Способ определения аденозинтрифосфата в мозге экспериментальных животных

 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения АТФ в ткани мозга. Цель изобретения - упрощение способа при одновременном расширении его функциональных возможностей. Цель достигается тем, что из ткани мозга выделяют митохондрии, определяют скорость использования введенного АДФ (аденозинтрифосфата) АДФ/T, а концентрацию АТФ рассчитывают по величине АДФ/T. В условиях нормоксии расчет ведут по формуле Y=0,012471<SP POS="POST">.</SP>X+1,875228, где X - скорость использования введенного АДФ (АДФ/T), а Y - концентрация АТФ. При определении концентрации АТФ в условиях высотной гипоксии дополнительно измеряют высоту подъема H, время T пребывания животных в условиях дефицита кислорода, а концентрацию АТФ рассчитывают по выражению Y=φ<SB POS="POST">0</SB>(T)X+φ<SB POS="POST">I</SB>(T), где X - скорость использования введенного АДФ (АДФ/T)

φ<SB POS="POST">1</SB>(T), φ<SB POS="POST">1</SB>(T) - рассчитанные по формуле (2) значения функций φ<SB POS="POST">I</SB>(T), зависящих от T

Y - концентрация АТФ. φ<SB POS="POST">I</SB>(T) = A<SB POS="POST">2</SB>+A<SB POS="POST">0</SB><SP POS="POST">.</SP>COS A<SB POS="POST">1</SB>/T, где A<SB POS="POST">0</SB>, A<SB POS="POST">1</SB>, A<SB POS="POST">2</SB> - эмпирические коэффициенты, значения которых зависят от H. Изобретение позволяет быстро определить содержание АТФ в мозге и одновременно характеристику митохондрий - значение АДФ/T в условиях нормоксии и гипоксии.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (у)5 С 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

Ilo изОБРетениям и ОТКРытиям пРи Гннт сссР,:..— --.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИР -, (21) 4263142/28-14 (22) 15.06.87 (46) 15. 03. 90. Бюл. Р 10 (71) Горьковский государственный медицинский институт им. С.N. Кирова и Горьковский политехнический институт (72) E,Ã1. Хватова, В,М. Галкин, А.H.Мошкова, Е.Н.Шуматова, ь

Г.В.Миронова и А.Н.Сидоркина (53) 612.015(088.8) (56) Ещенко Н.Д. Методы биохимических исследований. Л.: Наука, 1982, с. 256- 258. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТА В МОЗГЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения

АТФ в ткани мозга. Цель изобретения— упрощение способа при одновременном расширении его функциональных возможностей, Цель достигается тем, что из ткани мозга выделяют митохондрии, определяют скорость использования

Изобретение относится к биохимии, а именно к биоэнергетике, и может быть использовано в экспериментальной медицине для определения концентрации аденозинтрифосфата (АТФ) в ткани мозга при комплексном исследовании функциональной активности митохондрий и эффективн ости про це ccoB окислительного фосфорилирования в мозге.

„„SU,, 1549924 А1

BB еденного АДФ (аденозиндифосфата) АДФ/г., а концентрацию АТФ рассчитывают по величине АДФ/t В условиях нормоксии расчет ведут по формуле у=0,012471 ° х+1,875228, где х— скорость использования введенного

АДФ (АДФ/t), а у — концентрация АТФ.

При определении концентрации АТФ в условиях высотной гипоксии дополнительно измеряют высоту подъема h, время (C) пребывания животных в условиях дефицита кислорода, а концентрацию АТФ рассчитывают по выражению у=(го(Е)х+ц)„()у Где х — скорост1 использования введенного АДФ (АДФ/C) (,,(), ф() — рассчитанные по формуле (3) значения функций ф (t), зави- 6 сящих от t; у — концентрация АТФ.

Ч (t) А2+Ао созА1 t, где A ю A <ý А < эмпирические коэффициенты, значения которых зависят от h. Изобретениепозволяет быстро определить содержание АТФ в мозге и одновременно характе рис тику митохондрий — значение

АДФ/t в условиях нормоксии и гипок- Ql сии. 2 з.п. ф-лы, 3 табл. уфк

Цель изобретения — ускорение способа при одновременном повышении егофункциональных возможностей.

