Способ выделения 5 @ -нуклеотидазы из яда кобры

 

Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к получению чистой 5 @ -нуклеотидазы яда кобры - специфического фермента, катализирующего гидролиз 5 @ -рибонуклеотида до рибонуклеозида и ортофосфата. Высокая специфичность 5 -нуклеотидазы делает ее препаратом при исследовании структуры нуклеиновых кислот. Целью изобретения является упрощение способа и повышение чистоты целевого продукта за счет разделения 5 @ -нуклеотидазы от неспецифической фосфомоноэстеразы. Способ включает растворение яда кобры в буферном растворе с последующим центрифугированием и хроматографированием на гептил-агарозе с использованием в качестве буфера 0,35-0,45 М раствора сульфата аммония, PH 6,5-7,5. 5 -нуклеотидаза элюируется после основного количества белка. Выход - 90%, степень очистки - 25, содержание фосфодиэстеразы и неспецифической фосфомоноэстеразы - менее 0,05% активности 5 -нуклеотидазы. 1 з.п.ф-лы, 6 фиг.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51 )5 С !2 N 9 22

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н Д BTOPCHOIVlY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4412358/31 — 13 (22) 18.04.88 (46) 23,02.90. Бюл. 1! 7 (71) Институт химической и биологической физики AH 3CCP (72) А,А. Тара, Э.Э. Аавиксаар и А.А. Аавиксаар (53) 577.15,.07 (088,8) (56) Василенко С.К., Райт В.К. Метод выделения высокоочищенной рибонуклеазы из яда среднеазиатской кобры

Napa oxiana. — Биохимия, 1975, т. 40, Ф 3, с. 578 †5. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ 5 -НУКЛЕОТИДА-

ЗЫ ИЗ ЯДА КОБРЫ (57) Изобретение относится к ферментной промьш!пенности, в частности к по— лучению чистой 5 -нуклеотидазы яда ! кобры — специфического фермента, ката1 ! лизирующего гидролиз 5 -рибонуклеотиИзобретение относится к ферментной промьппленности, в частности к по-! лучению чистой 5 -нуклеотидазы яда кобры — специфического фермента, ка-! тапизирующего гидролиз 5 -рибонуклеотида до рибонуклеозида и ортофосфата

/ (высокая специфичность 5 -нуклеотидады делает ее препаратом при исследовании структуры нуклеиновых кислот), Цель изобретения — упрощение спо-. соба и повыщение чистоты целевого

1 продукта за счет разделения 5 -нуклеотидазы от неспецифической фосфомоноэстераэы.

„„SU„„1544801 А 1

2 да до рибонуклеозида и ортофосфата.

Высокая специфичность 5 — нуклеотидазы делает ее препаратом при исследовании структуры нуклеиновых кислот.

Целью изобретения является упрощение способа и повьппение частоты целевого ( продукта за счет разделения 5 -нуклеотидазы от неспецифической фосфомоноэстеразы. Способ включает растворение яда кобры в буферном растворе с последующим центрифугированием и хроматографированием на гептил-агарозе с использованием в качестве буфера 0,35 — 0,45 М раствора сульфата аммония, рН 6,5 — 7,5, 5-11уклеотидаза элюируется после основного количества белка. Выход 90%, степень очистки — 25, содержание фосфодиэстеразы и неспецифической фосфомоноэстеразы менее 0,05% активности 5-нуклеотидазы 1 з,п ф лы I иле

Способ включает растворение яда 4 кобры в буферном растворе с последую- 4 щим центрифугированием при 5000 об/мин Яб и хроматографирование раствора яда на гептил-агарозе, причем растворение рвы яда и хроматографию осуществляют. с использованием в качестве буфера 0,350,45 М раствора сернокислого аммония (рН 6,5-7,5) и 5 -нуклеотидаза элюируется после основного количества бел( ка, полученный раствор 5 -нуклеотидазы концентрируют при ультрафильтрации.

