Средство для консервации донорской роговицы



Средство для консервации донорской роговицы
Средство для консервации донорской роговицы
Средство для консервации донорской роговицы
Средство для консервации донорской роговицы
Средство для консервации донорской роговицы
Средство для консервации донорской роговицы
Средство для консервации донорской роговицы
Средство для консервации донорской роговицы
Средство для консервации донорской роговицы

 

A01N1/02 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2450515:

Федеральное государственное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии. Средство содержит среду М-199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат, декстран-40, гентамицин-сульфат, амфотеррицин В, среду Дюльбекко-Игла, препарат NeyDIL №37 St.III при следующем соотношении компонентов, мас.%: среда М-199 25,0; среда Хэма F-10 25,0; хондроитин-сульфат А 0,5; декстран-40 5,0; гентамицин-сульфат 0,00014; амфотерицин В 0,00015; NeyDIL №37 St.III 0,00015; Среда Дюльбекко-Игла остальное. Изобретение позволяет повысить биохимическую устойчивость эндотелия к срокам и факторам консервации, сохранить высокую плотность эндотелиальных клеток и ускорить адаптацию трансплантата. 9 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для длительного сохранения, продления жизнеспособности трансплантата роговицы и улучшения его трансплантационных качеств для сквозной кератопластики.

Известна среда для консервации роговицы глаза (патент РФ №2069951), содержащая среду 199 и декстран, дополнительно содержащая среду F-10, среду Дюльбекко-Игла, хондроитин-сульфат, гентамицина сульфат, амфотерицин Б при следующем соотношении компонентов, мас.%: среда М-199 25, среда F-10 25, хондроитин-сульфат 2,7, декстран-40 2,0, гентамицин-сульфат 0,00014, амфотерицин Б 0,00015, среда Дюльбекко-Игла - остальное.

Недостатком этой среды является то, что при низкотемпературной консервации клетки эндотелия роговицы испытывают холодовой стресс с инициацией перекисного окисления и нарушением липо-протеидного слоя клеточных мембран, что приводит к их последующей деструкции и повреждению эндотелиальных клеток трансплантата донорской роговицы на ультраструктурном уровне. Это приводит к потере жизнеспособности донорского материала, к уменьшению плотности эндотелиальных клеток роговицы и соответственно к повышению полиморфизма и полимегетизма клеток и снижению процента гексагональных клеток. Такой донорский материал не пригоден для сквозных кератопластик при наиболее тяжелых бельмах ожоговой этиологии, которые сопровождаются большой потерей эндотелиальных клеток в посттрансплантационном периоде.

Задачей изобретения является создание многокомпонентного средства для длительного сохранения донорской роговицы в режиме глубокой гипотермии (при температуре 4…8°С), длительно сохраняющего жизнеспособность и цитоархитектонику эндотелия (до 9 суток), способного оказывать протективное действие на липопротеидные компоненты мембран, уменьшающего потерю эндотелиальных клеток (менее чем на 5%).

Техническим результатом является улучшение трансплантационных качеств трансплантата роговицы, а именно повышенная биохимическая устойчивость эндотелия к срокам и факторам консервации, сохранение высокой плотности эндотелиальных клеток и быстрая адаптация донорского трансплантата после кератопластики.

Технический результат достигается тем, что данное средство для консервации донорской роговицы, в режиме гипотермической консерваии, содержащее среду М-199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат, декстран-40, гентамицин-сульфат, амфотеррицин В и среду Дюльбекко-Игла, дополнительно содержит препарат NeyDIL №37 St.III (Р/У ЛРС-008827/08-061108), содержащий регуляторные пептиды, полученные из цитоплазмы клеток роговиц фетальных и ювенильных животных по оригинальной технологии.

