Способ получения производных борсодержащих пептидов
,, Ы „„1807988 А3
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУбЛИК. (s»)s . С 07 К 5/08, 5/06, 5/08//А 61 К 37/02
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ . »,84; I:: q. К: ПАТЕНТУ
2" . (2 1)4356026/04 . ". ;.: :: ..:: . : ":.:: NH (22) 03.06;88 . : ::- ". - "-. :;:: :; . (СН2)пМНСЙН2, m =3 4;у ОстатОк пинэкО, (31)059670 -: . :.: . ..:.—:.. нового или пинандиолбвого эфира; HNI,(32)05;06;87::::: —::; .; : .:-: ::: .:. -,..СвНб$0зН, HCI,. HBr „Z-0 или L-Phe, ... (33) US;: .: . -,::;: DPhe-Pro, D-Phe-Ala-1 y .. (46) 07;04.93.Бюль 13: .::::.:: Glu-Phe, Ala-йц, Giu-Qly, 6!у-Leu-Ala, руго :, (71) Е.И.Дюпон Де:Немур энд Компани (VS) :. Gfu-Ðhå, Val-×àl, 0;-Ча!-Кеи, Еуз-Pro. 1 е»-ТМ ; (72) Шарлс Ейдриен Кеттнер (VS) ui Ашокку- . мар Бйкаппа Шенви(Я} . . - (С»,Н И» », «л. C 07 С 103/52; опублик. 1982.:: .. .: Я и 1/Ч Cl, Br; y=.остаток пинаконового или
Qrun и др. Thriub. Res, 1985, 37, 145- йинандйолового эфира. Реагент:ll:;амино- .
"-, Европейский патент 0181267, -: - : . заны выше; Полученный продукт:формуль» кл. А 61 К 37/02, опублик 1986;...:: R1-Z-АНСИ((СН ) )И )Ву HW, где Й1, Z, у, Шредер 3. и Любке К; Пептиды, чА М::: W,Я и и имеют значейия, указаннЫв выи»е, ., - - »У1ир, 1967, с. 116.:: -;,, " -:" . :: обрабатывают азидом щелочногсиМталла.с. ф образованием..:соединении . Rj-БЧН- ЙЬ!Х БОРСОДЕРЖАЩИХ ПЁПТИДОЗ -: .. : веют в присутствии органичеСкой или ми»»еральной кислогы. предпочтительно дицинской химии в качестве соединений,:;.:.::: ",,: (CHQjiNHi
- ностью; широким спектром действия, рас- . подвергают взаимодействию с цийамйдом в. творы которых могут быть приготовлены без - низшем спирте при 50-150 С. Новые инги исйользования солюбилизатора; Сущность . биторы имеЮт значения К» < 0;7 мкм; облаизобретения: пройзводные борсодержащих дают-: :, r»pOTotBQSOCflàÿéòÅËü»lÜIÌ: и пептидов общей ф-лы R»-Z-NHCH(R2)-By х обезболивающим действием наряду с укахНЧЧ,-где R1-Í, Ac, Bz. Boc, BocLeu; Rz- занными-эффектами; 16.табл. малотоксичнь»х, обладающих более вь»сокой ингибирующей активностью и более, широким спектром действия,. растворы которых могут быть приготовлены без использования солюбилизатора (органического растворителя).
Поставленная цель достигается способом получения производных борсодержащих пептидов общей формулы (1) Изобретение относится к способу получения борсодержащих пептидов — новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в биохимии в качестве ингибиторов трипсинподобных сериновых протеаз, например тромбин, калликреин плазмы и плазмин.
Цель изобретения — способ получения новых производных пептидной природы,—
1807988
R)-2 — NH — Н вЂ” BY HW, 12 где Ri — Н, As, Bz, Bos, Bos-Leu;
R2 — (CH2)nNH C(NH)NHz, где и = 3, 4;
Y — остаток пинаконового или пинандиолового эфира;
HW — CrHsS0>H, НС1, Нвг;
Z О или L-Phe, DPhe-Pro, DPhe-Phe, А!а-1.ys, Pro-Phe, А!а-Phe, Glu-Phe, Ala-GIu, Glu-Gly, Gly-Leu-Ala, pyro-Glu-Phe, Val-Val, DVai- еи, Lys-Pro, I eu-Thr, заключающийся в том, что амин формулы (1!)
Н2М CHBY HW, (CHz) W где и = 3, 4;. W u W — Cl, B и;
Y — остаток пинаконового или пинандиопоаого эфира, вводят во взаимодействие с аминокислотой или пептидом формулы (11!)
В1 — 2 — OH значения R1 и Z указаны выше и полученный продукт формулы (IY)
R1 Z-.NHCH — BY HW, (СН2) Щ1 значения В1, Z, Y; W, Чl и и указаны выше, обрабатывают азидом щелочного металла с образованием соединения формулы (У)
R -Z-NH — СН вЂ” BY HNI, (СН2) Из значения Й1, Z, Y, W и и указаны выше, которое затем восстанавливают в присутствии органической или минеральной кисло. ты, предпочтительно бензолсульфокислоты, с образованием соединения (У1)
R — Z-NH-CH — BY HW
1 (СН2)пй Н2 значения R, Z, Y, М/ и и указаны выше, последнее подвергают взаимодействию с цианамидом в низшем спирте при 50—
150 С.:
В описании изобретения используются следующие сокращения для аминокислотных остатков:
Ala = l=аланин
АГ9 = (=аргинин
Азп - 1=аспарэгин
Asp 1.-аспарагиновая кислота
Cys = -цистеин
6!и = 1.-глутамин
Gtu - 1=глутаминовая кислота
Gly = глицин
Н1в = l=гистидин !!е - L-иэолейцин
Leu = L-лейцин
Lys - 1=лизин
Мес = 1-метионин
Phe = L-фенилаланин
Pro = l=пролин
Ser = L-серин
Thr = L-треонин
Тгр = l=триптофан
45 пластинках KCI8F äëÿ оф-ТСХ фирмы
Whatman. Нейтральные соединения наблюдали в УФ-области и после экспонирования парами иода, Соединения, содержащие свободные аминогруппы. подкрашивали ни50
55 нгидрином; а соединения с гуанидиногруппами подкрашивали красителем Sakaguchi. Краситель Sakagvchi проявляет значительную специфичность к монозамещенным гуанидинам, например, которые содержатся в бораргининовых пептидах.
Пример 1,а. 1-амино-4-бром-бутилборонат пинандиол HCI.
NH2 — CH((CH2)aBr)B02-СюН я НС!
Туг = L-тирозин
Vai = 1-валин
Там, где прибавлен префикс D, упомянутые сокращения обозначают аминокислоту D-конфигурации. Там, где прибавлен префикс 0 или L, упомянутые сокращения обозначают то, что аминокислота может иметь или конфигурацию D, или конфигурацию 1, Используемый термин N-концевая защитная группа относится к различным аминоконцевым защитным группам,, используемым в синтезе пептидов; Примеры пригодных групп включают ацильную за15 щитную группу, например ацетил (Ac), бензоил (Bz), или алифатические уретановые защитные группы, например третбутоксикарбонил (Boc).
Приводимые далее в описании примеры
20 иллюстрируют конкретные варианты осуществления изобретения. Все указанные точки плавления не откорректированы. Все части приведены в весовых частях, а температуры указаны в С. Химические сдвиги в результате спектроскопии протонного ядерного магнитного резанЬнсэ (ЯМР или ЯМР) .
1 . указаны в дельта-единицах, частях на млн., исходя из внутреннего тетраметилсиланового стандарта. Многочисленные сокращеЗ0 ния, используемые в указанных примерах, имеют следующие значения: TFA — трифторуксусная кислота; DMF-N,N-диметилформамид; МС вЂ” масс.-спектрометрия; TCX —: тонкослойная хроматография; оф-TCX — тон85. кослойная хроматография с обращенной фазой. Сложноэфирные защитные группы барных кислот имеют аббревиатуры: -СвН 12"= пинаконовая группа и -C>oH16 = пинандиоловая группа.
40 Все аминакислотные остатки представ. лены в L-конфигурации, если не оговорено особо.
TCX и оф-TCX осуществляют на пластинках из силикагеля 60 фирмы E.Merk u
1807988
4-бром-1-хлорбутилборонат пинандиол получают по методике, описанной
Maneson и др, В обычном эксперименте осуществляют гидроборирование аллилбромида (173 мл, 2 моль) бораном пирокате- 5 хина (240 мл, 2 моль) путем. прибавления борэна к аллилбромиду с последующим наrðåâàíèåì реакционной смеси в течение 4 ч до 100 С в атмосфере азота. Полученный продукт, пирокатехин 3-бромпропилборо- 10 ната (т.кип. 95 — 102 С, 0,25 мм), выделяют перегонкой с выходом 49 . Указанный пирокатехиновый эфир (124 г, 0,52 моль) трансэтерифицируют (+)эльфа-пинандиолом (88 г, 0,52 моль) при смешивании их в 15
50 мл тетрагидрофурана (THF), интенсивно перемешивая указанную смесь в течение
0,5 ч при 0 С, а затем 0,5 часа при комнатной температуре. Растворитель упаривают и прибавляют 250 мл гексана. Пирокатехин 20
: удаляют в виде кристаллического твердого вещества, Количественный выход получают путем последовательного разбавления гексаном до объема 500 и 1000 мл с выделением кристаллов при каждом разведении, При 25 упаривании растворителя получают продукт (147 г) в виде масла.
Вычислено, pl С51,85 Н7,38; Br26,54;
С1зН2202 В гВ:
Найдено, : С 52,85; Н 7,30, Br 26.58.: 30
4-бром-1-хлорбутилбороната пинандиол получают. гомологизацией соответствующего пропилбороната. Хлористый метилен (34,8 мл,.0,540 моль) растворяют в 500 мл
THF и затем медленно прибавляют к 1,54М н-бутиллития в гексэне (350 мл, 0,540 ммоль) 35 при-10Q C. Пинандйол 3-бромпропилборо: ната (148 r, 0,490 моль) растворяют в 500 мл
THF, охлаждают до точки замерзания ука. занного раствора и вводят в реакционную смесь. Хлорид цинка (33,5 г, 0,246 моль) рас- 40 творяют в 250 мл THF, охлаждают до 0 С и . прибавляют несколькими порциями к реакционной смеси. Реакционную смесь при одновременном перемешивании нагревают постепенно до комнатной температуры в 45 течение ночи, Затем растворитель упаривают, а полученный осадок растворяют в гексане и промывают водой. После просушивания над безводным сульфатом магния и фильтрования растворитель удаля- 50 ют с выходом целевого продукта (140 г), Пинандиол 1-амино-4-бромбутилбороната получают путем растворения гексэметилдисилизэна (28 r, 80 ммоль) в 30 мл THF, охлаждения полученного раствора до -78 С 55 и прибавления к нему 1,62N н-бутиллития в гексане (49,4 мл, 80 моль), Затем раствор медленно нагревают до комнатной температуры, повторно охлаждают до -78 С и прибавляют пинандиол 4-бром-1-хлорбутилбороната (28 г, 80 моль) в 20 мл THF, Реакционную смесь медленно нагревают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи, Растворитель удаляют упариванием, вводят сухой гексан (400 мл) и получают осадок, который выделяют фильтрованием в атмосфере азота, Фильтратохлаждаютдо-78 С идобавляют4н, HCI в диоксане (60 мл, 240 моль). Затем реакци- . онную смесь медленно нагревают до комнатной температуры и при этой температуре перемешивают ее 2 ч. Полученный продукт (20 г) выделяют фильтрованием в виде твердого вещества. После просушивания в вакууме неочищенный продукт растворяют в хлороформе и нерастворившееся вещество выделяют фильтрованием. Фильтрат упаривают и осадок растворяют в этилацетэте. Целевой продукт выкристаллизовывают из этилацетата с выходом его 15,1 г (т.пл. 142-144,5 С, (а)э
+16,7+0,80, С = 1,0 в абсолютном метаноле.
Элементный анализ для
С14Нгвй02ВгС!В:
Вычислено, . С 45;87, Н 7,16, N 3,82, В
2,95.
Найдено, : С.45,76, Н 7,21, N 3,79, В
3,04.
Пример 1,б. (0,L)1-амино-4-бромбутилборонат пинакон HCI. (ОА)КНг-СН((СН2)зВг1В02-С6Н12. НЬ.
