Способ выделения рестриктаз ii класса

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу выделения ресгриктаз. Рестриктазы используются для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии. Целью изобретения является унификация способа. Способ заключается в том, что выделение рестриктаз проводится по унифицированной схеме очистки: разрушение клеток ультразвуком, функционирование экстракта на гепарин-сефэрозе, хроматография на фосфоцеллюлозе и голубой сефарозе. Способ апробирован на примере выделения рестриктаз Xba I, Not I, Eco 1471, Alw 261, Alw 441, Bsp 501, Eel 13611, Eco81l, Kpn i, Kpn 21. Рае I 1 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 К 9/22

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4708575/13 (22) 11.04.89 (46) 15.12.91, Бюл, N 46 (71) Всесоюзный научно-исследовател ьский институт прикладной энзимологии (72) Э.— А.А.Янулайтис, B.В.Буткус, M.Ï.Ïÿòрушите, Ю,Б,Битинайте, Д.П.Вайткявичюс и Э.-Л.Ю.Кюдулене (53) 577.15.07(088.8) (56) Цветкова Н.В. Разработка рациональных методов очистки рестрикционных зндонуклеаз. — Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1987, N. 7, .с. 77 — 81.

Greene P.J., Heyneker Н,L„Bolivar F„

Rodrigues R, А general method for the purification of restriction enzymes — Nucleic Acids

Research, 1978, v,5, N 7, р. 2373-2380.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу выделения рестриктаз, которые используются для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии.

Описаны рациональные методы очистки рестриктаз, Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения рестриктаз, предусматривающий фракционирование бесклеточных экстрактов при помощи фосфоцеллюлозы с последуюшей хроматографией на гидроксиаппатите, Однако этот способ характеризуется низким выходом целевых ферментов: для рестриктаз А!и1, Bam HI, Pst I, Sal I, Tag! он составляет 80, 1200, 600, 500 и 160 ед/г биомассы соответственно, что на порядок ниже соответствующих выходов этих ферментов, выделенных во ВНИИ прикладной энзимологии, Выделенные по известному

„„5L(ÄÄ 1698289 A l (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕСТРИКТАЗ

ll КЛАССА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу выделения рестриктаз. Рестриктазы используются для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии.

Целью изобретения является унификация способа. Способ заключается в том, что выделение рестриктаз проводится по унифицированной схеме очистки: разрушение клеток ультразвуком, функционирование экстракта на гепарин-сефарозе, хроматография на фосфоцеллюлозе и голубой сефарозе. Способ а-,робирован на примере выделения рестриктаз ХЬа I, Not I, Есо 147I, Alw 26I, Aiw 44(, Bsp 50I, Ecl 13611, Eco81I, Kpn I, Kpn 2l, Рае I. 1 табл. сщсобу препараты рестриктаз не во всех случаях по своему качеству соответствуют мировым стандартам. Например, для достижения 90% лигирования после обработки ДН К 50-кратным функциональным, избытком рестриктазы Рst I (тест "рестрикция — лигирование — рестрикция") обсуждаемую схему очистки (хроматография на фосфоцеллалозе, гидооксиаппатите) необходимо дополнить хроматографией на гепаринсефарозе.

Как показывает опыт, в случае ряда рестриктаз нецелесообразно применять фссфоцеллюлозу для фракционирования бесклеточных экстрактов, так как значительная часть активности (или вся активность) рестриктазы оказывается B проскоке, что привсдит к снижению выхода целевого фермента, и как следствие к снижению качества ферментного препарата.

1698289

Целью изобретения является унификация способа.

Согласно предлагаемому способу выделение рестриктаз проводится по унифицированной схеме очистки: разрушение клеток ультразвуком, фракционирование бесклеточного экстракта на гепаринсефарозе с последующей хроматографией на фосфоцеллюлозе и голубой сефарозе в 0,01 M калий-фосфатном буфере, рН 7,4, 0,007 M

2-меркаптоэтанол, 0,001 M ЭДТА с элюцией фермвнта с колонки градиентом NaCI 0,10,8 M при хроматографии на гепаринсефарозе и фосфоцеллюлозе и 0,01-0,1 M npu хроматографии на голубой сефарозе, Пример 1. Получение рестриктаз ХЬа !, Есо 147 l.(изошизомер Stui) и Notl. (Последовательность операций следующая: разрушение клеток, хроматография на гепаринсефарозе, хроматография на фосфоцеллюлозе. хроматография на голубой сефарозе.

