Способ определения азотсодержащих лекарственных веществ основного характера в ткани печени

 

Изобретение относится к фармации, а именно к химико-токсикологическому анализу для определения азотсодержащих лекарственных веществ основного характера в печени. Целью изобретения является упрощение способа. Сущность изобретения состоит в том, что выявляют оптимальные условия экстракции и очистки введенного в ткань нейтрального красного и используют их для определения азотсодержащих лекарственных веществ основного характера.

А1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ()9) (11) 15ц 4 G 01 N 33/48

И.». "OI3HAH

Н" 1а 1 .::аЫЫ ,Б "1,1Q, Е..А

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К A ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4317146/28-14 (22) 19,10.87 (46) 15.09.89. Бал. 11 - 34 (71) Алтайский государственный медицинский институт им. Ленинского комсомола (72) В. А. Карташов и В, А. Кнауб (53) 6 12 . 015 (088. 8) (56) Титова А.В. Изучение процесса экстракции лекарственных соединений из биоло гическо ro материала — Ав тореф. на соиск. учен. степени канд. фарм. наук, М., 1984.

Изобретение относится к фармации, точнее к химико-токсикологиче скому анализу для определения азотсодержащих лекарственных веществ основного характера в ткани печени.

Цель изобретения — упрощение способа при сохранении точности.

Сущность изобретения заключается в том, что в отличие от известного способа определения лекарственных веществ в биологическом материале, согласно изобретению перед экстракцией вводят в ткань печени -нейтральный красный (НК), выявляют оптимальные условия его экстракции и очистки и используют их для определения азотсодержащих лекарственных веществ основного характера.

Пример 1, В качестве экстрагентов используют водные растворы

2 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЬК ВЕЩЕСТВ ОСНОВНОГО

ХАРАКТЕРА В ТКАНИ ПЕЧЕНИ (57) Изобретение относится к фармации, а именно к химико-токсикологическому анализу для определения азотсодержащих лекарственных веществ основного характера в печени. Целью изобретения является упрощение способа. Сущность изобретения состоит в том, что выявляют оптимальные условия экстракции и очистки введенного в ткань нейтрального красного и используют их для определения азотсодержащих лекарственных веществ основного характера. 5 табл. кислот: соляной, серной, уксусной, щавелевой, и органические растворители — этанол, ацетонитрил, ацетон.

Экстракцию и последующее количественное определение проводят по следующей методике.

К 5,0 г ткани печени, измельченной на мясорубке, добавляют 0,5 мл

0,1Х-ного водного раствора нейтрального красного, тщательно перемешивают и оставляют на 2 ч (прн большей экспозиции наблюдалось разложение нейтрального красного, что доказывалось методом тонкослойной хроматографии). Затем к печени добавляют

5,0 мл соответствующего экстрагента и экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 10 мин, центрифугируют 5 мин при 2,5 тыс. об/мин, Экстракты сливают во флаконы, операцию

3 1508 I5 экстракции и центрифугирования повторяют еще 3 раза, сливая экстракты в новые флаконы. Параллельно получают экстракты из печени, не содержащей НК, к которым после экстракции добавляют

0,1 мл 0,1Х-ного раствора нейтрального красного (стандартные пробы). Кроме то го, анализируют холо стые пробы.

Все экстракты подщелачивают 50Х-ным раствором едкого натра до рН 10-11, добавляют 5,0 мл воды, 10,0 мл хлороформа, встряхивают и центрифугируют как описано выше. Органические фазы отделяют, фильтруют через небольшие бумажные фильтры, отбрасывая первые порции фильтрата. Оптические плотности измеряют с помощью спектрофотометра СФ-26 в кюветах 1 см при длине волны 525 нм относительно хлороформа, 20

Затем к раствору в кювете добавляют

l каплю насыщенного раствора трихлоруксусной кислоты в хлороформе, перемешивают и вновь измеряют оптическую плотность при той же длине волны. 25

Разность (ДД) между оптическими плотностями прямо пропорциональна концентрации НК, закон Бугера соблюдается в интервале концентрации 1,5-15 мкг/мл.

Примеси из ткани печени (в холостых 30 пробах) влияния на количественное определение не оказывали, т..е. не дают изменения оптической плотности в описанных условиях. Расчет количественного содержания НК в процентах прово- 35 дят по формуле . ьД исс 0, .1 100 р)

6 Дду 0,5 где ЬДд д и ДД д - разность между 40 оптическими плотностями растворов исследуемых и стандартных проб соответственно.