Пинакон 4-бром-1-хлорбутилборонатэ пол уча ют по методу, описан ному для получения cooTBGTGTBóþùáro пинандиола (пример 1,а), за исключением того, что вместо пинандиола используют. пинакон, пинакон
3-бром-пропилбороната (т.кип. 60-64 С, 0,35 мм) и 4-бром-1-хлорбутилбороната пинакон (т.кип. 110-112ОС, 0,20 мм) перегоняют.
Элементный анализ для
С1оН1э02 ВгС1 В:
Вычислено, : С 40,38, Н 6,45
Найдено, : С 40,70, Н 6,37.
Хлористоводородную соль пинакона 1амино-4-бромбутилбороната также получают по методике примера 1,а. Целевой продукт выкристаллизовывают из смеси этилацетат:гаксан с выходом его 52 .
Элементный анализ для
C1oH22NO2BrCtB:
Вычислено, : С 38,19, Н 7,05, N4,,45,,CI
11,27, Br 25,41.
Найдено, : С 38,28, Н 7,39, N 4,25, С!
11,68, Br 26,00.
Пример 1,в, Гидрохлорид 1-амино-4хлорбутилборонат хлористоводородная соль пинакона, 1807988 (0,L)NHz-СН((СН2)зС!)В02-С6Н12 HCI, Синтез дипептида BOC (D) Phe — Pro — ОН
Пирокатехин 3-хлорпропилборонат осуществляют вначале с получения дипеп(т.кип, 80 — 85 С, 0,30 мм) и пинакон 3-хлорп- тидного бензилового эфира, а затем удалеропилового эфира бороновой кислоты ния указанного сложного эфира (т.кип. 63 С, 0,20 мм) получают по методике 5 каталитическим гидрированием. Воспримера 1,а за исключением того, что вме- (D)Phe-OH (10,0 r, 37,7 ммоль) растворяют в . сто аллилбромида используют аллилхлорид, 50 мл THF и к полученному раствору прибава вместо пинандиола берут пинакон. ляют N-метилморфолин (4,14 мл, 37,7 о
Элементный анализ для CgН Найдено, %: С 53,41, Н 8,15, CI 16,81. хлормуравьиной кислоты (4,90 мл, 37,7 Гомологиэацию также осуществляют по ммоль). Через 5 мин в реакционную смесь методике примера 1,а, а полученный про- вводят Н-Pro — OBZ1, HCI(9,11 г,37,7ммоль), дукт выделяют перегонкой (т.кип. 95 С,. растворенный в.50млхлороформаиохлаж0,25 мм) с 65% выходом. 15 денный до -20 С. Прибавляют триэтиламин Элементный анализ для C Вычислено, %: С 47,47, Н 7,58, С! 28,02. перемешивают 1 ч при -20 С и 2 ч при комНайдено, %: С 47,17, Н 7,45; CI 27,75. натной температуре. Реакционную смесь Хлористоводородную соль пинакона 1- фильтруют и фильтрат упаривают. Оеадок амино-4-хлорбутилового эфира бороновой 20 растворяют в этилацетате с последующим (борной) кислоты получают по методике, . промыванием 0,2н. HCI, 5%-ным водным аналогичной примеру 1,а. Целевой продукт . раствором бикарбоната натрия и насыщенвыкристаллизовываютиззтилацетата с пол- . ным водным раствором хлористого натрия. учением 8,8гпродукта(т.пл,132-135,5 С) vi Органический слой сушат над безводным 2,2 r продукта (т.пл. 145-147 С). Продукт с 25 сульфатом натрия, фильтруют и упаривают т.пл. 145-147 C используют для анализа.. с получением 15,2 r Boc — (D)Phe-Pro-OBZ1 в Элементный анализ для C1QH22N02CIB: виде масла. Полученный бензиловый эфир Вычислено,%; С44,47, Н8,23, N5,19, В - (15,2 г) растворяют в 100 мл метанола и 4,00. - " .: затем гидрируют при начальном давлении Найдено, %; С 44,01, Н 8,23. N 4,77, В 30 40 фунтов/дюйм (2,812 кг/см ) в аппарате 3,80.. ..: .;:. - Парра в присутствии 0,5 г 10% палладиевой Пример 1,г. (D,L)1-амино-5-бромпен- - . черни (Pd/С). Реакционный раствор фильт- . . тилового боронат эфира бороновой кислоты ".. руют через цели гтм и упаривают с выходом пинакон НС!.. ; .: -.:. :.: твердого вещества. Указанный твердый (О,! )ИН2-CH((CH2)4Br)802CpH12 HO.:35 продукт выделяют и промывают этилацета Пинакон 4-бромбутилового эфира боро- . том, а затем простым эфиром с получением новой кислоты получают по методу, описан- 10 г требуемого продукта (т.пл, 176,5ному для получения пинандиола . 177 С). 3-бромпропилового эфира борной кислоть! .. Элементный анализ для C>gHmNzOg, (пример 1,а); эа исключением того, что ал- 40 (%): лилбромид заменяют на 4-бром-1-бутен, а Вычислено: С 62,95, Н 7,24, N 7,73. пинандиол на пинакон, Продукт выделяют в Найдено: С 62,91, Н 7,15, N 7,53. виде масла (т.кип. 77 С, 0,3 мм), После го-: Boc(D)Phe-Pro NH-CH((CH@Br)B jpH
Вычислено, %, H; 310,47. ангидрид Вос — (D)Phe-Pro-OH получают Найдено, %:Н: 310. при растворении указанной кислоты (4,94 r, Целевой продукт хлористоводородную :. 13,6 ммоль) в 30 мл THF с последующим соль пинакона 1-амино-5-бромпентилового 50 прибавлением N-метилморфолина (1,50 мл, эфира бороновой кислоты получают по ме- 13,6 ммоль). Затем реакционный раствор охтодике примера 1,а при выходе 35%. лаждают до -20 С и добавляют иаобутилоЭлементный анализ для вый эфир хлормуравьинойкислоты(1.77 мл, С11Н24МОгВгВС!; %: 13,6 ммоль). После перемешивания в течеВычислено: С 40,22, H 7,36, N 4,26, Ct 55 ние 5 мин при -20 С в реакционную смесь 10,79, Вг24,32, В 3,29. вводят амин, который получен в примере Найдено; С 39,23. Н 7,18, N 4,04, Cl 1,а, NH2-CH((CH2)SBr)BO2 C10H16 HCI (5 г, 15,21, Br 25.66, В 3,75, 13,6 ммоль), растворенный в 10 мл охлажПример 2. Boc-(D)Phe-Pro — NH- денного хлоформа. Охлажденный тетрагидСН((СН2)з В г)В 02-С1оН ю. рофуран (10 мл) и триэтиламин (1,90 мл, 13.6 1807988 ммоль) прибавляют к реакционной смеси и перемешивают смесь в течение 1 ч при -20 С и примерно 2 ч при комнатной температуре. Смесь фильтруют и оставшуюся жидкость в фильтрате упаривают. Осадок растворяют в этилацетате и промывают 0,2н. HCI, 5%-ым водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором натрийхлорида. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют, а растворитель упаривают с выходом 9 г продукта в виде масла. Указанный продукт растворяют в метаноле и хроматографируют на колонке 2,5 х 50 см с LH-20. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и упаривают с получением 5,8 г твердого вещества. ТСХ в смеси метанол/хлороформ (1:9) показывает единичное пятно, Rr 0,70, Масс-спектроскопия (FAB) для СззРз9Г1з06В Вг: Вычислено: +Н: 674,30 Найдено: 674,30. Il р и м е р 3. Вос — (D)Phe-Pro-NH— СН((СН2)зйз)В 02 — C10H16. Продукт примера 2. Вос — (D)Phe — Pro— NH — СН((СН2)зВДВ02 — C1oH16 (4,4 г, . 6.54 ммоль) растворяют в 7 мл диметилформамида (ДМР) и аэид натрия (0,919 г, 14,1 ммоль) прибавляют к указанному раствору. Реакционную смесь нагревают при 100 С в течение 3 ч. Прибавляют этилацетат (100 мл) к реакционной смеси и затем промывают водой и насыщенным водным раствором хлористого натрия. Полученную органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и упаривают. Получают 4,1 г твердого продукта. Указанный продукт хроматографируют на колонке 2,5 х 50 см из LH-20 в метаноле. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, оставшуюся жидкость упаривают с выходом 2,3 г названного азида. ТСХ в системе метанол:хлороформ (1 9) показывает единичное пятно, Rf 0;76. Элементный анализ для СззН46К606В, (%), Вычислено: С 62,35, Н 7,63, N 13,33, В 1,70. Найдено: С 63,63, Н 8,02, N 11,58. B 1.80. Масс-спектроскопия (FAB) для СззН4эй606В Вычислено: Н: 637,39 Найдено: 637,49, Пример 4. Вос-(D)Phe — Pro — NH— CH((CH2)3NH2)B02 — С1оН16 Бензолсульфокислота. Азид примера 3 (8,80 r, 13,8 ммоль) растворяют в 150 мл метанола и гидрируют нэ установке Парра при давлении 40 фун5 «бензолсульфокислота В ос-(D)Phe-Pro — 6opoArg — С1оН16х «бензолсул ьфокислотэ. 15 В oc — (0) P he-Pro — бороАгд — C1oH1Ф «бензосульфокислоту, полученную в приме55 50 тов/дюйм (2,812 кг/смз) в присутсгвии 0,50 г 10% палладиевой черни и бензолсульфокислоты (2,19 г, 13,8 ммоль), Через чэс катализатор удаляют и после упаривания раствора получают 9,9 г требуемого продукта. оф-ТСХ в системе растворителей метанол:вода (85:15) показывает пятно в УФ-области, Rf 0,91 и пятно. позитивное к нингидрину Rf 0 52. Пример 5. Вос — (D)Phe — Pro-NHСН((СН2)з- N H — С(И Н) 1ч Н г) В 02- С1о Н16у ре 4 (4,6 г, 6,11 ммоль), нагревают с обратным холодильником при 100 С в 20 мл абсолютного этанола, содержащего цианамид (50 мг/мл), Ход реакции регулируют офТСХ в системе растворителей метанол: воды (85:15), где наблюдается исчезновение нингидринового пятна из исходного материала амина (Rf 0,54) и появление красителя SakaguchI на полученном продукте (Rf 00,13). Указанный продукт можно обнару- . жить после нагревания с. обратным холодильником в течение 18 ч, причем его уровень постепенно повышается. Через 7 дней; когда амин нельзя обнаружить, реакционный раствор концентрируют до примерно 50 об.% пассивным упариванием. Затем реакционный раствор фильтруют, сгущают и хроматографируют на 2,5 х 100 см колонке с LH-20 в метаноле. Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяют и после упэривания получают 3,7 г требуемого продукта, Порцию продукта (2,3 г) кристаллизуют смесью этилацетат:гексан с выходом 0,89 г вещества, а остаток (1,2 г) получают порошкованием простым эфиром в виде твердого продукта. Масс-спектроскопия (FAB) для С34 Н 53 ч 6065 В; Вычислено: Н: 653,42 Найдено, 653,38. Элементный анализ для C4oH5gN60gSB Н20, % . Вычислено: С 57,95, Н 7,43, N 10,14, В 1,30 Найдено: С57,20, Н 7,14, N 10,94, В 1,01. Пример 6. Н вЂ” (D)Phe-Pro — 6opoArg— СюН16 2HCI, Продукт примера 5, Вос — (D)Phe-Pro— боро Arg-С1оН ы,бензолсульфокислота (1.17 г, 1,54 ммоль), подвергают взаимодействию с 5 мл 4н. хлористого водорода в диоксане в течение 15 мин при комнатной температуре. Полученный продукт осаждают при добэв1807988 лении простого эфира, выделяют и промывают простым эфиром с просушиванием в вакууме. Затем продукт растворяют в 10 мл воды и наносят на анионно-обменную колонку 5 мл с Вио-RADAGI X8™ (СГ-форма, BI0-RADCo., Richmond, CA) с последующим промыванием колонки водой (примерно 30 мл). Элюент упаривают в вакууме, а осадок порошкуют простым эфиром с выходом требуемого продукта (0,80 r). Масс-спектроскопия (FAB) для С29Н45М604В . Вычислено: +Н: 553,37 Найдено: 553,40 и 538,40 (не идентифицирован). Элементный анализ Н-(D)Phe — Pro — боpoArg-С1оН16 ° 1BSA. TFA: Найдено; 553,4 Пример ы 7 и 8. Ас-(D)Phe-Pro — боpoArg-С1оН16 Н CI (пример 7) Ас-(D)Phe — Pro — бороАг9 — ОН,HCI (пример 8). Вос-(D)Phe Pro-бороАг9-С1оН16к хбензосульфокислота, продукт примера 5 (0,86 г, 1,13 ммоль) подвергают взаимодействию с безводной трифторуксусной кислотой (TFA) (примерно 5 мл) в течение 15 мин при комнатной температуре. Избыток TFA удаляют упариванием, а полученный осадок порошкуют простым эфиром с выходом 0,76 продукта. Указанный продукт (0,70 r, 0,91 ммоль) растворяют в смеси, состоящей из 2 мл диоксана и 1 мл воды, Уксусный ангидрид (0,47 мл, 5 ммоль) и бикарбонат натрия (0,42 r, 5 ммоль) прибавляют к реак, ционному раствору, Затем полученную смесь перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре. Добавляют этилацетат (50 мл) и воду {5 мл). Образовавшиеся фазы разделяют и органический слой сушат над безводным сульфатом натрия. После фильтрования и удаления растворителя упариванием получают 0,56 г полутвердого вещества. Полученную пробу растворяют в 4 мл ледяной уксусной кислоты с последующим разбавлением раствора 16 мл воды. Затем сразу же наносят нэ колонку с 15 мл SP-сефадекса™ (Н -форма) и уравновешивают 20 -ым раствором уксусной кислоты. Колонку промывают 300 мл 20 -ой уксусной кислоты и устанавливают линейный градиент концентраций от 100 мл 20%-ой уксусной кислоты до 100 мл 20 -ой уксусной кислоты, содержащей 0,30 н.