Способ получения рибонуклеазы н из еsснеriснiасоli

 

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии для специфической фрагментации РНК и рибонуклеопротеидных компонентов, для получения рекомбинатных вирусных РНК и репликации плазмидных ДНК в присутствии РНК-полимеразы и ДНК-полимеразы 1. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса. Способ получения РНК-азы Н включает разрушение биомассы, осветление низкоскоростным центрифугированием, освобождение от внутриклеточных компонентов ультрацентрифугированием, грубое фракционирование клеточного экстракта осаждением сульфатом аммония и очистку хроматографией на цибакрон-синий-агарозе и аминогексилагарозе при рН 7,6-7,9 и ионной силе 0,045-0,055 М КС1. Полученный препарат свободен от примесей посторонних нуклеаз и пригоден для использования в молекулярно-биологических исследованиях. Выход целевого продукта повышается по сравнению с известным способом в 25 раз, достигая 750 тыс. ед/кг биомассы. 2 табл.

ССЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (д1) у С 12 N 9/22

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H A STOPCHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4329716/28-13 (22) 17.11.87 (46) 23.07.89. Бюл. 9 27 (7 1) Научно-производственное объединение "Биолар" (72) Н.В.Чичкова, В.Э.Пейсениекс и И.К.Залите (53) 577.15 (088.8) (56) Darlix I.L. Eur.I. Biochem., 1975> 51в 369 376 °

Berkover L., Leis I., Hurwits I.

I.Biol Chem. 1973, 248, 5914-5921.

Itoh. Т., Towizawa I. Nucl Acids

Res. 1 1982, 10, 5949-5965. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОНУКЛЕАЗЫ Н

ИЗ ESCHERICHIA C0LI (57) Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии для специфической фрагментации PHK и рибонуклеопротеидных компонентов, для получения рекомбинатных вирусных РНК и репликаИзобретение относится к биохимии и молекулярной биологии, в частности к получению бактериальных нуклеаз..

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта — PHKазы Н.

ЭкСтракт биомассы подвергают ультрацентрифугированию и надсадок после фракционирования осаждением сульфатом аммония очищают от балластных белков хроматографией на цибакрон-синий-агарозе и аминогексилагароэе при рН

7,6-7,9 и ионной силе 0,045-0,055 М

KCl.

„„ЯО„„1495377 А 1 ции плазменных ДНК в присутствии

PHK-полимераэы и ДНК-полимеразы Д.

Целью изобретения является повьппение выхода целевого продукта и упрощение процесса. Способ получения PHK-аэы

Н включает разрушение биомассы, осветление ниэкосортным центрифугированием, освобопщение от внутриклеточных компонентов ультрацентрифугированием, грубое фракпионирование клеточного экстракта осаждением сульфатом аммония и очистку хроматографией на цибакрон- иний-агароэе и аминогексилагароэе при рН 7,6-7,9 и ионной силе

О 045-0,055 M KC1 Полученный препарат свободен от примесей посторонних нуклеаэ и пригоден для использования в молекулярно-биологических исследованиях. Выход целевого продукта повьппается по сравнению с известным способом в 25 pas, достигая 750 тыс. ед/кг биомассы. 2 табл.

В общем виде схема получения выглядит следующим образом: разрушение клеток, осветление — буфер А; ультрацентрифугирование — буфер А; фракционирование сульфатом аммония — буфер

А; хроматография на цибакрон-синийагарозе — буфер Б; концентрирование на фосфоцеллюлозе — буфер Б; хроматография на аминогексилагароэе — буфер Б; концентрирование на фосфоцеллюлоэе - буфер Б, где А — 0,05 М трис-НС1 рН 7,5, 0,01 М MgClz, 0,25 M

КС1, О, 1 мМ ДТТ, 0,1 мИ ЭДТА, 5Х глицерина; Б — 0,02 И трис-НСl рН 7,9, Э 1495377

О, 1 мМ ДТТ, О, 1 мМ ЭДТА, 0,05 М КС1, 5 . глицерина.

Схема выделения позволяет заметно сократить по сравнению с известным способом затраты времени и реактивов и увеличить выход целевого продукта в 25 раз. Сокращение времени достигается за счет ультрацентрифугирования, уменьшения числа и упрощения хромато- 10 графических стадий. Увеличение выхода обеспечивается использованием биоспецифических сорбентов, ранее не использовавшихся для выделения РНКазы

Н. Хроматография на цибакрон-синийагарозе при рН 7,6-7,9 позволяет в одну стадию освободиться от большой части балластных клеточных белков и добиться сильного обогащения целевым продуктом практически без потерь 20 последнего. Хроматография на аминогексилагарозе при ионной силе 0,0450,055 М НС1 и рН 7,6-7,9 обеспечивает окончательную очистку от примесных нуклеаз. Число хроматографических 25 стадий снижается с пяти до двух, количество используемых буферных растворов — с б до 2.

Выход целевого продукта, пригодного для использования в молекуляр- 30 ной биологии, увеличивается с 30,5 до 750 тыс. ед/кг биомассы.