Способ осуществляется следующим образом.

Из мозга экспериментальных живот" ных методом дифференциального центрифугирования выделяют митохондрии и методом Лоури определяют содержание

1549924 общего белка. Скорость потребления кислорода в суспензии митохондрий измеряют полярографически в среде, содержащей 0,25 M сахарозы, 15 мМ KCI, 20 мМ КН РО, 10 мМ трис-НС1 (рН 7, 4), 10 м11 пирувата + 5 мМ сукцината, после добавления 300 мкМ аденозиндифосфата (АДФ).

При нормоксии по полученному зна,чению (АДФ/t) определяют концентрацяо

АТФ по формуле

y=0,012471 х + 1,875228, (1) где х — скорость использования введенного АДФ (АДФ/ ); у — концентрация АТФ.

Если требуется определить концентрацию АТФ в ткани мозга в условиях гипоксии, дополнительно измеряют высоту (или степень разрежения атмосферного давления) и время пребывания в.условиях гиноксии (t) В этом случае концентрацию АТФ рассчитывают. по формуле: у-cp (t) z + q, (t), (2) а (р (t), ф (t), зависящие от t, рассчитывают по формуле ф(с)=А +А -"os — —, А (3) где А,А,А — эмпирические коэффио циенты, зависящие, от h.

При этом при h=7000 м (310 мм рт. ст. ) используют табл.2, а при h=8000 м (270 мм рт. ст. ) табл. 3.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1 (для интактных животных в условиях нормоксии).

1. Из ткани мозга интактного жи40 вотногo (кролик) выделяют митохондрии методом дифференциального центрифугирования.

2„ Определяют содержание общего белка методом Лоури.

3. Готовят среду инкубации следующего состава, моль: сахароза О, 25;

КС1 О, 015; КН 1 О О, 02; трис-HCI

0,01. В качестве субстратов окисления используют смесь сукцината (5 ммоль) и пирувата натрия (10 ммоль) .

4, Определяют скоростью фосфорилирования. добавленного АДФ (АДФ/t) полярографическим методом.

В инкубационную среду добавляют митохондриальную фракцию в объеме

0,1 мл (в среднем содержание белка

3,0-3,5 мг). Затем проводят стандартную добавку АДФ в количестве

300 мкмоль, после чего немедленно

I регистрируют увеличение скорости потребления кислорода (переход в состояние 3) . Утилизация в процессе дыхания добавленного АДФ вызывает состояние дефицита АДФ, что сопровождается последующим переходом в состояние

5. На полярограмме измеряется время фосфорилирования добавленного АДФ и рассчитывается скорость утилизации

АДФ в единицу времени (1 с). Скорость утилизации АДФ рассчитывается в мкмоль АДФ/мг белка/с АДФ/t . Экспериментально полученная величина

АДФ/t равна 3,0 мкмоль АДФ/мг белка/с.

6. Б формулу у=0, 01 2471 ° х +

+ 1,875228 подставляют 3,0 и рассчитывают концентрацию АТФ/у/, выраженную в мкмоль на 1 r ткани, соотнесенную к мкмоль АДФ/мг белка/с у=0, 012471 3 + 1, 875228=1, 912641.

Экспе р имен т аль но у стан овленн ая концентрация АТФ 1, 92+0, 072, Ошибка формулы составляет О, 42%.

II р и м е р 2 (для интактных животных в условиях нормоксии), 1, Из ткани мозга интактного животного (крысы) выделяют митохондрии методом дифференциального центрифугирования.

2. Определяют содержание общего белка методом Лоури.

3. Готовят среду инкубации следующего состава, моль: сахароза 0,25;

КС1 0,015; КН РО 0,02 трис-НС1

0,01.

Б качестве субстратов окисления используют смесь сукцината (5 ммоль) и пирувата натрия (10 ммоль).

4. Определяют скорость фосфорилирования добавленного АДФ (АДФ/t) полярографическим методом.