хлористоводородной кислоты, Фракции, собранные в градиенте концентрации от 0,08 до 0,17н. HCI, содержат N-ацетиловый пептид(0.29 г) в виде смеси из свободной бароновой кислоты и сложного пинандиолового эфира. Сложный эфир пинандиола и свободную бороновую кислоту разделяют хроматографией на 2,5 х 100 см колонке, содержащей LH-20 в метаноле. Размер фракций составляет 8,2 мл. Пинандиоловый эфир (102 мг) элюируют в фракциях 41 — 43, в то время как свободную борную кислоту (131 мг) постепенно вымывают в фракциях 45 — 129. Масс-спектроскопия (FAB) (пример 7): Ас — (D)Phe — Pro — бороАг9 — С1оН6 для С31Н47Й605В: Вычислено+Н: 595,33 Найдено: 595,33 Масс-спектроскопия (FAB) (пример 8) 15 Ас — (D)Phe — Pro — 6opoArg — OH,HCI для C21H33N605: Вычислено+Н: 449,60 . Найдено; 579,24 — 581,24. Последние данные нельзя объяснить Тем не менее данные ЯМР совпадают со структурой свободной бороновой кислоты, так как заданные полосы испускания для пинандиоловой группы, например как синглеты метильных групп при дельта 0,85 (ЗН). 1,30 (ЗН) и 1,36 (ЗН), не наблюдались, В качестве дополнительного доказательства 25 этой структуры образец продукта свободной бароновой кислоты переэтерифицируют с выходом материала примера 7. Аналитическую пробу (20 мг) обрабатывают двухкратным избытком пинандиола (14 мг) в 3 мл 30 метанола в течение 5 мин, Растворитель упаривают, а избыток пинандиола удаляют порошкованием простым эфиром указанного образца с выходом требуемого продукта(26 мг). Масс-спектроскопия (FAB) (найдено: 595,38) и данные ЯМР совпадают со структурой, предполагаемой для этерифицированного продукта, и почти идентичны пинандиоловаму продукту примера 7. Пример 9, Ас-Phe áoðîÀãgС1о Н16 Х С1. По методике, описанной в примере 2, 40 TFA, который связывают с NH2— СН((СН2)3Вг)В02-С1ОН16 HCI (продукт примера 1,а. 1 r, 2,73 ммоль), растворенного в 10 мл охлажденного THF с выходом 1,47 г белой пены. Указанный продукт перемешивают в течение ночи вместе с гексаном. Получают твердое вещество 1,01 г (т.пл. 106,5 — 109 С). 55 Элементный анализ для C25H36N204BrB, %: Вычислено: С 57, 81, Н 7.00, N 5,40, Br 15,40, В 2,08 Найдено: С 58,33, Н 7.33. N 4,76, Br 14,18, В 1,80. получают Ас — Phe — NH-CH((CH2)3Br)B02— 45 С1оН16. Затем получают смешанный ангидрид Ас-Phe ОН (0,565 г, 2,73 ммоль) в 10 мл 1807988 Масс-спектроскопия (FRB) для C25H36N204B гв: Вычислено +Н; 519,20 Найдено: 519,23. Ас-P he — NH-СН((С Н2)зйз)В 02-С1о Н16 получают при обработке Ac-Phe — NH— СН((СН2)зВг)В02 — С1оН16 (3,22 г, 6,20 ммоль) натрийазидом по методике, описанной в примере 3. Полученный продукт (3,03 г) хроматографируют на колонке с Н-20, Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяют и упаривают, Осадок порошкуют гексаном с выходом 2;21 г указанного азида. Бензолсульфонат Ас — Phe — бороОгп— C)oH16 получают из указанного азида Ас— Phe-NH-СН((СН2)зйз)В02-С1оН16 (2,21 г, 4,59 ммоль) по методике примера 4 за исключением того, что гидрирование осуществляют при атмосферном давлении. После фильтрования и упаривания растворителя путем порошкования простым эфиром получают требуемый продукт (2,22 r), Ас — Phe — бороАгц — CroH16x хбензолсульфонат получают путем обработ. ки соединения Ас-Phe — бороОг9 — С1оН16 бензолсульфокислота (2 г, 3,26 ммоль) 10 мл раствора цианамида (100 мг/мл) в этаноле, Реакцию гуанидирования осуществляют по методике примера 5 за исключением того, . что реакционное время составляет 3 дня, а реакционная смесь содержит смесь из исходного материала и полученного продукта. Указанная смесь требует дополнительной . очистки, которую по всей вероятности можно не проводить, продлив продолжительность реакции. Реакционный раствор далее концентрируют и хроматографируют на колонке 2,5 х 100 см из LH-20 в метаноле. . - Ф.ракции, содержащие требуемый продукт, обнаруженные при помощи подкрашиваю. щего агента Sakaguchi, объединяют и упаривают с выходом 1,4 г продукта. Полученный продукт (1,2 г) растворяют в 6 мл уксусной кислоты, разбавляют 30 мл воды и получают раствор молочного цвета, Этот раствор наносят на колонку объемом 30 мл с SP-Сефадексом™ С-25 ("Н-форма), доведенную до равновесного состояния 20%-ым водным раствором уксусной кислоты. Далее колонку промывают 240 мл 20%-ой уксусной кислоты и устанавливают линейный градиент концентрации от 250 мл 20%-ой уксусной кислоты до 250 мл 20%-ой уксусной кислоты, содержащей 0,30 н, соляной кислоты. Фракции, элюированные из колонки в интервале от 0,12 до 0,16 н. соляной кислоты, объединяют с выходом 0,42 r требуемого пептида в виде смеси свободной борной кислоты и сложного эфира пинандиола. Указанную 55 нагревают до комнатной температуры с последующим перемешиванием ее в течение ночи. Растворитель удаляют путем упаривания. Осадок растворяют в этилацетате и промывают последовательно водой, 5%-ым раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлористого натрия. Органическую фазу полученной смеси сушат над безводным сульфатом натрия и после концентрирования получают требуемый продукт продукт в виде кристаллического твердого вещества (1,37 г, т.пл. 146,5— 148 С). При исследовании структуры кристалла получен следующий химический состав, Элементный анализ для С2< Ha2N204BrB, %: Вычислено: С 53,98, Н 6,92, N 6,00, Br 17,10, В 2,31. Найдено: С 54,54, Н 6,78, N5,,89,,Br 16,46, В 3,40. смесь растворяют в метаноле (10 мл) и для этерификации свободной бороновой кислоты прибавляют 80 г пинандиола. После переме шива ния в течение 30 мин 5 растворитель упаривают, а после порошкования осадка простым эфиром получают 0,28 г требуемого продукта. Элементный анализ для . С26Н40М504В НС! 2Н20, %: 10 Вычислено; С 54,78, Н 8,15, N 12,30, В 1,90. Найдено: С 55,34, Н 7,83, N 11,66, В 1,99. Масс-спектроскопия (FRB) .для С26 Н 40М504 В; 15 Вычислено Н: 498,32 Найдено; 498,31. Пример 10. Ас — (D,L)Phe — (ОА)-боpoArg — С16Н 12; Промежуточное .соединение Ас20 (0Л )Р пе — (Р,L) — NH — СН вЂ” ((СН2)зВг)В02 — С6Н12 получают модифицираванием методов. описанных в примере 1 и 2. Хлорангидрид AcPhe — 0H получают при взаимодействии Ас — Phe — ОН (30 г, 0,145 моль) с пентахлори25 дом фосфористой кислоты (30 r, 0,144 моль) в 175 мл THF при -10 С, Реакционную смесь перемешивают при 0 С приблизительно в течение 1 ч, затем разбавляют до объема 350, мл охлажденным простым эфиром, продукт 30 выделяют в виде твердого вещества, промывают холодным простым эфиром и после высушивания в вакууме получают 21 г продукта. Активированное ацетилфенилпроизводное (14,8 г, 65,6 ммоль) растворяют 35 в 40 мл THF и прибавляют к продукту взаимодействия пинакона 4-бром-1-хлорбутилбороната и гексаметилдисилизана, приготовленных в 20 ммольной концентрации, при -78 С. Затем реакционную смесь 1807988 Алкилбромид превращают в соответст- 5,33 г, 14.5 ммоль) по методике, описанной в вующий азид по методике примера 3, Про- примере 2, за исключением того, что не выдукт выкристаллизовывают из этилацетата полняют хроматографии на колонке с LH-20. (т.пл. 143-144 С). Полученный продукт выкристаллизовывают Элементный анализ для С21Нз2%04В, 5 из этилацетатэ с выходом в первом погоне Ж: 2,47 г продукта (т.пл. 132 — 134 С) и 5,05 г Вычислено; С 58,74, Н 7,53, N 16,31, В продукта(т.пл, 133 — 135 С) во втором погоне. 2,53.. . При оф-ТСХ в системе метанол: вода (85:15) Найдено: С 58,85, Н 7,48, N 16,53, В 2,93. отмечено единичное пятно. Rf 0,29, Полученный азид превращают.в соль 10 ЗлементныйанализдляСз7Н51йз06ВгВ. бензолсульфокислоты Ас (О,б)Рпе--(ОА)-бороОгп-СвНд по методике примера4за иск- Вычислено; С 61,32, Н 7,11, N 5,80, Br лючением того, что гидрирование проводят 11 03. приатмосферном давлении, . Найдено: С 61,21, Н 7,02, N 5.59, Br Ас-(0,(.)Рhе-(D,1)бороОrn — С6Н12Х15 10,22. хбензолсульфокислота (0,243 г, 0,433 ммоль) Вос (D)Phe — Phe-NH — СН((СН2)зйз)В02подвергают взаимодействию с цианамидом -С1оН16 получают при обработке соответству(0,20 г, 0,476 ммоль) при l00 С в 2 мл абсолют- ющего алкилбромида (7,15 г, 9,87 ммоль) азиного этэнола в течение ночи. Раствор кон- дом натрия по методике, описанной в центрируютипослепорошкования простым 20 примере 3, за исключением того, что для эфиром получают 0,21 г белого вещества. очистки не нужно проводить хроматографи, При оф-ТСХ отмечено характерное положи-. ческого разделения на колонке с LH-20. Тре. тельноеокрашиваниеполосыприиспользо-" буемый продукт элюируют из смеси вании красителя Sakaguchl в случае растворителей этилацетат,гексан в виде гебороаргининовых пептидов(И0-0.55) и ди- 25 ля и после выделенйя и промывания гекса. скретное пятно (Rf 0,68), соответствующее ном получают 3 г требуемого продукта в непрореагированному исходному материа-:. первом погоне и 2,9 г во второй порции.. лу. Полученный продукт(81 мг) повторно об-.: Бензолсул ьфонат Boc-(D)Phe — Phe — борабатывают 2 мл раствора цианамида {10 . poOrn-С1оН16 получают из указанного азйда мг/мл).в течение ночи по указанной методи-.. 30 (5,37 r, 7,82 ммоль) по методике, описанной ке и после порошкования простым эфиром, в примере 4, с выходом 5,33. При оф-ГСХ в получают.71 мг целевого продукта. . .. смеси метанол:вода (85. 