При концентрации сернокислого аммония в элюенте ниже 0,35 М часть

1544801

5 -нуклеотидаэы проходит колонку гепI гил-агарозы, и выход резко понижается. При концентрации сернокислого аммония выше 0,45 начинается адсорбция фосфодиэстеразы на гептил-агарозе, как и при рН выше 7, 5, При рН ниже

6,5,5 -нуклеотидаза инактивируется.

Использование сернокислого аммония в качестве буфера на стадии растворе- 10 ния яда обеспечивает создание подхоДящей среды для последующего разделеия на гептил-агарозе. Концентрация аствора сернокислого аммония 0,35,45 M является самой высокой кон1ентрацией, которая позволяет исклюить адсорбцию остальных нуклеаз (неспецифической фосфомоноэстеразы и фосфоэстер зы), а также является прак тически самой низкой концентрацией, которая обеспечивает полное связыва! ние 5 "нуклеотидазы на. гептил-агарозе и ее элюирование после основного количества белка, Самые лучшие реI зультаты разделения 5 -нуклеотидазы 25 от неспецифической фосфомоноэ стеразы реализуются в интервале рН 6,5-7,5.

Из алкил-агароз оптимальным с орбентом является гептил-агароза. На

< гексил-агарозе 5 -нуклеотидаза связы30 вается слишком слабо, что не обеспе.чивает полноту разделения от компонентов яда и высокий выход, а на октилагарозе частично связывается фосфодиэстераза, и градиентное элюирование не гарантирует полное разделение 5

C нуклеотизады от фосфодиэстеразы, Хро .,матография на гептил-агарозе обеспе чивает практически полное разделение

5 -нуклеотидазы от неспецифической фосфомоноэстеразы и фосфодиэстеразы (см.чертеж).

Способ заключается в следующем.

Яд кобры растворяют в растворе

0 35-0,45 М сернокислого аммония (рН 45

6,5 — 7,5), центрифугируют при

5000 об/мин при 4 0 в течение 30 мин, 1 осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии.

Хроматографию проводят на гептил-агарозе в растворе 0,35-0,45 M сернокис50 лого аммония (pH 6,5-7,51.5 -Нуклеотидаза связывается на колонке гептилагарозы и элюируется после основного белка 0,35-0,45 M раствором серно55 кислого аммония (рН б, i-7,5) . Полученный фермент концентрируется при помощи ультрафильтрации.Характеристика препарата: выход 90%, степень очистки— в 25 раз„ Содержание фосфодиэ< теразы и неспецифической и <Ьос<ЬомоноэстеI разы ниже 0,05 от активности 5 -нуклеотидазы.

1I р и м е р 1. К, 0 5 г яда кобры добавляют 4 мп раствора 0,35 М сернокислого аммония (рН 6,5), смесь медленно перемешивают в течение 4 ч о при 4 С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4 С в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии, На уравновешенную 0,35 М раствором сернокислого аммония (рН

6,5), колонку с гептил-агарозой (размеры колонки 2,1 2,6 см) наносят раствор яда, Колонку элюируют 0,35 М раствором сернокислого аммония (рН 6,5) со скоростью 26 мл/ч, отбирают фракции по 13 мм. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью "Увикорд-11". Неспецифическая фосфомоноэстераза, фосфодиэстераза, рибонуклеаза и основное количество белка в данных условиях проходят колонку, а 5 -нуклеотидаза, имеющая on( тимум гидрофобности в данных услови ях, связывается на гептил-агарозе и элюируется раствором 0,35 М сернокислого аммония при рН 6,5. Фракции, t имеющие 5 -нуклеотидазную активность, объединяют (выход 310 мл) и концентрируют ультрафильтрацией.

Характеристика препарата: выход

901, степень очистки — в 25 раз, I

Удельная активность препарата 5 -нуклеотидазы 60,0 ед/мг, Содержание фосфодиэстеразы 0,05R (3 10 ед,/мг).

Содержание неспецифической фосфомоноэстеразы 0,05% (3 10 ед./мг)..