Б инкубационную среду добавляют митохондриальную фракцию в объеме

0,1 мл (в среднем содержание белка

3,0-3,5 мг). Затем проводят стандартную добавку АДФ в количестве

300 мкмоль, после чего сразу же ре— гистрируют увеличение скорости потребления кислорода (переход в состояние 3). Утилизация в процессе дыхания добавленного АДФ вызывает состояние дефицита АДФ, что сопровождается по— следующим переходом в состояние 4., 5. На полярограмме измеряется время фосфорилирования добавленного АДФ и рассчитывается скорость утилизации

45

<0,922977=-1,3825736+1,5358859=

=0,1533123.

Для (,():А =-4,8069735ý А =1 1ь4ю

А =5, 8333595, ч, (30 ) =5, 8333595-4, 8069735 cos- — i-= 50

=5,8333595-4,8069735 ° 0,97216=

=5,8333595-4,6731473=1,1602122.

Значения функций ф,(30 ), ф(30 ), экспериментальное значение АД@/t(х)

55 подставляют в формулу (1) и рассчитывают у — концентрацию АТФ, выраженную в мгмоль на 1 г ткани, соотнесенную к мгмоль АДФ/мг белка/с.

5 1549924

АДФ в единицу времени (1 с), Скорость утилизации АДФ рассчитывается в мкмоль АДФ/мг белка/с/АДФ/t/.

Экспериментально полученная величина АД@/t равна 1, 91 мкмоль АДФ/мг белка/с.

6. В формулу y=0,012471х+1,875228 подставляют 1,91 и рассчитывают концентрацию АТФ/t/, выраженную в

10 мкмоль/г ткани, соотнесенную к MKMGJIb

АДФ/мг белка/с, у=0,12471 ° 1,91 + 1,875228=

=1,8990476.

Экспериментально установленная концентрация АТФ 2,08+0,07. Ошибка формулы составляет 8,77..

Пример 3 (гипоксия п=7000 м, что соответствует атмосферному давлению 310 мм рт.ст.).

Берут экспериментальное животное (кролик), помещают в проточную барокамеру и поднимают на высоту 7000 м, Выдерживают на данной высоте 30 мин.

Выделяют митохондрии и определяют 25

АДФ/t поляро графическим методом — см. в примере 1 п. 1, 2, 3, 4,5. Экспериментально полученная величина АДФ/t равна 3,56 мкмоль АДФ/мг белка/с.

Из табл. 1 выбирают значения коэф- 30 фициентов А, »А, соответствующие функциям g (t) и (f,(t).

Рассчитывают значения функций

Vo(t) и (gi(t5 по формуле Ч;()=А +А

А»

x cos-- (i=U,1), вместо t подставляют 35

30 мин.

Для расчета функций q;(t) значение время пребывания животного в состоянии гипоксии- выражается в минутах.40

Для (g (t):À„=1,6640566; A

=76,644; А =-1,8825736. р (30 )=-1,8825736+1,6640566 х хcos †- - — =-1 3825736+1 6640566х

176 644

У=О, 1533123 3, 56+1, 1602122=

=1, 7060039.

Экспериментально установленная концентрация АТФ 1,7120,056. Ошибка формулы составляет 0,23Х.

Пример 4 (гипоксия 8000 м, атм.давл. 270 мм рт.ст.).

1. Берут экспериментальное животное (кролик), помещают в проточную барокамеру и "поднимают на высоту"

8000 м.

2. Выдерживают на данной "высоте"

240 мин.

3. Выделяют митохондрии и определяют АДФ/t полярографич .ским методомсм. в примере 1, п.1,2,3,4,5. Экспериментально полученная величина АДФ/Е равна 3,75 мкмоль АДФ/мг белка/с.

4. Из табл. 2 выбирают значения коэффициентов А0,А,,А, соответствующие функциям сР0() и Lp (г).

5. Расчитывают значения функций

Cp0(t) и CP<(t) по формуле

q (t)=A +А0 cos (i=0 1)

А вместо t подставляют 240 мин.

Получаем для (Ро() Ао=-0,2224712; А =

=104,408; A =0,2607522; („(240 )=0,2607522-0,2224712"

104 408

x cos — - - — =Π2607522-0 2224712"

У х 0,906856=0,2607522-0,2017493=

=0,0590029; для Cf,(t) AO=O, 61 0521 8;, А =1 1 0, 1 21;

А =09167529;

Q,(24О )=0,9167529+0,6105218 х

110 121

icos--- --- О 9167529+0 6105218х

1 к0,896568=1,4641272.