15) отмечается инМасс-спектроскопия (FAB) для тенсивное положительное окрашивание ниC22H37N504Et: нгидрином, Rf 0,42 и слабое пятно в Вычислено +Н: 446,30. .. 35 УФ-области, 0;92 (образование пятна в УФНайдено:446,23и404,19(соогветствую- области при ЯГО;92 характерно для аминов .щий непрореагированному борорнитиново- или гуанидиновых соединейий, которые явму пептиду)..: .ляются солями бензолсульфокислоты). Следует иметь в виду, что методика по Масс-спектроскопия (FAB) для примеру 5 представляет собой наилучший 40 Сз7Н5зйа06В: способ получения бороаргининовых пепти- . . Вычислено+Н: 661;76. дов и отличается в том, что используют боль- . Найдено: 661,14. ший избыток цианамида и более. Boc — (D) — Phe — Phe-бороАг9-С1оН16 полпродолжительное время взаимодействия.: учают Ilo методике, описанной в примере 5. "Пример 11. Вос-(D)Phe-Phe-бо- 45 Бороорнитиновыйпептид(4.83г,5,90ммоль) poArg-С1оНМи бензолсульфонат.: . обрабатывают раствором цианамида (50 Вос-(D)Phe-Phe — ÎH получают по мето- мг/мл) в 20 мл абсолютного этанола в течедике, описанной для получения дипептида . ние 7 дней. Из реакционной смеси выделяют Вос-(0)Рйе-Pro — ОН в примере 2, После гид- порцию продукта, соответствующую 1 г исрирования сложного бензилового эфира 50 ходного материала, и нагревают отдельно полученный продукт выкристаллизовывают без обратного холодильника в течение ночи из смеси хлороформ гексан с выходом тре- с полным превращением эмина в гуанидинобуемого пептида (т.пл. 133 — 133,5 С). соединение. После хроматографии на колонЭлементный анализ для C23H28N205. -,"ь: ке с LK-20 и порошкования продукта Вычислено: С 66,96, Н 6,86, и 6,79. 55 простым эфиром получают 0.52 г требуемого Найдено, С 66,75, Н 6,79, N 6,56. борнила. Вос (0)Рйе Р м МН «:Н((СН2ЦЦВ02"С10Н16 Элементный анализ для C)4HriNg0gSB, получают путем смешивания Boñ-(0)Phe-Phe-0H (6 r, 14,5 ммоль) с NHz — Вычислено: С 61,38, Н 7,16, N 9,76, В -СН((СН2)зВг)ВОг-С1оН16 HCI (пример 1.а, 1,25, 17 1807988 30 насыщаемости раствора добавляют нужное 35 45 55 Найдено: С 59,69, Н 7,41, N 9,82, В 1.26. Масс-спектроскопия (FAB) для C36H55N6O6В: Вычислено Н: 703,43 Найдено: 703,49. Пример 12. Н-(D)Phe-Phe-бороАгд— С16Н16 2Н С!. Бензолсульфонат Вос — (D)Phe-Phe — боpoArg — C1oH16, полученный по примеру 11 (0,59 г, 1,25 ммоль), деблокируют по методике примера 6 за исключением того, что пробу наносят на ионнообменную колонку в 20% этаноле с последующим промыванием указанной колонки 20%-ым раствором этанола. Продукт получают (0,424 r) в виде белого твердого вещества. Масс-спектроскопия (FAB)- . для C33H47N604B: Вычислено +Н: 603,38. Найдено; 603,41, Пример 13. Бензолсульфат Ас — Ala— Lys(B oc) — ба роА гд — C1o Н16. Ас — Ala-Lys(Boc) — OH получают путем сопряженной реакции N-оксиянтарной кислоты имидоэфира Ас — Ala — ОН. полученного по методу Anderson, с Н вЂ” Lys(Boc) — ОН. N-оксикукцинимид Ас — Ala — OH (6,25 г, 27,4 ммоль) растворяют в 30 мл диоксана и прибавляют к раствору Н вЂ” Lys(Boc) — ОН (7,50 r, 30,4 ммоль), который растворен в смеси, состоящей из 30 мл 1 í. NaOH и триэтиламина (2,12 мп, 15 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи, а затем подкисляют соляной кислотой. Для получения требуемой количество сухого хлорида натрия. Продукт экстрагируют в этилацетате и затем промывают 0,2 н. HCI, полученной в насыщенном водном растворе хлористого натрия. Растворитель удаляют путем упаривания. После кристаллизации продукта из смеси этилацетат:гексан получают 7.,3 г требуемого продукта (т. пл. 86-89 С). Ас-А1а — Lys(Boc)+JH — СН((СН2)3Вг)ВО2-С1оН16 йолучают по методике примера 2 за исключением того, что получаемый продукт очищают фракционированной кристаллизацией из этилацетата. B продукте (1,13 г), полученном во второй и третьей фракциях, отмечается единичное пятно при оф-TCX в смеси растворителей метанол:вода (85;15) при значении Rf 0,51. Тонкослойную пластинку подвергают воздействию паров хлористоводородной кислоты, на которой после прибавления нингидринового индикатора обнаруживают целевой амин. Ac — Al а — Lys(B ос) — NH-С Н((С H2)ÇNÇ)B 02— -C1OH16 получают из соответствующего алкилбромида (1,95 r, 2,9 ммоль) по методике, описанной в примере 3. за исключением то15 25 го, что очистку продукта осуществляют кристаллизацией его из зтилацетата, а не хроматографией ía LH-20. После кристаллизации неочищенного продукта (1,6 г) получают 0,55 г чистого продукта (т,пл. 79 — 84 С) и 0,96 г осадка, Ниже представлен химический состав кристаллического продукта. Элементный анализ для СзоН52Й707В, % ° Вычислено: С 56,86, Н 8,29, N 15,48, В 1,71. Найдено: С 56,76, Н 8,26, N 15,89, В 1,65. Бензолсульфонат Ас-Ala Lys(Boc)-бороОгп— - С16Н16 получают из соответствующего алкилазида (0,433 r, 0,683 ммоль) по методике, описанной в примере 4. После удаления катализатора и растворителя получают названный продукт(0,45r) при порошковании простым эфиром, Масс-спектроскопия (FAB) для СЗОН54К507В: Вычислено. Н: 608,42, Найдено: 608,49. Бензолсульфонат Ac — Ala — Lys(Boc) — боpoArg С1оН16 получают при взаимодействии соответствующего бороорнитинового пептида с цианамидом по методике, описанной в примере 5, Хроматографические фракции, содержащие требуемый продукт, порошкуют простым эфиром с выходом 0,83 г продукта в виде белого твердого вещества. Элементный анализ для C37H62N7010BS, % ° Вычислено: С 55,00, Н 7,75. N t2,14, В 1,34 Найдено: С 54,09, Н 7,53, N12,,22, В 1,34. Пример 14. Ас Ala-1.ys-бороАгд-С1оН16х х 2HCl. Б ензолсул ьфонат As — Ala-Lys(Boc) — боpoArg — C1oH16 (0,200 r, 0,248 ммоль) деблокируют по методике примера 6. После ионнообменной хроматографии, упаривания растворителя, просушивания в вакууме и порошкования простым эфиром получают 0,14 г требуемого продукта, Масс-спектроскопия (FAB) для C26H46N705B: Вычислено Н: 550,39, Найдено: 550,42. Пример 15. Бензолсульфонат BocLeu — Gly — Leu — Ala — бороАгд — С1оН16. Вос — Leu — Ala — QBzLполучают по методике синтеза дипептидов, описанной в примере 2. Вос-Leu — Ala — OBzL (23,7 г, 57,7 ммоль) растворяют в 40 мл безводной трифторуксусной кислоты, Через 15 мин удаля ют избыток трифторуксусной кислоты путем упаривания и после обработки полученного 1807988 19 анализ осадка простым эфиром получают трифторацетат Н вЂ” еа — Ala — OBzL в виде кристаллического продукта (22,8 r). Элементный анализ для C>8H25Nz05Fg, %: Вычислено; С 53,19, Н 6.21, N 6,89. Найдено: С 53,37, Н 5 68, N 6,84. Boc-Gly — Leu — А!а-OBzL получают реакцией сопряжения Вос — Gly — ОН (5,70 г, 32,6 ммоль) с Н-Leu-Ala-0BzL по методике смешанного ангидрида, описанной в примере 2. Продукт(13.8 r) получают в виде аморфного твердого вещества. Вос-Gly-Leu — AlaOBzL деблокируют трифторуксусной кислотой по методике, описанной для приготовления Н-Leu Ala-QBzL, за исключением того, что трифторацетатная соль может быть растворена в простом эфире. Продукт растворяют в этилацетате и очищают безводным хлористым водородом. После осаждения полученного продукта при добавлении простого эфира получают 7,7 г хлорида Н-Gly-Leu — Ala — ОВг1 в первом сборе, Boc — Leu-Gly — Leu — Ala — OBzL получают сопряженной реакцией Boc — Leu — ОН (2,62 r, 10,5 ммоль) с Н вЂ” Gly-Leu — Ala — OBzl no методике получения смешанного ангидрида, описанной в примере 2. После кристаллизации полученного продукта из смеси этилацетат:гексан получают в первом сборе 2,7 г названного продукта (т.пл. 95 — 96 С). Элементный анализ для Cz8H46N407, : Вычислено: С 61,89, Н 8,26. N 9,96. Найдено; С 62,00, Н 8.40, N 9,83. Boc Leu-6!у-Leu-Ala ОН получают ка. талитическим гидрированием сложного бензилового эфира (2,6 r, 4,62 ммоль) по методике, описанной в примере 2, с выходом 2,1 r требуемого продукта. После кристаллизации полученного продукта из горячего раствора этилацетата получают 1,4 г вещества, Элементный анализ для CzzH4oN407, : Вычислено: С 55,90, Н 8,55, N 11,86 Найдено: С 55,42, Н 8,47, N 11,73. Вос-Еео-б!у-Leu-Ala-NH — СК((СН2)з Вг) Х х В02-С18Н16 получают реакцией сопряжения Вос-Leu-Gly-Leu-Ala — ОН (1.40 г. 2,96 ммоль) с амином из примера 1,а по методике, описанной в примере 2. за исключением того. что не проводят хроматографического разделения. После кристаллизации продукта иэ смеси этилацетат:гексан получают 1,17 г требуемого продукта. При ТСХ в системе растворителей метанол:хлороформ (1:9) отмечено единичное пятно при значении Rf 0,68. Элементный для СЗ6Н6ЗМ508ВгВ, : Вычислено: С 55,10, Н 8,11, N 8,93. В 1,38. Найдено: С 55,96, Н 8,30, N 8,74, В 1,33, Соответствующий азид получают по методике примера 3 с 97 выходом, который превращают в Boc-Leu-Gly — Leu-Ala-бороОгп-С|оН ы согласно методу в примере 4. Аналитическую пробу приготавливают путем осаждения указанного продукта про10 стым эфиром и хроматографического разделения его на колонке с LH-20 с последующим элюированием из смеси хлороформа с гексаном, Масс-спектроскопия (FAB) для С36Н65М608В: В ычислено: Н: 721,50. Найдено: 721,55. Бензолсульфонат Вос-Leu-Gly -LeuAia — бороАг9 — C1p-Hi6 получают по методи20 ке, описанной в примере 5. Соответствующий бороорнитиновый пептид (0,695 r, 0,791 ммоль) подвергают взаимодействию с 5 мл раствора цианамида (50 мг/мл) в абсолютном этаноле. После хрома25 тографирования указанной смеси И порошкования простым эфиром получают 0,41 г требуемого продукта. Масс-спектроскопия (FAB) для С37Р67Й808В: 30 Вычислено: Н: 763,53 Найдено: 763,8. Пример 16. Бенэолсульфонат Н-LeuGly — Leu Ala-бороАгд — С1оН16 НCI. . Бензолсульфонат Вос-Leu Gly-Leu35 Ala — 6opoArg-С18Н16, полученный в примере 15 (0.050 r, 0,0543 ммоль), подвергают взаимодействию с 2 мл 4н.хлороводорода в диоксане в течение. 5.