Пример 1. 1,0 кг замороженных клеток Е. coli NPE 600 суспендируют в ровном объеме буфера А и разрушают в дезинтеграторе Мантона-Гаулина 15М-8ТА при давлении 500-600 атм суспензию разбавляют буферным раствором до 15 л, добавляют 0,2 мг ДНКазы (свободной от рибонуклеаз) и переме- 40 шивают 30 мин.

Клеточные осколки удаляют центрифугированием на центрифуге в роторе

gSA 30 мин при 12000 об/мин.

Рибосомы удаляют ультрацентрифугированием на центрифуге "Beckman 1550" в зональном роторе Ti-155 ч при

28000 об/мин.

К супернатанту (1500 мл) добавляют сухой аммоний сернокислый из расчета 22 г на каждые 100 мл суперна50 танта. При этом добавляют сухой (трис)-оксиметиламинометан, поддерживая рН 7,8. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием на центри

55 фуге в роторе gS3 30 мин, при

7000 об/мин. К прозрачному супернатанту добавляют еще 14 г аммония сернокислого на каждые 100 мл раствора. Осадок собирают центрифугиройанием на центрифуге и растворяют в минимальном объеме буфера В. -Раствор диализуют против буфера В. Выпавший осадок удаляют центрифугированием на центрифуге в роторе цБЛ 30 мин при 12000 об/мин.

Осветленный раствор наносят на колонку с цибакрон-синий-агароза (уравновешенный буфером В, объем колонки 400 мл, диаметр 2,6 см, длина

75 5 см) со скоростью 100 мл/ч. Колонку промывают 1 л буфера В, после чего подключают градиент концентрации КС1 (0,05-0,7 М) в буфере В. Во фракциях градиента проверяют активность рибонуклеазы Н и Фракции с максимальной активностью фермента объединяют и концентрируют на колонке с фосфоцеллюлозой (объем 10 мл). Концентрированный Фермент с Фосфоцеллюлозы элюируют в буфере В, содержащем 1М хлористый калий, и диализуют против буфера В.

Отдиализированный материал наносят на колонку с аминогексилагарозой (уравновешенной в буфере В, объем колонки 500 мл, диаметр 2 6 см, дли-. на 94,5 cM) со скоростью 200 мл/ч.

Колонку промывают буфером В. Во фракциях элюата проверяют активность рибонуклеазы Н и побочных рибонуклеаз.

Фракции, содержащие Ферменты без побочных активностей, объединяют и консервируют добавлением глицерина до конечной концентрации 50 .

Выход 750 тыс, ед., удельная активность 400 тыс. ед/мг белка, Препарат проверяют на следовые примеси ферментных активностей дезоксирибонуклеаз, рибонуклеаз, рибонуклеазы

III, Перечисленные Ферментативные активности отсутствуют, За единицу активности принимаются количество фермента, катализирующее л образование 1 мкмоль кислоторастворимых нуклеотидов за 20 мин при 37 С с использованием в качестве субстрата (С 14) поли (rA), поли (dt).

Влияние изменений рН на выход целевого продукта в предельных (примеры 2 и 3) и запредельных (примеры 4 и 5) значениях показано в табл.1; изменение выходов РНКазы Н в зависимости от ионной силы на стадии очистки на аминогексилагарозе — в табл.2.

1495377

Формула изобретения

Таблица 1 рН Ионная Выход, 7 Примеси побочных рибонуксила, леаз,дизоксирибонуклеаз и

H KCl рибонуклеазы III

Пример

100,0

90,0

98,5

15,0

85,5

Отсутствуют

7,8 0,05

7,96 О, 05

7,9 0,05

7,4 0,05

8,0 0,05

2

4

Т1

lt

11

Таблица 2 рН Примеси побочных рибонуклеаз, дезоксирибонуклеаз и рибонуклеазы III

При- Ионная Выход, мер сила, M КС1

7,8

7,8

/,8

7,8

7,8

100

77

6

8

10

Отсутствуют

ll

tf

Il

Имеются

0,050

О, 045

0,055

0,035

0,060

Составитель Н.Ходарев

ТехРед M.Пидык Корректор М.Самборская

Редактор Н.Гунько

Заказ 4216/25 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рауыская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðoä, ул. Гагарина, 101

Способ получения рибонуклеазы Н из Escherichia cnli включающий дезинтеграцию биомассы, получение экстракта отделением клеточного дебриса низкоскоростным центрифугированием, фракционирование экстракта сульфатом аммония, очистку хроматографией и концентрирование на фосфоцеллюлозе, отличающийся тем, что, с ц лью повыщения выхода целевого продукта и упрощение процесса, экстракт подвергают ультрацентрифугированию, фракционируют надосадок сульфатом аммония, диализуют против стартового буфера для цибакрон-синийагарозы с последующей хроматографической очисткой на цибакрон-синий10 агарозе и аминогексилагарозе при рН

7,6-7,9 и ионной силе 0,045-0,055 M хлористого калия.