6. Значения функций (pz(240 ), I

q (240 ), экспериментальное значен ие АДФ/ t (х ) подставляют в формулу (1) и рассчитывают у — концентрацию

АТФ, выраженную в мкмоль на 1 r ткани, соотнесенную к мкмоль АДФ/t/мг белка/с.

У=0,0590029 (3,75)[phone]=

=1, 6853880.

Экспериментально установленная концентрация АТФ 1,70 0, 066, Ошибка формулы составляет О, 86Х.

В табл. 3 отражено соответствие данных, полученных по известному способу и изобретению.

Изобретение позволяет сократить в 2 раза время определения и одно!

549924

q;(t) А2

1,6640566 176,644

-1,3825736

-4,8069735 181,4

q,(t) 5,8333595

Таблица2 (р; (t).

А<

Ао

-О,? 224712 104, 408

0,2607522

q,() су,(t ) 0,9167529

110,121

О, 6105218

Таблица3

АДФ/t экспер,, мкгмоль белка/с

АТФ, рассчитанная по предлагаеОтн о сиАТФ эксперимент., мгмоль/1 r ткани

Кол-во опытов

Условия эксперимента тельная ошибка формулы, X мому способу

Интактные

1,92+0,072

2,08+0,07

1,912641 0,42

1,8990476 8,7

Кролики 3,0(Н0,14

57

Крысы 1, 91 0, 07 э временно определить содержание АТФ и величину АДФ/t, характеризующую свойства митохондрий моря, т.е. расширить функциональные возможности способа.

Формула из об ре те ния

Способ определения аденозинтрифосфата в мозге экспериментальных животных путем забоя животного, выделения и гомогенизации мозга с последующим биохимическим исследовани— ем гомогената, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью ускорения способ а при одновременном повыше — нии его информативности, из гомогената выделяют митохондрии, полярографически. определяют скорость потребления кислорода в присутствии аденозиндифосфата, а содержание адеНозинтрифосфорной кислоты рассчитывают по скорости использования аденозинтрифосфата. 25

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью определения аденозинтрифосфата при нормоксии, расчет ведут по формуле у=0,012471 ° х+1,875228, где у - концентрация аденозинтрифосфата„ х — скорость использования аденозиндифосфата;

3. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью определения концентрации аденозинтрифосфата в условиях высотной гипоксии, дополнительно определяют высоту подъема и время пребывания животных в условиях гипоксии, а содержание аденозинтрифосфата. рассчитывают по формуле у= cp (t)x+ ф,(t), где у — содержание аденозинтрифосфата; х — скорость использования аденозиндифосфата; время; ср,(t ), q,(t.) — зависимые от времени функции, которые рассчитывают по форм улам

Т

° (г.)=А +А, cos-- (i=0,1), A) где A,А,А — эмпирические коэффицир енты, значения которых зависят от высоты.

Таблиц а1

1549924

Продолжение табл.3—

Гипоксия

310 мм рт.ст.

t=30

Гипоксия

310 мм рт.ст.

t=60

Гипоксия

310 мм рт.ст.

t=240

Гипоксия

310 мм рт.ст.

t=480

Гипоксия

270 мм рт.ст.

t=15

Гипоксия

270 мм рт. ст. с=30

Гипоксия

270 мм рт. ст, t=60

Гипоксия

270 мм рт. ст.

t=240

1, 71+0, 056 1, 7060039 О, 23

3,56+0, 17

6,34

2, 944+0, 17

1, 85+0, 080 1, 732743

1, 94+0, 05 1, 9621754 1, 14

2,50+0,12

18

1,91+0,065 1,9012985 0,46

3, 15+0, 29

1, 45+0,080 1, 4801008 2, 08

3,02 0,16

1,63+0,080 1,6744151 2,72

2,73" 0,18

19

1, 6710,029 1,8725512 12,1

3,74 0,23

3, 75+0, 29

1,70+0,066 1,6853880 0,86

Составитель Н ° Гуляева

Редактор Н.Киштулинец Техред Л.Сердюкова Корректор Т.Палий

Заказ 244 Тираж 511 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðoä, ул. Гагарина, 101