мин при комнатной температуре. Растворитель и избыток HCI 40 удаляют упа. Полученную пробу вы- сушивают над гидроксидом калия в вакууме в течение ночи, а затем после порошкования простым эфиром получают требуемый продукт (46 мг) в виде смешанной соли. 45 Масс-спектроскопия (FAB) для СЭ2Н59И806В: Вычислено Н; 663,47. Найдено: 663,50. Пример 17. Бензолсульфонат Bz — Glu50 (QBu) — Gly — бороАг9 — С1оН16. Bz — Glu-(0 8 u)-Gly-NH-СН вЂ” ((СНг)зВг)В02С1оН ы получают сопряженной реакцией BrGlu-(0Bu) — GIy-QÍ с укаэанным амином по методике, описанной в примере 2, Соответ55 ствующий азид получают в соответствии с методом, описанным в примере 3, а бороорнитиновый пептид получен по методике примера 4, Масс-спектроскопия (FAB) для C32H49N407B: 22 1807988 Вычислено Н: 613,38. Найдено: 6 i3,60. Конечный продукт получают по методике, описанной в примере 5, Масс-спектроскопия (FAB) для СЗЗН51М607В: Вычислено Н: 655,40, Найдено: 655,37, Элементный анализ для C39H57N601oSB, %; Вычислено: С 57,62, Н 7,08, N10,,34,,В 1,33. Найдено; С 57,43, Н 7,25, N 9,91, В 1,23. Пример 18. Бензолсульфонат Bz Glu— Gly — бороАгд — С1оН16. Бензолсульфонат Bz — Glu-(OBu) — Gly— бороАгд — С1ОН16 (0,13 г, 0,16 ммоль) растворяют в 5 мл диоксана, прибавляют бензолсульфокислоту (0,10 г, 0,66 ммоль) и реакционный раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре, После концентрации раствора до объема примерно 1 мл путем упаривания с последующим порошкованием простым эфиром получают твердое вещество (0.14 r). Полученный продукт хроматографируют на 2,5 х 50 см колонке с Н-20 в метаноле. Фракции, содержащие требуемый продукт, упаривают, а осадок порошкуют простым эфиром с выходом 53 г названного продукта. Масс-спектроскопия (FAB) для C29H43N607B: Вычислено Н: 599.34. Найдено: 599,35, 613,36 (не идентифицирован н). Пример 18,а. Бензолсульфонат Bz— Glu-áoðoÀrg — С10Н 16. Бензолсульфонат Bz-G iu — (OBu) — Gly— бороАгд — С1оН16 (пример 17, 0,20 r, 0,246 . ммоль) обрабатывают безводным хлористым водородом по методике. описанной в примере 6, в течение 45 мин. После порошкования указанного продукта данные ЯМР показывают, что примерно 30% трет-бутиловой защитной группы все еще находится в указанном продукте. Затем продукт подвергают взаимодействию с безводной триф торуксусной кислотой в течение 45 мин при комнатной температуре, TFA удаляют упариванием и после порошкования полученного осадка простым эфиром получают 143 мг названного продукта. Масс-спектроскопия (FAB) для C29P43N607B: Вычислено Н: 599,34. Найдено: 599,35. Пример 19. Бензолсульфонат Bz-Pro— Phe-бороАгд — С1ОН16. 40 для 45 содержащую 4 мл 0,50 н. трихлорида бора, полученного путем разбавления 1 н. трихлорида бора (Aldrich Chemical Со., Milwankee, Wl) до 50% сухим хлористым метиленом, и помещенную на баню с сухим льдом. Рас50 твор перемешивают при -178 С в течение 5 мин, затем колбу помещают на баню с льдом (О С), где раствор перемешивают в течение 15 мин. В реакционный раствор медленно прибавляют (5 мл) холодной воды с последующим разбавлением его до 120 мл 20%-ой уксусной кислотой, Органическую фазу отделяют и извлекают продукт. Водную фазу наносят на колонку объемом 20 мл на SP-Сефадексе™, уравновешенную 20%-ой уксус10 Bz Pro — Phe — ОН (т.пл. 200-201 С) получают по методике, описанной в примере 2, используемой для синтеза дипептидов, Элементный анализ для С21Н22М204, %: Вычислено: С 68,82, Н 6,06, N 7,65. Найдено: С 68.91, Н 6,09, N 7,47. Bz — Pro — Phe — NH — СН((СН2)зВ г)В 02 — С1ОН16 получают сопряженной реакцией Bz-Pro— Phe — ОН с указанным амином по общему методу, описанному в примере 2, за исключением того, что хроматографическое разделение не осуществляют. При ТСХ в смеси растворителей метанол:хлороформ (1:9) наблюдается обширное пятно при Rf 0,72 и следы при Rf 0,86. Масс-спектроскопия (FAB) C35H45N305B Br Вычислено Н: 678,27. Найдено: 677,95. Полученный алкилгалогенид превращают в азид и бороорнитиновый пептид по методике, описанной в примерах 3 и 4, Масс-спектроскопия (FAB) для (Bz — ProP he — бора Огп — С 1о Н16)-Ca5H47N4058: Вычислено Н; 615,37, Найдено: 615,42. Целевой бензолсульфонат Bz — Pro — PheбороАгд — C1oH16 получают по методике, опи-. санной в примере 5. Масс-спектроскопия (FAB) для C36H49N605S В: Вычислено Н: 657,39. Найдено; 657,13. Элементный анализ для C42H55N606SB, %. Вычислено: С 61,90, Н 6,82, N 10,31, B 1,33. Найдено: С 60,16, Н 7,27, N 9,79, В 1,44. Пример 20, Хлорид Bz — Pro — Phe — бо- . poArg-OH. Бензолсульфонат Bz-Pro-Phe áopoArg — C1oH16 (соединение примера 19, 0,64 r, 0,79 ммоль) растворяют в 4 мл хлори стого метилена и охлаждают до -78 С. Реакционную смесь сливают в колбу, 24 1807988 23 для / ной кислотой, Колонку промывают примерно 150 мл раствора 20 -ой уксусной кислоты с последующим установлением линейного градиента концентраций от 200 мл 20 -ой уксусной кислоты до 200 мл 20 ой уксусной кислоты, содержащей 0.30 н. HCI, Продукт элюируют при концентрации НО в интервале 0,08 — 0,15н. После упаривания растворителя, высушивания в вакууме и порошкования простым эфиром получают требуемый продукт (0,19 г), Масс — спектроскопия (FAB) для С26Н 35Й6058: Вычислено Н: 523,29, Найдено: 579,34 (не идентифицирован). Элементный анализ для С26Н36Й605С18, :, Вычислено: С 53,29, Н 6.55, N 14,34, В 1.84. Найдено: С 53,27, Н 6,58, N13,,25,,В 1,89. При этерификации названного продукта пинандиолом по методике, описанной в примере 8,а, получают продукт, свойства которого при ЯМР и МС совпадают с исходным сложным эфиром примера 19. Масс-спектроскопия (FAB) для С36Н49Й6058: Вычислено Н: 657,40. Найдено: 657,39, Пример 21. Хлористоводсродная соль Bz-Pro — Phe-6opoArg-F, 8z-Pro — P he — NH — СН (СНЕГИН-C(N H)NHz) х81=2 НС1. Bz-Pro — Phe-бороАг9-F. Свободную бороновую кислоту (соединение примера 20, 0,100 г. 0,179 ммоль) рас.творяют в 2 мл воды. К полученному раствору прибавляют 0,040 мл 48 -ой фтористоводородной кислоты при комнатной температуре. Почти сразу же образуется смолистообразный преципитат. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, затем замораживают и в вакууме удаляют избыток фтористоводородной кислоты и воду, Остаток растворяют в метаноле, концентрируют и порошкуют простым эфиром. Выход составляет 0,093 г требуемого продукта. Масс-спектроскопия (FAB) для С26HЗЗЙ6038 Fz: Вычислено Н: 527,29. Найдено: 527,31 и дополнительные значения масс, характерных для свободной бороновой кислоты. Элементный анализ С26Н34Й6038 FzCl Н20, : Вычислено: С 53.47. Н 6.25, И 14,47, В 1,86, F 6,54. Найдено: С 54.00, Н 6.40. N 13,48. В 1,95, F 7,06. Пример 22. Boc-.Ala-Phe(D,L)6oро1 ys-СаНи HCI. Soc-Ala Phe-NH СН((СН2)4МН2)802 — С6Н12" хбензолсульфокислота. 5 Продукт 8oc-Ala — Phe-NH— CH((CH2)48r)802-C6H1z превращают в алкилазид по методике, описанной в примере 3, за исключением того, что для очистки пол.ученного продукта не требуется хроматог10 рафии на колонке с LH-20. Полученный аэид гидрируют по методике примера 4 за исключением того, что берут 2 эквивалента бензолсульфокислоты, а гидрирование проводят в течение 2 ч, Получают конечный продукт при 15 40 выходе (т.пл. 154-160 С, разложение). Масс-спектроскопия (FAB) для С28Н46К4068: В ычислено: Н: 547,38. Найдено: 547,43, 20 Пример 23. Трифторацетат-бензолсул ьфонат Н-А!а-Phe-(О.L)6opoLys— С6Н12. Бензолсульфонат Boc — Ala — Phe-(0Я)боро1 уз-С6Н 1z подвергают взаимодействию с 25 трифторуксусной кислотой в течение 1 ч при комнатной температуре. После упаривания растворителя и порошкования осадка простым эфиром получают требуемый продукт в виде твердого вещества. 30 Масс-спектроскопия (FAB) для . С23Н39%048: х В ычислено +Н: 447,31, Найдено: 447,31, Элементный анализ для 35 C31H46N409SF38 2Н20, : Вычислено; С 49,34, Н 6,68, N 7,42, В 1.43. Найдено; С 49,26, Н 5,94, N 7,12, В 1,34. Пример 24. Бенэолсульфонат Вос— 40 (0)ЧаН ео-боро1 ys-C6H12. Boc-{D)Val-Leu-0H получают по методике, описанной в примере 2. Сложный бензиловый эфир получен с 76 выходом, Масс-спектро копия (FAB) для 45 C23H36N205: Вычислено Н: 421,27. Найдено: 421,38, После гидрирования получают свободную барную кислоту с 100 выходом в виде 50 кристаллического твердого вещества белого цвета, Элементный анализ для С16Н29М205, $: Вычислено: С 59.34. Н 8,87, N 8.50, Найдено: С 59,34. Н 8,87, N 8,50. 55 Вос-(0)Ча1-Leu-OH связывают с амином, полученным в примере 1,в. используемой для пептидного связывания Вос — Ala — Phe — ОН с выходом Boc — (D)Val— Leu-NH CH((CH2)48r)802 С6Н;2 с выходом 97%. 1807988 бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлористого натрия, Органический слой высушивают над безводным сульфатом натрия и после фильтрования и 5 упаривания получают кристаллический продукт. После выделения и промывания этилацетатом получают 3,26 г соединения, т,пл. 176-177 С. Элементный анализ для С17Н25МОЗВгВ, 10 %: Масс-спектроскопия (FAB) для. C27H53N4O8B: Вычислено Н: 541,41. Найдено: 541,46. 15 Элементный анализ для СЗЗН59М409ЯВ 1,5H20, %: Вычислено: С 54,62, Н 8,61, N 7,73, В 1,49. Найдено: С 54,58, Н 8,59, N 7,92, В 1,98. 20 Пример 25. Бензолсульфонат Ас-Phe— Боро1 уэ-С8Н12. Продукт примера 25 получают по методике, описанной s примере 22. Ас — Phe-NH-СН((СН2)4Вг)ВО2-С8Н12 получен с 72% выходом . Масс-спектроскопия (FAB) для C22H34 N204 B B r: Вычислено Н: 481,00. Найдено; 481,21. 30 Азид получен с 57% выходом, Конечный продукт получают при 50% его выходе. Масс-спектроскопия (FAB) для. C22H37N3O4B: Вычислено H: 418.29. Найдено: 418,31. Элементный анализ для С29Н4Л3073В Н20, %: 35 Вычислено: С 56,66, Н 7,47, N 7,08, В 40 1,82. Найдено: С 56,88, Н 7,47, N7,,22,,В1,53. Пример 26.  — (0.ЦЬого!г9 — С8Н12Х ХНВг, 45 Bz — (D,L)NH — CH((CH2)3Br)BO2-С5Н12 получают путем взаимодействия амина, полученного в примере 1,в (5 г, 15,9 ммоль), с эквивалентным количеством бикарбоната натрия в смеси, состоящей иэ 4 мл диоксана 50 и 4 мл воды при 0 С, После первоначального перемешивания реагентов реакционную смесь разбавляют 6 мл раствора иэ 50% диоксана с водой и нагревают до комнатной температуры. Реакционную смесь переме- 55 шивают в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим экстрагированием ее в этилацетате и промыванием водой, 0,2 í. HCl, 5 jo b1M водным раствором Масс-спектроскопия (FAB) для С27Н51М305В В г: Вычислено Н: 604,31. Найдено; 604,31. Полученный алкилбромид превращают в соответствующий азид при 85% выходе по методике, описанной в примере 3, с последующим его гидрированием, Конечный продукт получают в виде белого твердого вещества с 62% выходом, Вычислено: С 53,44, Н 6,59, N 3,67, В 2,83. Найдено: С 54,50, Н6,,76,,N 3,68, В 2,84, Полученный алкилгалогенид (1 г, 2,62 ммол ь) превращают в соответствующую соль изотиорония. Требуемый продукт 0,84 г,получен в виде твердого вещества белого цвета. Масс-спектроскопия (ГАВ) для C18H28N303S В: Вычислено Н: 378,20, Найдено: 378,21. Элементный анализ для C18H29N3O3SВВг, %: Вычислено: С 47,18, Н 6,38, N 9,17, В 2,36. Найдено: С 46,11, Н 6,71, N8,,97,,В 2,22. Пример 27. 