Результаты экспериментов приведены в табл. 1. 45

Из табл. 1 видно, что перспективными экстрагентами являются этанол, ацетонитрил, ацетон. Из них как наиболее доступный и дешевый выбран ацетон. При использовании в качестве экстрагента ацетона извлечения, полученные на 1-й ступени экстракции, содержали меньше соэкстрактивных веществ, чем на последующих трех (no ультрафиолетовым спектрам абсорбции нулевьк проб, по образованию эмульсии при экстрагировании хлороформом). Содержание воды в ткани печени людей б 4 колеблется в пределах б0-75, т.е. в 5,0 r печени содержится около 33,7 мл воды, В процессе экстракции ацетон смешивается с водой (в соотношении приблизительно 5:3). Использование на 2, 3, 4-й ступенях экстракции вместо ацетона смеси ацетона с водой в соотношении 5:3 не влияло на выход НК и и то же время уменьшило количество примесей, поэтому в качестве оптимального экстрагента на

l-й ступени экстракции используют ацетон, на 2, 3, 4-й — смесь ацетона и воды в соотношении 5:3, Пример 2. Выбор степени измельчения ткани печени. Для проверки влияния измельчения ткани печени на выход НК были поставлены опыты на экспериментальных животных (собаках) по следующей методике, Собаке весом 10 кг через зонд вводят

0,5 г нейтрального красного в виде водного раствора, Через 1,5 ч животное умертвляют с помощью электрического тока. Часть печени измельчают с помощью гомогенизатора (РТ-1-У4-2

8000 об/мин), часть — с помощью мясорубки, имеющей решетки с различным диаметром отверстия: 4,5 мм (Рд);

7,5 мм (Р ); 10,5 мм (Р4) „13 мм (Р5), а также берут для анализа цельные кусочки печени размером

l l х4 5 см (Р ). Затем к 5 0 г ткани печени различной степени измельченности добавляют по 5,0 мл ацетона и получают экстракты по описанной методике.

Результаты эксперимента представлены в табл, 2.

Дисперсионный анализ результатов, представленных в табл. 2 показал, что различия между оптическими плотностями при различной степени измельчения значимы (по критерию Фишера), а в случае исследования цельных кусочков (P ) результаты существенно ниже остальных. При сравнении оптических плотностей растворов, полученных при исследовании печени со степенью из мельчения Р< -P, значимых различий . нет (по критерию Дункана). За оптимальную степень измельчения ткани печени принимают измельчение с помощью мясорубки с диаметром отверстий решетки 4,5 мм, Hp и м е р 3. Выбор продолжительности экстракции., Собаке весом

5 15081

10 кг через зонд вводят в желудок

0,5 r НК в виде водного раствора, Через 1,5 ч собаку умертвляют. Печень измельчают с помощью мясорубки

5 и экстрагируют в течение разного времени (10, 35 и 60 мнн) по описанной методике.

Результаты эксперимента представлены в табл. 3. l0

Данные табл. 3 показывают, что увеличение продолжительности экстрак— ции от 10 до 60 мин влияния на выход

НК из ткани печени не имеет. Продолжительность экстракции !О мин оптимал ьн а, H p и м е р 4. Выбор оптчмальных условий очистки. Отделение ацетона от воды с одновременной экстракцией

НК в ацетон .. Для этой цели применяют 20 безводный карбонат калия, при добавлении которого в избытке к ацетоно— водному экстракту и встряхивании про- . исходит разделение ацетона и воды (высаливание ацетона) и гомофазная 25 экстракция НК в ацетоновый слой. Выход НК в процентах, определенный по описанной методике, составил 97%.

Пример 5. Выбор условий реэкстракции нейтрального красного в 30 соляную кислоту.

К ацетону добавляют смесь эфира и гексана. Для выбора оптимальных условий на этой стадии применяют планирование эксперимента методом крутого восхождения. В качестве факторов рас— сматривают: Х1 — объем смеси эфир гексан, мл; Х вЂ” процентное содержание эфира в смеси эфир —; Х вЂ” объем 0,5 н.раствора соляной кислоты, 0

Критерием оптимизации (У) является выход нейтрального красного в процен— тах, который определяют по следующей методике. К высаленному ацетону добавляют определенные количества смеси эфир — гексан и 0,5 н,раствора соляной кислоты. Встряхивают и центрифугируют в течение 5 мин при 2,5 тыс. об/мин, Водную фазу отделяют и измеряют оптическую плотность при длине волны 525 нм. Расчет процентного выхода НК проводят по стандарту, добавляют О,i мл 0,1%-ного раствора НК к соляно-кислому реэкстракту. После реализации полного факторного экспериметра (см. табл. 4) оптимальными

56 6 оказ ались следующие условия; объем смеси эфир — гексан (в расчете на

10,0 мл ацетона) 15,0 мл; соотноиение эфир — гексан в смеси 1:1; объем0,5 н. раствора соляной кислоты 1,5 мл.