Для выделения и очистки рестриктаз используют следующую аппаратуру: ультразвуковой дезинтегратор УЗДН вЂ” 2Т, центрифугу "Бекман Ж вЂ” 21", холодильный шкаф

"МиниколдЛаб", хроматографические колонки, термастат, аппарат для электрофореза, универсальный источник питания УИП-1.

Сорбенты: фосфоцеллюлоза, гепаринсефароза и голубая.сефароза.

ДНК фага !,и плазмиды рСЕЗ выделены по известной методике.

При разрушении клеток и хроматографии используют 0,01 M калий-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,007 M 2-меркаптоэтанол, 0,001 М ЭДТА (буфер А).

Активность рестриктаз тестируют мето- дом гидролиэа ДНК фага il и плазмиды

I рСЕЗ с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в агарозном геле. Реакционная смесь для гидролиза содержит: 0,01 M трис-H Cl, р Н 7,8, 0,005 M МцС!2, 0,15 M NaCI, 100 мкг/мл альбумина(для рестриктаз Nat i è ХЬа I), 0,01

M трис-HCI, рН 8,0, 0,005 M МдС!г, 0,025 M

NaCi (для рестриктазы Есо 147 !).

В реакционную смесь входит ДНК фага А (в случае рестриктаз Xba I и Есо 147 I) или ДНК плазмиды рСЕЗ (рестриктаза Not I), . Концентрация ДНК составляет 50 мкг/мл, В .пробу объемом 40 мкл вносят 1 — 5 мкл соответствующего ферментного препарата и реакцию проводят 1 ч при 37 С, Электрафореэ проводят в 0,1 M натрий-боратном буфере, рН 8 2, О 002 M ЭДТА в течение 1 ч при напряжении 100 В. Окрашенные этидий бромидом (1 мкг/мл) гели просматривают в

УФ-свете, 10

20 зуют в течение 16 ч против 2 л буфера А, 30 содержащего 0,1 M NaCI.

° ростью 20 мл/ч наносят на колонку (1,5 х

За условную единицу активности принимается то количество фермента, которое в оптимальных условиях за 1 ч полностью расщепляет 1 мкг ДРК фаза А, Все операции по выделению и очистке ферментов проводят при+40С, Для выделения рестриктаз ХЬа I, Not I, Есо 147 I используют биомассы клеток

Xanthomonas badrii, Nocardla otitidiscavlarum и ЕзсЬег!сЫа col! RFL 147 соответственноо.

Разрушение клеток: 20 r биомассы клеток суспендируют в 40 мл буфера А, содержащего 0,1 M NaCI, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе мощностью 100 W в течение 7 мин и центрифугируют при 20000 об/мин на центрифуге "Бекман Ж вЂ” 21С", ротор ЖА — 20.

Хроматография на гепаринсефарозе, Полученный бесклеточный экстракт со скоростью 20 мл/ч наносят на колонку размером 1,5х20 см с гепаринсефарозой, уравновешенной буфером А, содержащим

0,1 M NaCI. Колонку промывают 60 мл того же буфера и элюируют линейно повышающейся концентрацией NaCI 0,1-0,8 M в 500 мл буфера А. Фракции, содержащие основную часть активности, объединяют и диалиХроматография на фосфоцеллюлозе.

Ферментный.раствор после диализа со скох10 см) с фосфоцеллюлоэой, уравновешенной буфером А, содержащим 0,1 М NaCI.

Колонку промывают 20 мл того же буфера и элюируют линейным градиентом концентрации NaCI 0,1-0,8 М в 250.мл буфера А.

Фракции. содержащие основную часть рестриктазной активности, объединяют и диализуют в течение 16 ч против 1 л буфера А, содержащего 0,1 М NaCI.

Хроматография на голубой сефарозе.