6ензолсульфонат Вг(0, ) ба роАгц — С8Н12. Алкилгалогенид (полученный в примере 26, 2 г, 5,25 ммоль) превращают в азид (0,97 г, т.пл, 138 — 139 С) по методике, описанной s примере 3. Полученный аэид превращают бензолсульфонат Bz-бороОгп — С8Н12 по методике примера 4 при почти количественном выходе. Масс-спектроскопия (FAB) для C18H27N203B: Вычислено Н: 319,22. Найдено: 319,26. Бензолсульфонат Bz-бороОгп-С8Н12 (0,90 г, t,84 ммоль) подвергают взаимодействию с цианамидом по методике, описанной в примере 5, с выходом 0,65 г кристаллического продукта, т,пл. 242— 244 С. Масс-спектроскопия (FAB) для С18Н29Й403В: Вычислено Н: 361,24. Найдено: 361,24. Элементный анализ для C24H35N408SB, % Вычислено: С 55,59, Н 6,82, N 10,81, В 2,08, Найдено: С 54,60, Н 6,70, N11,,24,,В 1,87. 1807988 Пример 28. Бензолсульфонат Ас-Leu— Thr(0 В u) — бо poArg — С1о Н16. Ас — еи-Thr(OBu) — ОН получают путем связывания Ac-Leu ÎSu с Н-Thr(OBu) ОН по методике, описанной в примере 12, для дипептидного синтеза за исключением того, что конечный продукт получают в виде белого аморфного твердого вещества после хроматографии на колонке с LH-20, Ас-Leu Thr(OBu)-OH (3,29 г, 9,90 ммоль) подвергают сопряженному взаимодействию с амином (пример 1,а) по методике получения смешанного ангидрида. описанной в примере 2, за исключением того, что не нужно проводить хроматографию на колонке с LH-20. Ас — Leu Thr(OBu)— - NH — СН((СН2)3Вг)В02— С1оН16 получают в виде аморфного твердого вещества белого цвета с выходом 5,39 г. Полученный алкилгалогенид превращают в соответствующий азид с 82% выходом по методике примера 3 за исключением того, что для последующей очистки нет необходимости в проведении хроматографии. Полученный азид (3;88 г, 6.42 ммоль) гидрируют по методике. описанной в примере 4. Бензол сульфонат Ас — Leu- Thr — (0 B u) — бароОгпС1оН16 получают 74% выходом после хроматографии на колонке с LH-20 и порошкования простым эфиром, Масс-спектроскопия (FAB) для C36H55N406B: Вычислено Н: 579, 43, Найдено: 579,48. Бороорнитиновый пептид превращают в конечный продукт с выходом его 86% по - методике примера 5, Масс-спектроскопия (FAB) для С31Н57Й606В: Вычислено Н: 621,45, Найдено: 621,50. Элементный анализ для С37Н631ч6Я09В, %: Вычислено: С 57,05. Н 8,17. N 10,79, В 1,39. Найдено: С 56,47, Н 8,01, N 10,93, В 1,34. Пример 29. Бензолсульфонат Ас — Leu— Thr-6opoArg — С1оН16 Бензолсульфонат Ас-Leu Thr (OBu) бороАг9-С1оН16 (пример 28. 0.200 r, 0,257 ммоль) растворяют в смеси, состоящей из 2 мл хлористого метилена и 2 мл 4 н, HCI:äèоксан, затем полученную реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Растворитель упаривают в вакууме, а полученный осадок сушат в высоком вакууме. Требуемый продукт получают в виде белого твердого вещества с 97% выходом после порошкования простым эфиром. колонке с LH-20. После гидрирования по методике примера 4, хроматографии íà колонке с LH-20 и порошкования простым эфиром получают бензолсульфонат AcLys(Boc) — Pro-бороОгп — С1оН16 с выходом 81 о(Масс-спектроскопия (FAB) для C32H55N507B Вычислено Н: 634,43. Найдено: 634,46, Бороорнитиновый пептид (2,0 r, 2,53 ммоль) подвергают взаимодействию с цианамидом по методике примера 5 с выходом 1,8 г требуемого продукта в виде твердого вещества белого цвета. Масс-спектроскопия (FAB) для С33 H 57M 707 8: Вычислено Н; 676,46. Найдено: 676,41. Элементный анализ 35 для С39Н631ч7010В$, %: Вычислено: С 56,23, Н 7,64, N 11,77, В1,30. Найдено; С 56,06, Н 7,48, N 11,75, В 1,22. Пример 31..Ac Lys-Pro áoðîÀãgС1ОН16 2 Н CI Бензолсульфонат Ac — Lys(Boc) — Pro-боpoArg C1oH16 (пример 30, 0,30 г, 0,360 ммоль) подвергают взаимодействию со смесью, состоящей из ледяной уксусной 5р кислоты с 4 í, HCI и диоксана в соотношении 50:50 (%);. в течение 15 мин при комнатной температуре. Растворитель упаривают, а остаток сушат в вакууме, Полученный осадок растворяют в воде и пропускают через 5 мл колонку Hà AGI-Х8(С! — форма). Полученную пробу упаривают и после порошкования остатка простым эфиром получают требуемый продукт в виде твердого вещества белого цвета (230 мг), 55 Масс-спектроскопия (FAB) для С27Н49М606В: Вычислено Н: 565,39, Найдено: 565,48. Пример 30. Бензолсульфонат Ac— Lys(Boc)-Pro-6opoArg-С1оН 16. Дипептид Ас — Lyc(Boc) — Pro-OH получают по методике, описанной в примере 13. После кристаллизации из этилацетата пол10 учают указанный продукт в виде белого твердого вещества (т.пл. 160 — 161,5 С). Указан н ы и ди пептид Ас — Lys(Boc) — Pro — О Н (3,15 г. 8,18 ммоль) подвергают сопряженной реакции с амином (пример 1,а) по мето15 дике, описанной в примере 2, Полученный продукт (5,8 г) используют без дополнительной очистки. Полученное соединение пре. вращают в азид по методике примера 3 с выходом его 73% после хроматографии на 1807988 Масс-спектроскопия (FAB) для С28Н49Й70з В: Вычислено Н: 576,40. Найдено: 576,45. 5 Пример 32, Бензолсульфонат Ас-AlaG lu(O В u) — бо poArg — С 1о Н18. Ас — Ala Glu(OBu)-OH получают путем связывания Ас-А!а — OSv с Н вЂ” Glu(OBu) — OH по методике примера 13. Продукт выкри- 10 сталлиэовывают из смеси атил ацетат:гексан (т.пл. 147,5-148 С), Элементный анализ для С14Н24Й208, : Вычислено: С 53,14, Н 7,66, N 8,85. Найдено: С 53,28, Н 7,53, N 9,08. 15 Ас-Ala — G lu(OB u)-NK — СН((С Н2)з В г)В02— С10Н18 получают по методике примера 2 за исключением того, что вместо зтилацетата используют хлороформ для отделения органического слоя на начальной стадии реак- 20 ции и не проводят хроматографии на колонке с LH-20. После упаривания органического слоя получают 87 выхода требуемого и родукта в виде частично кристаллического твердого вещества. Ал- 25 килбромид превращают-в азид по методике, описанной в примере 3, Целевой продукт (т.пл. 165-166 С) получен с 50 выходом после кристаллизации неочищенного продукта из хлороформа, 30 Элементный анализ для C28H47N807B, þ Вычислено; С 53,51, Н 7,55, Й 6,69, В 1,73. Найдено: С 55,51, Н 7,50, N 6.50, B 1,66. 35 Бороорнитиновый пептид получают по методике примера 4 с 79 выходом требуемого продукта. Масс-спектроскопия (FAB) для C28H49N4O7B: 40 Вычислено +Н: 565,38. Найдено: 565.51. Конечный продукт получают в виде твердого аморфного вещества белого цвета с выходом 70 по методике примера 5. 45 Масс-спектроскопия для С2зН5 Й807В: Вычислено Н: 607.40. Найдено: 607.41. Элементный анализ для Сэ5Н57Й8018ВЯ, %: 50 Вычислено: С 54 96 Н 7.53. N 10,99, В 1,41. Найдено: С 54,36. Н 7,71, N 11.27. В 1.21. Пример 33. Бензолсульфонат Ас-AlaGlu-6opoArg — С 1оН1б. 55 .Бензолсульфонат Ас-Ala-Glu(Bu)-боpoArg-С1оН18 (пример 32. 0.10 г. 0.131 ммоль) растворяют в 10 мл уксусной кислоты. через полученный раствор в течение 20 мин пропускают хлороводород. Затем раствор перемешивают в течение 1.5 ч при комнатной температуре и после упаривэния растворителя получают масло. Требуемый продукт получают в виде твердого белого вещества (82 мг) после просушивания в вакууме и порошкования простым эфиром. Масс-спектроскопия (FAB) для С25Н43М607В: Вычислено Н; 551,34. Найдено: 551.41. Используя аналогичные методы, которые описаны в примерах 22 и 23, получены дополнительно соединения (см. табл. 16). Проведены биологические испытания соединений, полученных описываемым способом. Показано, что все эти соединения могут быть отнесены к категории малотоксичных веществ. Ингибиция калликреина плазмы человеческой крови Каллекреин плазмы человека получают из протогена АГ (AG), поставляемого из Швейцарии. Специфическая активность, как описывает поставщик, составляет 15 единиц на мг. 1 единица определена как количество фермента, необходимого для гидролиза 1 мкмоль субстрата, Н-(D)Pro Phe — Arg-паранитроанилина,(Kabi S2302), эа минуту при концентрации субстрата 0,50 мМ при 25 С в 50 мМ калий-фосфатном буфере. рН 8. Маточный раствор фермента 1 едlмл приготавливают в 50 -глицерин — 0,1 M натрийфосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 0,20 М хлористого натрия и 0,1 полизтиленгликоля 6000 (PEG), В стандартных испытаниях 10 мкл основного раствора кэлликреинэ прибавляют к 990 мкл раствора, содержащего 0,20 мМ Н-(D)Pro-PheArg-пара-нитроанилида SZ302 в 0,10 мМ натрийфосфатного буфера, рН 7,5, в состав которого входит 0,20 M хлорида натрия и 0,1 PEG, при 25 С. Действие ингибиторов оценивают при регистрации ферментативной активности, определяемой при измеренииповышения интенсивности поглощения при 405 нм по времени как в присутствии, так и в отсутствии ингибиторов. В табл. 1 приведены уровни ингибиторов и активность, замеренные в интервале 10-20 мин после стимуляции активности. Активность контрольных ингибиторов составляет 0,0092» 0,0095 мин, В табл. 1 показана биологическая активность ингибиторов калликреина плазмы крови человека. Из табл. 1 следует, что укаэанные ингибиторы имеют значения К < 0,7 мкм. Наиболее эффективным синтетическим 32 1807988 31 обратимодействующим ингибитором является 6-эмидино-2-(4-амидинофенил)-бензо/Р/тиофен, имеющий значение Kl = 0,7 мкм, Таким образом, приведенные в табл, 1 соединения являются более активными ингибиторами каллекреина, чем известное производное бензо/)3/тиофена. Кроме участия в коагуляции крови калликреин высвобождает брадикинин из белковых субстратов. Брадикинин повышает 10 васкулярную проницаемость, оказывает хемотактическое действие на лейкоциты и вызывает боль. Первые два вида активности связаны с воспалением. Поэтому предполагается, что ингибирование калликреина име- "5 ет противовоспалительный и обезболивающий эффект, Соединения по изобретению были испы-таны также в отношении ингибирования тромбина. Ингибиция тромбина (зстеразная активность). Тромбин человека (специфическая активность 2345 NIH ед/мг) получают из R, 0, P. Laboratories, South Bend, IN (Lot НТ 102), 25 Маточный раствор тромбина готовят в 0,01 М PIPES-буфере, рН 6, содержащем 0,75 М хлорида натрия. Анализ тромбина проводят в натрий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 0,20 M натрийхлорида и 0,1 PEG-.30 6000. Исходная концентрация субстрата составляет 0,10 мМ, а концентрация тромбина составляет 1,0 НМ в расчете на массу. 