Полимерный гемоглобин, обладающий способностью сохранять газотранспортную функцию гемоглобина, и способ его получения

 

Изобретение относится к области химической модификации биополимеров и может быть использовано для создания кровезаменителя - переносчика кислорода. Заявлен полимерный гемоглобин формулы

где Гб - гемоглобин, а Га - глутаровый альдегид, с молекулярным весом 6,5·10⁴-1·10⁶ , обладающий способностью сохранять газотранспортную функцию гемоглобина. Способ его получения заключается в конденсации нативного гемоглобина в дезоксиконформации с би-функциональными реагентами, например, с глутаровым альдегидом, в буферных растворах, при нейтральных значениях рН и 4-6°С. Полимерный гемоглобин сохраняет нативную конформацию гем-гемового взаимодействия, что выражается в полном сохранении газотранспортной функции молекул гемоглобина. 2 н.п.ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к новым физиологическиактивным соединениям, точнее к полимерным гемоглобинам формулы:

где Гб - гемоглобин, Га - глутаровый альдегид с молекулярным весом 6,5·10⁴÷1·10 ⁶. Изобретение может найти применение в биохимии и медицине в качестве водорастворимой модели переносчика кислорода с сохранением газотранспортной функции (кооперативного взаимодействия между субъединицами) молекул гемоглобина. Ранее получение полимерного гемоглобина с полным сохранением кооперативности не описано.

Известно, что нативный физиологически активный гемоглобин существует в окси- и дезокси-конформациях, обратимый переход между которыми характеризуется кооперативным процессом: в молекуле гемоглобина, состоящей из 4-х субъединиц, существует гем-гемовое взаимодействие, выражающееся в том, что присоединение первой молекулы кислорода к дезоксиформе облегчает присоединение остальных 3-х молекул (кооперативность связывания) E.Antonini, M.Brunori "Hemoglobin and myoglobin in their reaktions with ligands" North Hollahd Publ. Comp.Amsterdam-London, 1971, гл.7, с.153, 367.

В обоих конформациях атом железа в геме двухвалентен. Однако обе конформации нестабильны и при отклонении условий от физиологических атом железа необратимо окисляется до 3-х валентного, давая мет-форму гемоглобина, которая полностью утрачивает кислород-транспортную функцию. (E.Antonini, M.Brunori, (1971 г.) там же, гл.3, с.40).

Дезоксиконформация гемоглобина отличается от оксиконформации тем, что α - концевые аминогруппы блокированы солевыми связями (M.Perutz, Nature, 228, 726, 1970; LaRecherche 14 (2) 677, 1971).

Известны так же другие лигандные формы, например: СО-форма гемоглобина, которая по конформации аналогична окси-форме (E.Antonini, M.Brunori, 1971 г, та же книга "Hemoglobin and myoglobin..." гл.10, с.260).

Известны способы поликонденсации гемоглобина в СО-форме (R.H.Macleod, R.J.Hill, 1970, J.Biol. Chem. 245, №19, 4875) путем взаимодействия с р,р'-дифтор-m,m'-динитродифенилсудьфон-атом. При этом происходит утрата кооперативности, что выражается в полной потере гем-гемового взаимодействия и потере нативной кислород-переносящей функции (константа Хилла П=0,82 вместо 2,5-3,0 для нативного гемоглобина). К потере гем-гемового взаимодействия приводит реакция оксигемоглобина с бифункциональными азокрасителями (H.Fasold, Meyer C., G.Steinkopff (1971), Eur. J.Biochem. 32, №1, 63), константа Хилла в этом случае n=0,7-1,2.

Известен также способ поликонденсации гемоглобина с глутаровым альдегидом (J.W.Payne, 1973, Biochem.J. 135, №4, 867) в фосфатном буфере при нейтральном рН среды при 20°C, в течение 30 мин при перемешивании с последующей инкубацией 48 ч, при 20°C. Целью указанной работы было получение водорастворимых маркеров для электрофореза. При этом использовали дважды перекристаллизованный бычий гемоглобин. Известно, что такой коммерческий продукт содержит 70-80% мет-формы (каталог Serva (1972), Fine biochemical, №24510).

Полученный полимерный мет-гемоглобин не обладал физиологической активностью и не мог переносить кислород.

Целью настоящего изобретения являлось получение полимерного гемоглобина с сохранением нативной конформации и гем-гемового взаимодействия, что выражается в полном сохранении газотранспортной функции нативного белка.

Поставленная цель достигалась тем, что поликонденсацию нативного гемоглобина проводили при 4-6°C в дезоксиконформации, где физиологически важные для газотранспортной функции группы связаны солевыми мостиками. Конкретный пример выполнения изобретения приводится ниже.

К 3 мл 5% раствора гемоглобина в дезоксиформе, предварительно отдиализованного против 0,1М фосфатного буфера рН=7,4, добавляли раствор глутарового альдегида до конечной концентрации 0,2%. Реакцию проводили при 4-6°С с перемешиванием. Избыточные реагенты удаляли диализом против фосфатного буфера. Исследовали молекулярно-массовое распределение полученного полимерного гемоглобина (фиг.1) гель-хроматографией на Sepharose 4B.

Гель-хроматографией полученных образцов полимерного гемоглобина показано широкое молекулярно-весовое распределение от 65000 (10-15%) до 1000000 (30-40%).

Характеристические параметры газотранспортной функции полимерного гемоглобина, полученные из кривой кислородной диссоциации (фиг.2) практически совпадают с таковыми исходного гемоглобина: сохраняется сигмоидность кривой, сродство к кислороду полимерного гемоглобина (рО₂)₅₀≈11 мм Hg, константа Хилла n=2,1; для гемоглобина (pO ₂)₅₀≈10 мм Hg, n≈2,5-3,0.

Сохранение нативной конформации гемоглобина после конденсации подтверждено также отсутствием изменений в спектрах окси- и дезокси-форм полимерного гемоглобина по сравнению со спектрами нативного белка (фиг.3).

Формула изобретения

1. Полимерный гемоглобин формулы

,

где

Гб - гемоглобин, а Га - глутаровый альдегид, с молекулярным весом 6,5·10⁴-1·10 ⁶, обладающий способностью сохранять газотранспортную функцию гемоглобина.

2. Способ получения полимерного гемоглобина по п.1, путем конденсации гемоглобина с би-функциональными реагентами, например, глутаровым альдегидом, в буферных растворах, при нейтральных значениях рН, отличающийся тем, что, с целью сохранения гем-гемового взаимодействия и газотранспортной функции нативного белка, проводят поликонденсацию нативного гемоглобина в дезоксиконформации при 4-6°С.

РИСУНКИ