет 0,12 мкмоль аргининг.. Линейная зависимость межцу количеством аргчнина и оптической плотностью расайвора сохраняется в диапазоне кон

»ентраций 0,12-0,6 мкмоль (табл.4)., ч ." достаточно пля постооенчя калибровочной кривой.

11озможность опрепеления аргинича в присутствии дрчгих аминокислот была проверена также на искусственно приготовленной смеси аминокислот и лекарственной смеси аминокислот

"Альвезин", к которым добавляли известные количества аргинина. Опре25 деление аргинина в лекарственной смеси Альвеэин" (препарат> как указано в рецептуре, содержит 3,3 r/.i аргиннна) представлено в табл.5. l à á ë H ö ÿ 5

Обнаружено 7 обиару40 Определение аргинина в смеси аминокислот при добавлении известных количеств аргинина в искусственную смесь аминокислот (в 25 мл воды растворили 200 мкмоль лизина, нор-Hd лина, цистеина, орнитина, триптофана, аланина, гнс идина, валина, серина, нор-лейцина, глутаминовой кислоты, фенилаланчна, аспарагина, лейн»на, иэолей»ина, глутамина, аспара-гиновой кислоты, глипчна, пролина, 50 треонина H метиончна) или в лекарственную смесь аминокислот "Альвезин" препставлено в табл.6.

1 397808

Таблицами

Смесь аминокислот "Альвезин"

Смесь аминокислот

Х откры,добавлено Открыто 7. открыаргинина аргинина тия

Добавлено аргинина

Открыто аргинина тия

0,36

0,349

0,660

96,9

0,36

0,34

94,4

0,6

100 формула изобретения

Способ определения аргинина путем обработки раствора анапизируемой пробы цветореагентом с последующим

Составитель Л.Русанова

Редактор В . Данко Техред Л. Олийнык Корректор Г.Решетн к

Заказ 2599/42 T: ðàæ 847 Подписное

В1ИНП!11 Государственного комитета СССР го делам изобретений и открытий

l1 I0> >, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Прои зв л< т eлц 1 — цо.цы рафическое предприятие, г. Ужгород, ул. 11роек гния, 4

Результаты исследований свидетельствуют, что предложенный способ открывает аргинин в лекарственной смеси "Альвезин" в количествах, совпадающих с указанными в рецептуре, процент открытия добавленного аргинина находится в пределах 94,4-IOOX.

Таким образом, предложенный способ является более простым и специфичным, чем известный. фотометрированием полученного окрашенного раствора, о т л и ч а юшийся тем, чт о, с целью повышения специфичности определения и уп20 рощения способа, анализируемый раствор предварительно нейтрализуют до рН 6,9-7,1, добавляют хлороформ, в качестве цветореагента используют раствор бромтимолового синего

25 с рН 4,0-4,6, смесь перемешивают до стабильности окраски, после расслоения фаз отделяют хлороформный слой, обрабатывают часть его О,IM раствором гидроксида натрия и после рас30 слоения смеси фотометрированию подвергают водный слой.