8 табл. 2 приведены уровни ингибиторов и активность, измеренная в интервале 35 10-20 мин после стимуляции реакции. Ак- тивность тромбина для контрольной группы составляет 0,0076-0,0005 мин Результаты приведены в табл. 2. Биологические данные, представленные 40 . в табл. 2, подтверждают превосходство сое-динений в соответствии с описываемым изобретением над известным соединением. N-альфа-(2-нафтил-сульфонил-глицил)-4-ам идинофенилаланинпиперидин. Хотя и дан- 45 ные в табл. 2 не выражены в виде значений Кь но все-таки возможно определить значения К1 на основе данных, представленных в табл. 2. Значение Kl определяется как концентрация ингибитора, требуемая для 50 50 ингибирования фермента в отсутствии субстрата. Присутствие субстрата, например тромбина, имеет защитный эффект на фермент. Из данных, представленных в табл. 2, следует, что все испытанные соединения 55 имеют значение К1 ниже 6 нМ. Для следующих соединений значения К) были определены методом Лайнуивера и Брука после установления равновесия фермента и ингибитора при рН 7,5. Kl (конечная конц.) %М п/и 1 г 4 6 8 0041 нМ 0004нМ <0,004 нм <0,004 нМ 0,84 нм 0,32 нм 1О нМ О,14 нМ 2,18 нМ Ас-(0)-Phe-Pro-boroArg-ОН Boc-(D)Phe-Рго-ЬогоАrg-С10Н t6 Н-(D)Phe-Pro-boroArg-С10Н 16 Boc-(D)Phe-Pro-ЬогоАгд-С10Н16 Boc-Lesly-1 еи--А1а-ЬогоАго-С10Н16 Ac-Lys-Pro-boroArg-С10Н16 Ас-А!е-Glu-boroArg-CtoH16 Н-(0)Че Leu-ЬогоАгц-С10Н16 Н-(D)val-$ег-boroAro-С10Н16 Эти соединения, включающие Ас-AIa— G! u-boroArg — С10Н16, которое обладает значением Kl (конечной концентрации) 10 нМ, т.е. значением, которое считается примерно равным Kt 6, превосходят сравнительное соединение еще по той причине, что их можно вводить без применения органического растворителя-солюбилизатора. В случае пептидов — производных бороновой кислоты, растворимость которых 150 мгlмл. органического растворителя-солюбилизэтора не требуется. Ингибиция свертываемости крови, проявляемая при определении APTT и РТ. Эффект ингибиторов протеазы на свертываемость крови)п vIito определяют путем измерения их действия по двум разным клиническим параметрам, времени частичного активированного тромбопластина (АРТТ) ивремени протромбина (PT). Реагенты для каждого из указанных анализов поставляет Оепега! Piagnostics, Jessup М0. Маточные растворы ингибиторов готовят в 25 мМ HEPES-буфере, рН 7,5, содержащем 0,10 М хлорида натрия. Для APTT-анализа, раствор ингибитора (0,100 мл) инкубируют обычной человеческой плазмой крови (0,100 мл) и спонтанным реагентом APTT (0,100 мл). После инкубирования в течение 5 мин при 37 С к указанному раствору прибавляют хлорид кальция (0,100 Mn) и время свертываемости, измеренное в секундах, определяют на фиброскопе. B табл. 3 приведены данные влияния различных концентраций ингибитора на время свертываемости крови по сравнению с временем свертывания крови контрольных групп, установленным при отсутствии ингибитора, Для PT-анализа растворы ингибитора (0,100 мл) инкубируют обычно плазмой крови человека (0,100 мл) в течение 2 мин при 37 С. Затем к инкубированному раствору прибавляют симпластиновый реагент (0,200 мл) и определяют время свертываемости крови, приведенные в табл. 4. 33 1807988 10 Стабильность ингибиторов в человеческой плазме, определенная при APTT. Стабильность ингибиторов в плазме оценивают по их способности ингибировать свертываемость крови. В первую очередь, основные растворы (1 мкМ) ингибиторов, подлежащих испытанию, которые приготовлены в 25 мл НЕРЕ$-буфера. рН 7,5, содержащем 0,10 М хлорида натрия, разбавляют Ао 50 обычной плазмой крови человека. Смеси готовят при 0 С, затем аликвоты (0,200 мл) отбирают и инкубируют в течение В табл, 5 приведены суммарные данные результатов. представленных в табл. 3 и 4, показывающие расчетные концентрации ингибитора, необходимого для увеличения времени частично активированного тром- 5 боплатина (2xAPTT) и времени протромбина (2хРТ) в два раза, Соединение, Название ингибитора обозначенное в табл. 3 — 5, 7-10 А . Вос-(D)Phe-Pro-boroArg-С1оН16 В Н-(D)Phe-Pro-boroArg-СюН16 С Вос-(D)Phe-Phe boroArg-С1оН16 D . Ас-Phe-boroArg-С1оН16 15 Ингибиция свертываемости крови, установленная при определении (ТТ) (времени тромбина). Действие ингибитора протеазы Ас-(D)Phe-Pro-6opoArg — 0H на свертывание кро- 20 ви 1п virto определяют путем измерения его влияния на тромбиновое время (ТТ). Смесь, состоящую из 0,2 мл обычной кроличьей плазмы и 0,05 мл буфера, содержащего ингибитор в 6-кратном количестве требуемой 25 конечной концентрации, нагревают до 37 С. Свертываемость крови стимулируют путем введения тромбина (0,05 мл в 6-кратном количестве конечной концентрации), Используемый тромбин закупают от Sigma 30 Chemical Совр. (NT-6634, активность 1190 NfH ед/на мг белка) и готовят в буфере. Используемый как для ингибитора, так и тромбйна буфер представляет собой 0,1 М трис-буфер (12,10 г/л), содержащий 0,154 M 35 NaCt (8,84 г/л) и 2,5 мг/мл сывороточного бычьего альбумина. рН 7,4. Тромбиновое время, измеряемое в секундах, определяют на фиброскопе. В табл, 6 представлены данные влияния ингибитора на время свертыва- 40 ния крови по сравнению с временем свертываемости контрольной группы без испбльзования ингибиторов, Показатели эффекта представляют усредненное значение как минимум трех замеров. Если реакция 45 свертываемости не происходит в течение 300 с, то ее прекращают. 2 мин при 37"С, Прибавляют одинаковый объем спонтанно-приготовленного реагента APTT и замеряют время свертывания крови, как описано в примерах на с. 49. Конечная концентрация ингибитора в течение анализа свертывания крови составляет 250 нМ, Инкубационное время, приведенное в часах, и время свертывания, замеряемое в секундах, для каждого ингибитора приведены в табл. 7. Показатели стабильности для соединений Е и F определены одновременно с контрольной группой, Показатели для соединений А, В получены на другой день. Стабильность ингибиторов в буферном растворе, Ингибиторы, каждый при концентрации 1 мкМ, инкубируют при комнатной температуре в 0,20 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 0,20 М хлорида натрия и 0,10 PEG. Затем отбирают, аликвоты (4 мкл) и анализируют на тромбиновую пробу, В табл. 8 приведены данные тромбиновой активности, (в ), сохраняющейся после инкубации, и продолжительность нахождения в натрий-фосфатном буфере испытуемых ингибиторов. В случае использования ингибитора А имеется незначительная потеря ингибиторной активности. Ингибитор В теряет свою биологическую активность в течение часа. Ингибирование свертывания крови после перорального приема ингибиторов ih vivo. Самки. крыс (Sprague Dawiey CDRats, весом 130 — 140 r, предоставленные Charles River Labs, lhs, Wilmingtoh МА) анестезируют пентобарбиталом натрия (50 мг/кг, внутрибрюшинно). На вентральной поверхности шеи выполняют срединный надрез и в одну иэ каротидных артерий вводят полиэтиленовый катетер с выведением его у тыльной части шеи. После выведения крысы из состояния наркоза контрольные пробы крови берут из введенного в каротидную артерию катетера, производят антикоагуляцию цитратом натрия и центрифугируют (2000 х об/м, 10 мин.). Плазму переносят в пластиковые пробирки и выдерживают на льду до их анализа. Тромбиновое время определяют в фиброскопе. Крысы получают протеаэный ингибитор Ас — (D)Phe — Pro-6opoArg-0Н в носителе либо только носитель через желудочный зонд в обьеме менее 4 мл, В качестве носителя используют 5 диметилсульфоксид в физиологическом растворе. Пробы крови берут в разное время после орального приема, которые анализируют как описано выше, В табл. 9 приведены полученные данные времени 36 1807988 35 свертывания крови в секундах, В случае, когда время свертывания крови превышает 300 с. в таблице . указано как > 300. Ос тальные данные показывают среднее время, необходимое для коагуляции, 5, измеренное в секундах, + означает стандартное отклонение от нормы. Ингибиция in vivo коагулирования крови после перорального приема ингибитора. 10 Для дополнительной демонстрации способности данного соединения ингибировать свертываемость крови in vivo. крыс анестезируют пентобарбиталом натрия (50 15 мг/кг, внутрибрюшинно); после чего в яремную вену вставляют катетер и отверстие закрывают. После выведения крыс иэ наркоза перорально вводят либо 5 мг/кг-ингибитора протеаэы, Ac — (D)Phe — Pro 6opoArg-0Н, 20 растворенный в воде, либо равный объем воды. Через 30 — 60 мин всем крысам вливают 500 ед/кгтромбина втечение 1 мин. Все 14 крыс, получающие только воду, погибли в течение 10 мин после вливания тромбина. 25 : В противоположность этому только 8 из 17 . крыс, получившие ингибиторсодержащую воду, погибли в течение 10 мин, а оставши-, еся жили 1 ч и в это время»х усыпили. Ингибиция in vivo свертываемости кро- 30 ви после перорэльного местного и ректального приема. Общая методика: самцы крыс Lewis весом 300-350 r анестезируют пентобарбитолом натрия (50 мг/кг, внутрибрюшинно) и в 35 яремную вену вставляют силастиковую канюлю, прикрепленную к полиэтиленовой .