Дчя более полной реэкстракции НК операцию повторяют дважды.

Пример 6 ° Выбор условий эк- стракции HK в органический растворитель, Подщелачивание соляно-кислого реэкстракта до рН 10-11 50%-ным раствором гидроксида натрия, насыщение кристаллическим хлоридом натрия и последующая экстракция 10,0 мл эфира обеспечивают выход НК, равный 95-97%.

Таким образом, выход НК на этапах экстракции из ткани печени и последующей очистки составил в среднем 80%.

Пример 7. Использование выявленных оптимальных условий экстракции и очистки для определения азотсодержащих лекарственных веществ основного характера в ткани печени.

Лекарственные вещества основного характера (имизин, но-шпа, верапамип) экстрагируют и очищают в условиях, выявленных для НК по описанной методике. Количественное определение проводят после испарения эфира и растворения остатксв в спирте. Оптические плотности растворов определяют с помощью спектрофотометра

СФ-26 в кювете 1 см при длинах волн соответственно для имизина, но-raraы, верапамила при 254, 360 и 228 нм, При количественном определении учитывают фоновое поглощение примесей, Выход имизина, но-шпы и верапамила (см. табл, 5) коррелирует с выходом НК.

Формул а из обретения

Способ определения азотсодержащих лекарственных веществ основного характера в ткани печени, включающий их экстракцию и последующую очистку, о тл и ч а ю шийся тем, что, с це- . лью упрощения способа при сохранении точности, экстракцию и очистку проводят в условиях, аналогичных экстракции и очистке введенного в ткань нейтрального красного.

1508156

Т а б л и ц а 1

Выход нейтрального красного в .процентах по ступеням экстракции и в сумме

По ступеням экстр акции

Растворитель

Ч Т т п 1 тп zv

0,1 н.раствор серной кислоты

0,1 н, раствор соляной кислоты

10Х-ный раствор уксусной кислоты

107.-ный раствор щавелевой кислоты

Этанол

Ацетонитрил

Ацетон

4.,3 23,6 :2,0

4,3 28,9 3,0

l 2,4 62.,2+10,4

10 4

4,8!

4,1

9,2

l2,4

9,.9

1 I, 7

38 3М,4

86 „4к4,6

86,2+3,2, 94, 746,2

7,9

6,6

4,7

6„5

11,9

44.""

44р9

51р2

9,3

22„.7

26,7

25,3

T E 6 JI P U Q 2

Экстракцпя нейтрального красного из ткани печени разной степени измельчения (приведены значения в единицах оптической плотности хлороформно-ацетоновых экстрактов) Степень измельче з

P ния

<+ g х 2,366 0„043 2,275з0,071 2.319 0,027 2,346+0,119 . .,301 : 0,101 0,916+0,2!2

Т а бл и ц а 3

Экстр акция нейтрального красного в течение рваного времени (в единицах оптической плотности хлороформно-ацетановьх экстрактов) Продолжительно сть экстракции, мии

Х -I),x

l,060 -0,026 1,085%,100 1,061 0,05

1508156

Таблица 4

План факторного эксперимента иа стадии реэкстракции нейтрального красного в 0 5 н.раствор соляной кислоты

Факторы

Опыт, У

Объем 0,5 н. раствора соляной кислоЭфир в смеси, X

Объем смеси эфир-гексан„ мл т.ы, мп

Таблица 5

Определение имизина, íî-mrna верапамила в ткани печени

Лекарственные вещества

Выход, X

76,7 +3,5 81 О+1,3

84,4 2,3 т

Имиэин

Но-шпа

Вер апамил

Со ст ави тел ь А, Скурат

Техред N.Èopãåíòàë Корректор А.Обручар

Редактор И. Келемеш !

Заказ 5 5 36/48

Тираж 789

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". г.ужгород, ул. Гагарина, 101

2

4

6

10 !

О

2

2

1

1

89,1

86,5

86,5

85,2

73,3

88,7

78,2

79,9