Ферментный раствор после диализа со скоростью 10 мл/ч наносят на колонку (1 х х10 см) с голубой сефароэой, уравновешенной буфером А. содержащим 0,1 М

NaCI. Колонку промывают 10 мл этого же буфера и элюируют линейным градиентом концентрации NaCI 0,1-1,0 М в 100 мл буфера А. Фракции, содержащие основную часть рестриктазной активности, объединяют, добавляют альбумин до концентрации 50 мкгlмл и диализируют против 0,01 M трис-HCI буфера, рН 7,4, содержащего 0,05

M KCI, 0.0001 М ЭДТА, 0,001 М дитиотрейтола и 50,, глицерина (по ббъему), в случае рестриктаз ХЬа и Not I, Для рестриктазы

Есо 147 используют 0,01 М трис-HCI буфер, рН 7,4, содержащий 0,1 M KCI, 0,001 М ЭД1698289

Коллекция, М

Рестриктаза

Опыт

Микроорганизмы

Выход рестриктаэы, тыс.ед,акт./

1 кг биомассы

Alw 261

Alw 44 I

Bsp 501

Ect 136 II

Есо 81 I

Крп.t

Крп 2!

Рае I

2

4

6

Aclnetobacter ewoffi RFL 26

Acinetobacter ewoffi ВН 44.Bacillus species йН=50

Entегоbacter с!оасае RFL-Л36

Eschertchia coll RFL 81

Ktebslella pneumonia ОК 8

Klebsletta pneumonta RFL 2

Pseudomonas aeru (поза

2000

В-4504 ,В-4505

 — 4862

 — 4501

В-3309

В— - 1823

B— - 3701

 — 1961

ТА, 0,001 M дитиотрейтол и 50;ь.глицерин (по объему). Ферментные препараты хранят при-20 С.

Из 1 г сырой биомассы получают 10000, 200, 30000 ед. активности рес риктаз Xba I, Not l и Есо 147! соответственно.

Пример 2. Определение качества ферментных препаратов рестриктаз.

Качество рестриктаз определяют двумя тестами: общей оценкой нуклеаз и методом "рестрикция — лигйрование — рестрикция", При проведении общей оценки нуклеаз в пробирки, содержащие по 2 мкг ДНК в

40 мкл стандартной для данной рестриктазы реакционной смеси, вносят различные количества исследуемого препарата и инкубируют 16 ч при 37 С. Продукты реакции анализируют методом электрофореза в

1 -ном агарозном геле. При увеличении избытка ферментов до 15-кратного при продолжительности инкубации 16 ч не наблюдается снижения интенсивности и четкости эон в электрофореграмме, что указывает на отсутствие неспецифических нуклеаз в ферментных препаратах.

Для оценки качества рестриктаз при помощи метода "рестрикция — лигирование— рестрикция" в пробирки, содержащие 6 мкг

ДНК в 40 мкл стандартной для исследуемой рестриктаэы реакционной смеси, добавляют различные количества препарата рестриктазы и инкубируют 16 ч при 37 С.

Реакцию останавливают, помещая пробы в

65 С на 10 мин. Состав реакционной смеси коррегируют соответствующими добавками, чтобы его приблизить к оптимальному для лигирования (0,05 М трис-HCI буфер, рН

7,6, О, 0 1 M Mg CI2, 0,01 M дитиотрейтол, 0,07

MM АТФ), добавляют ДНК лигазу и инкубиругот 16 ч при 12 С.

Повторное расщепление проводят ин5 кубацией при 37 С в течение 1 ч, для чего используют двухкратный избыток соответствующей рестриктазы. Продукты реакций расщепления субстрата, лигирования и повторной рестрикции лигатов анализируют

10 методом электрофореза в 1 -ном агарозном геле. Лигирование рестриктов и повторное расщепление лигатов происходит полностью и не зависит от избытка рестриктаз в отношении субстрата (до 50- кратного

15 функционального избытка).

Следовательно, препараты рестриктаз

ХЬа I; Not I и Есо 147 I не содержат примесей неспецифических нуклеаэ и фосфотаз и могут успешно использоваться в работах по

20 генной инженерии.

Пример 3. Согласно предлагаемому способу возможно также выделение других рестриктаз II класса (см. таблицу).

Указанные в таблице микроорганизмы

25 хранятся во ВНИИ генетика; Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов, Формула изобретения

Способ выделения рестриктаз It класса, 30 включающий гомогенизацию сырья, экстракцию гомогената и хроматографическую очистку экстракта, отличающийся тем, . что, с целью унификации способа, хроматографическую очистку выполняют последова35 тельно на гепаринсефарозе в градиенте NaCI, ° на фосфоцелллюлозе в градиенте NaCI и на голубой сефароэе в градиенте NaCI 0.09 — 0.11 до 0;98 — 1,02 М.