трубке 50. Указанную трубку выводят наружу у тыльной части шеи и прикрепляют к шприцу через стопорный вентиль, Пробы 40 крови (0,5 мл) набирают в шприц, который промыт цитратным буфером до каждого забора крови перед и через разные промежутки времени после приема ингибитора протеазы Ас (D)Phe — Pro-бороАгц-ОН, За- 45 тем пробы крови переносят в герметичные емкости, содержащие цитратный буфер, Кроме того, после каждого забора крови канюлю промывают физиологическим раствором. Затем пробы крови центрифугируют 50 (2500 об/мин в течение 15 мин) и для измерения времени коагуляции используют 0,2 мл проб плазмы. Измерения времени свертываемости крови проводят на фиброскопе, как описано ниже, Прежде всего, 55 плазму(0,2 мл) помещают, в фибростэкан и прибавляют трис-буфер (50 мкл), рН 7,4. Буферный раствор, содержащий плазму, инкубируют при 37 С в течение 1 мин, затем добавляют 50 мкл 24 мк/мл тромбинового раствора в трис-буфере и замеряют время коагуляции в секундах. Если время коагулирования превышает 300 с, далее указывают, как > 300, Пероральное введение: крыс с введенным в яремную вену катетером выводят из состояния наркоза до перорального приема ингибитора. Водный раствор ингибитора протеазы Ас-(0)Phe-Pro-6opoArg-OH. содержащий 3 мг ингибитора на кг массы крысы (примерно, 1 мг на крысу), в 0,75 мл воды нэ кг массы крысы вводят через зонд, В табл. 10 приведены полученные данные. Местное применение: в брюшной полости крыс с введением в яремную вену катетером выполняют 3-х см разрез, пока они все еще находятся в наркотизированном состоянии, Находят толстую кишку и разъединяют ее восходящую и нисходящую часть. Водный раствор ингибитора протеаэы Ас— (0)РФе — Pro — 6opoArg — OH, содержащий 3 мг ингибитора на кг массы крысы (примерно, 1 мг на крысу) в 1 мл воды на кг массы крысы, инъецируют в восходящую часть полости толстой кишки. Разрез закрывают, используя скобки для наложения шва. В табл, 11 приведены полученные данные, Ректэльное применение: в качестве методики для ректального введения ингибитора крысам с вставленным в яремную вену катетером используют методику КатЦа. Вкратце говоря, изготавливают приспособление. состоящее из 0,89 см и 0,71 см силиконовых прокладок, соединенных в длину на 2 см проволочкой. Указанное приспособление вставляют в ректальное отверстие крысы, причем сначала прокладку большего размера и затем приклеивают к анальному проходу соответствующим клеем, Введение ингибитора осуществляют путем инекцирования через расположенную снаружи прокладку. Доза для ректального приема составляет 3 мг ингибитора протеазы Ac(D)Phe-Pro — 6opoArg — 0H на кг массы крысы (примерно, 1 мг на крысу),в 0,6 мл воды на кг веса крысы. В табл, 12 приведены полученные данные. Ингибиция in vivo воспалительного процесса, вызванного кротоновым маслом. Получают два раствора: в первом содержится в 5 -е кротоновое масло, известное как агент, вызывающий воспаление, в ацетоновом носителе (кротоновый раствор), а второй раствор содержит 5ф,-е кротоновое масло в ацетоновом носителе, к которому добавлено 10 мг/мл предлагаемого соединения (испытуемый раствор). Кротоновый раствор (10 мкл) или в альтернативном варианте испытуемый раствор наносят на пра37 1807988 38 вое ухо каждого животного (крысы Sprague ОаМеу CD, aecoM 130-140 г, представленные Charles River Labs, Inc, Wllmington, МА). Ацетоновый носитель в чистом виде (ацетоновый раствор, 10 мкл) наносят на левое ухо каждого животного, Через час после обработки животных усыпляют, их уши отрезают, штампуют на диски размеров 1/4 дюйма в диаметре и взвешивают, Разбухание измеряют как разницу в весе между кротоновым раствором, которым обработано правое ухо и ацетоновым раствором — левое ухо. Полученные данные сравнивают с индометацином, который известен в качестве нестероидного противовоспалительного средства, приготовленного и наносимого аналогичным образом как и испытуемое соединение, В табл. 13 приведены усредненные значения для соединения F, Ас — Phe-бороАг9-Сюн16, Используемый . термин "доза" означает количество активного противовоспалительного ингредиента в мкг (соединения А, С, D, Е, F или G, или индометацина) в растворе, нанесенном на правое ухо, à и означает количество крыс, которое используют в каждом тесте. "SE" означает стандартную погрешность, В табл. 14 показана антивоспалительная активность соединений А, С. которые взяты при одних и тех же.условиях (доза = =199 мкг). Ингибирование плазмина боролизиновыми пептидами, Плаэмин плазмы человека получают от фирмы Атег)сап Diagnostics, Greenwich, Ст, концентрация активных центров в препарате, определяют методом, аналогичным методу; описанному Coleman и др. Анализ ферментов осуществляют на спектрофотометре Perkln-Е!лег Lambda 4С с использованием вычислительной машины типа Регйп-Elmer 7300. S качестве буфера ис пользуют 50 ммолей трис-буфера, рН 7,4, содержащего 110 ммоль хлорида натрия, 0;17. ПЗГ 6000 и 0,30 ммоль Н-(D)Val-LeuLyi-пара-нитроанилида, К этой смеси при. бавляют соответствующие количества ингибитора и затем плазмина. При 25 С измеряют повышение интенсивности поглощения при 405 нм по времени, Поскольку ингибиторы связываются медленно. скорость реакции определяется по касательной, проводимой к кривой реакции, по истечении l0 мин от начала реакции, В каждом случае осуществляют контрольное испытание без применения ингибитора. Во всех случаях концентрация плазмина составляет менее 10 концентрации ингибиторэ. Результаты приведены в табл. 15. Проведенные испытания показали, что соединения по изобретению малотоксичны, обладают высокой ингибирующей активностью с широким спектром действия, кроме того, все зти соединения могут быть введены в организм без применения растворителя-сол юбилизатора. Формула изобретения Способ получения производных борсодержащих пептидов общей формулы R1 — Z — NH — СН вЂ” BY HW п2 R< — H, Ас, Bz, Вос, Вос — Leu; R2 — (CH)2nNHC(NH)NH2, n = 3,4; Y — остаток пинаконового или пинандиолового эфира; HW — CsHsSOsH, НCI, HВr Z= 0Л..— Phe, DPhe Pro, DPhe-Phe, AlaLys, Pro Phe, Ala-Phe, Glu-Phe, Ala-GIu, Glu — Gly, Gly-Leu — Ala, пиро — Glu-Phe; ValVal, (D)Vai еи, Lys — Pro, Leu Thr о тл и ч а ю шийся тем, что амин формулы H2N — СН BY ÍW (С Н2) п 1 где и = 3, 4, ЧЧ и У/1 = CI, Br; Y — остаток пинаконового или пинандиолового эфира, вводят во взаимодействие с аминокислотой или пептидом формулы R1-Z — ОН где значения Rg и Е указаны выше, и полученный продукт формулы . R<-Z— - NHCH — BV ÍW (СН2)ЛЩ1 где значения R<, Z, Y, W, W>, n указаны 40 выше . обрабатывают азидом щелочного металла с образованием соединения формулы Ri — Z— - ИН вЂ” СН-BV ÍW 45 . (CH2)пауз где значения R1, Z, Y, n и И/указаны выше, которое затем восстанавливают в присутствии органической или минеральной кислоты, предпочтительно бенэолсульфокислоты, с образованием соединения R1 — Z — NH — CH — BY HW (CH2)nNH2 55 где значения R>, Z, Y, W, n указаны выше, и последнее подвергают взаимодействию с циэнэмидом в низшем спирте при температуре 50 — 150 С. 1807988 Таблица 1 ЩФ и/и ф> активности Конц-ия. нм Ингибитор Пример 1000 Таблица 2 thigh и/n . Ингйбитор 7, активности Кон ц- ия, нм Пример 5 5:. 100 1000 10000 10000 10000 2 3 4 6 В 10 . 11 2 6 8 11 .12 -13 ,. 14 7 11 12 14, 16 18 .19 21 5 8 8. 11 16 16 18а 14 18 21 19 14 .9 22 Ингибирование калликреина плазмы человека Boc(D)Phe-Pro-boroArg-СюНв 2НО Àc-(D)-Phe-Pro-boroArg-СюН ю НО Boc(D)Phe-Phe-boro-Arg-С1оН1в BSA Ас-Ala-Lys(Boc)-ЬогоАщ СюНв BSA Ас Ala-Lys-boroArg-С1оНы 2НО Boc-Leu-Gly-Leu-AIa-boroArg-СюН 1в BSA Bz-GLu-Gly-ЬогоАгц;СюН1в 8SA Bz-Pro-Phe-boroArg-СюН1в В$А Bz-Pro-Phe-boroArg-OH НСI Bz-Pro-Phe-boroArg-FBoc-Ala-Ph 0Л Ього1 s CsH>z HCI Ингибирование тромбина Ас-(D)-Phe-Pro-boroArg-СюН1в HCI Boc(D)Phe-Рго-boroArg-СюН1в BSA Ас-(0)-Phe-Pro-boroArg ОН HCI H(D)Phe-Phe-boroArg-СюНв 2НС! Boc(6)Phe-Phe-ЬогоАгд-СюНв BSA Н-Leu-Gly-Leu Ala-ЬогоАгд-СюН1в HCI BSA Boc-Leu-Gly-Leu-Аlа-boroArg-СюН в BSA Bz-GLu(0Bu)-Giy-boroArg-С10Н1в BSA Ас-Аlа-Lys(Boc)-boroArg-СюН fs BSA Bz-GLu-Gly-boroArg-СюН1в BSA Bz-Pro-,Phe-boroArg -0H HCI Bz-Pro-Phe-boroArg-F Boc(D)Vaf-Leu-boroLys СвН 1z НО Bz-Рго-Phe-boroArg С10Н1в В$А Вос-Leu-Gly-Leu-Ala-boro0rn СюН1в. BSA Ас-Аl а-Lys-ЬогоАгд-СюН и 2 H Cl Ас-Phe-Pro-boroArg-С1оН 1в НО Вос-Ala-Phe(D,L)boroLys Свйи НС1 Н Аlа-Phe(D,L)Üîro(уз СвН12 2HCI Ас-Phe-boroL s-СвН1 НС! 61 56 5,2 34 39 39 16 18 .17 3 32 38 52 18 46 18 18 21 24 24 53 46 89, 97 42 1807988 41 Таблица 3 Время активированного частичного тромбопластина, измеренное в секундах Таблица 4 Протромбиновое время, измеренное в сек. Таблица 5 Ингибирование свертывания крови 44 1807988 43 Таблица 6 Тромбиновое время * В качестве ингибиторэ испытан Ac(D)Phe-Pro-boroArg-OH. +* Среднее время, необходимое для свертывания, измеренное в секундах. стандартное отклонение. Таблица 7 Устойчивость ингибиторов в плазме человека Таблица 8 Устойчивость ингибиторов в буфере 1807988 45 Таблица 10 Ингибирование!и vivo свертывания крови вслед за пероральным введением (ингибитор Ас-(0)Phe-Pro-boroArg-ОН) . Данные представляют собой среднее для 2 крыс. ++ Данные представляют собой среднее для 3 крыс. -.Та бл и ца 11 Ингибирование In ч!чо свертывания крови после введения через ободочную кишку (ингибитор Ас-(0)Phe-Pro-boroAг9-ОН) * Данные представляют собои среднее для 2 крыс, ** Данные представляют собой среднее для 3 крыс. Таблица 9 Ингибирование свертывания крови вслед за пероральным доэированием 1п vivo 1807988 Таблица 12 *+ Средние данные для 3 крыс. Та бли ца 13 Ингибирование воспалительного процесса, вызванного кротоновым маслом Таблица 14 Ийгибирование воспаления, вызванного кротоновым маслом Т.аблица 15 Ингибирование плазмина Ингибирование14 vlvo свертывания крови после ректального введения (ингибитор Ас 0)РЬе-Pro-boroArg-OH) 50 1807988 Продолжение табл.15 Таблица 16.Соединение Пример синтеза М анные масс. спект а Найдено Рассчитано Вос-Val-Val-boroLys-С6Н 12 BSA Н-Val-Val-boroLys-С6Н 12 BSAX кТЕА Вос-.(D)Phe-Phe-boboLys-С6Н ц х.х BSA Н (D)Phe-Phe-boroLys-C6H >2 х х В$А TFA Вос-6! о-Phe-boroLys-С6Н 12 BSA PyroGlu-Phe-boroLys-C6Hn BSA Н-(Р)Ча Leu-boroLys- С6Н12х хВЯА TFA 527,53 427,34 С26Н52Й406В С21Н44М404В 34 527,4 426,34 623,52 523,34 С34Н52Й406В C2g H44N404B 623,4 522.34 604,45 . 487,39 440,36 38 СЗОН49Й408В C25H4ON405B C22H43N4B 604,37 487,3 440,35 BSA — Бензолсульфоновая кислота TFA — Трифторуксусная кислота Составитель В. Волкова Техред M.Ìoðråíòàë Корректор И. Муска Редактор Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 1393 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