Пример 2. К 0,5 г яда кобры добавляют 4 мл раствора 0,40 М сернокислого аммония (рН 7,0), смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 4 С. Растворенный яд центрифугиру ют при 5000 об/мин при 4 С в течение

30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии, На уравновешенную 0,04 М раствором сернокислого-аммония (рН 7,0) колонку с гептил-агарозой (размеры колонки 2,1 2,6 см) наносят раствор яда. Колонку элюируют 0,440 М раствором сернокислого аммония (рН 7,0) со скоростью ?6 мл/ч, отбирают фракции по 13 мп, Оптическую плотность элюата регистрируют непрерьпзно с помощью

"Увикорд-11". Неспецифическая фосфо801 6 и основное количество белка проходят в данных условиях колонку,, а 5 -нуклеl отидаза, имеющая оптимум гидрофобности в данных условиях, связывается на гептил-агарозе и ее элюируют раствором 0,45 M сернокислого аммония

Г при рН ?,5, Фракции, имеющие 5 -нуклеотидазную активность, объединяют (выход 307 мл) и концентрируют ультрафильтрацией.

Характеристика препарата: выход

90%, степень очистки — в 25 раз, (Удельная активность препарата 5 -нук" леотидазы 60,1 ед,/мг. Содержание фосфодиэстеразы 0,042Х (2,5 ° 10 ед./мг) 5 1544 моноэстераза, фосфодиэстераза, рибонуклеаза и основное количество бел-, ка проходят в данных условиях колонку и

5 а 5 -нуклеотидаза, имеющая оптимум гидрофобности в данных условиях, 5 связывается на гептил-агарозе и ее элюируют 0,40 И сернокислого аммония при рН 7,0. Фракции, имеющие 5 -нуклеотидазную активность, объединяют (выход 305 мл) и концентрируют ультрафильтрацией. Удельная активность (/ препарата 5 -нуклеотидазы 60,7 ед,/мг.

Характеристика препарата: выход

90Х, степень очистки — в 25 раз. Со-. держание фосфодиэстеразы 0,046Х (2,8% хЕ0 ед./мг). Содержание неспецифической фосфомоноэстеразы 0,00073 (4,5.10 ед./мг)

II р и м е р 3. К 0,5 r яда кобры 20 добавляют 4 мп раствора 0,45 М сернокислого аммония (рН 7,5), смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 4 С. Растворенный яд центрифугио руют при 5000 об/мин при 4 С в тече- 25 ние 30 мин, Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии. На уравновешенную

0,45 М раствором сернокислого аммония (рН 7,5) колонку с гептил-ага- 30 розой (размеры колонки 2,112,6 см) наносят раствор яда. Колонку элюируют 0,45 М раствором сернокислого аммония (рН 7,5) со скоростью .

26 мл/ч, собирают фракции по 13 мл, Оптическую плотность элюата регистри»

35 руют непрерывно с помощью "Увикорд11 Неспецифическая фосфомоноэстераза, фосфодиэстераза, рибонуклеаза

Формула и з обретения

Г

l . Способ выделения 5 -нуклеотидазы.из яда кобры, включающий растворение яда кобры в буферном растворе, центрифугирование с последующей очисткой супернатанта методом хроматографии с разделением от сопутствующих белков, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения чистоты целевого

t продукта за счет разделения 5, -нуклеотидаз от неспецифической фосфомоноэстеразы, растворение яда кобры осуществляют в 0,35-0,45 М буферном растворе сульфата аммония при рН

6,5-7,5, а хроматографическую очистку выполняют на гептил-агарозе в:

0,35-0,45 M растворе того же буфера.

2. Способ по п.l, отличаюшийся тем, что центрифугирование проводят при 5000 об,/мин.! 54480) Корректор Н. Король

Заказ 47) Тираж 479 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

118035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-и брательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Составитель А, Семенов

Редактор В. Данко Техред М.Дидык

800

Оэг, мл! !