Средство имеет следующее соотношение компонентов, мас.%:

Среда М-199 25,0
Среда Хэма F-10 25,0
Хондроитин-сульфат А 0,5
Декстран-40 5,0
Гентамицин-сульфат 0,00014
Амфотерицин В 0,00015
NeyDIL №37 St.III 0,00015
Среда Дюльбекко-Игла остальное

При этом среда М-199 имеет следующий состав, мг/л: Л-аланин 25; Л-аргинина хлорид 70; аспарагиновая кислота 30; Л-цистеина хлорид - 0,0987; Л-цистина двунатриевая соль; Л глютаминовая кислота 66,82; Л-глютамин 100; глютатион 0,05; глицин 50; Л гистидина хлорид одноводный 21,88; Л гидрооксипролин 10; Л-изолейцин 20; Л-лейцин 60; Л лизина хлорид 70; Л-метионин 15; Л-фенилаланин 25; Л-пролин 40; Л-серин 25; Л-треонин 30; Л-триптофан 10; Л-тирозина двунатриевая соль - 49,72; Л-валин 25; Л-аскорбиновая кислота 0,05; биотин 0,01; кальциферол 0,1; Д-кальция пантотенат 0,01; холина хлорид 0,5; фолиевая кислота - 0,01; и-инозитол 0,05; менафтона натрия бисульфат трехводный 0,019; никотиновая кислота 0,025; никотинамид 0,025; пара-амино-бензойная кислота 0,05; пиридоксальхлорид 0,025; пиридоксинхлорид 0,025; рибофлавин 0,01; тиамина хлорид 0,01; Д-Л-токоферола фосфата двунатриевая соль 0,01; витамина А-ацетат 0,1147; кальция хлорид двухводный 185,5; железа нитрат девятиводный 0,01; калия хлорид 400; калия дегидроортофосфат 60; магния сульфат семиводный 200; натрия хлорид 8000; натрия гидроортофосфат 47,5; аденина сульфат 10; 5-АМФ 0,2; АТФ двунатриевая соль 10; холестерол 0,2; 2-дезоксирибоза 0,5; Д-глюкоза 1000; гуанина хлорид - 0,3; гипоксантин 0,3; Д-рибоза 0,5; натрия ацетата 36,71; натриевая соль фенола красного 17; тимин 0,3; твин 80-5; урацил 0,3; ксантин 0,3.

Среда Хэма F-10 имеет следующий состав, мг/л: Л-аланин 8,91; Л-аргинина хлорид 210,7; Л-аспарагин 1-водный - 15,01; Л-аспарагиновая кислота 13,31; Л-цистеина хлорид 31,53; Л-глютаминовая кислота 14,71; Л-глютамин 146,2; глицин 7,51; Л-гистидина хлорид одноводный 20,96; Л-изолейцин 2,62; Л-лейцин 13,12; Л-лизин 29,3; Л-метионин 4,48; Л-фенилаланин 4,96; Л-пролин 11,51; Л-серии 10,5; Л-треонин 3,57; Л-триптофан 0,61; Л-тирозина натриевая соль 2,25; Л-валин 3,51; биотин 0,024; Д кальция пантотенат 0,715; хлорид холина 0,698; фолиевая кислота 1,32; и-инозитол 0,541; никотинамид 0,611; пиридоксин-хлорид 0,206; рибофлавин 0,376; тиамина хлорид 1,012; витамин В12 1,36; кальция хлорид двухводный 44,1; сульфат меди пятиводный 0,0025; сульфат железа семиводный 0,8346; хлорид калия - 285; калия дегидрофосфат 83; магния сульфат семиводный 152,7; натрия хлорид 7400; натрия гидроортофосфат 156,2; цинка сульфат семиводный 0,0288; Д-глюкоза 1100; гипоксантин 4,08; липоевая кислота 0,206; натриевая соль фенола красного 12; натрия пируват 110; тимидин 0,727.

Среда Дюльбекко-Игла имеет следующий состав, мг/л: Л-аргинин 84; Л-цистина двунатриевая соль 56,78; Л-глютамин 584; глицин 30; Л-гистидина хлорид одноводный 42; Л-изолейцин 104,8; Л-лейцин 104,8; Л-лизина хлорид 146,2; Л-метионин 30; Л-фенилаланин - 66; Л-серии 42; Л-треонин 95,2; Л-триптофан 16; Л-тирозина двунатриевая соль 89,5; Л-валин 93,6; Д кальция пантотенат 4; холина хлорид 4; фолиевая кислота 4; и-инозитол 7; никотинамид 4; пиридоксаль-хлорид 4; рибофлавин 0,4; тиамина хлорид 4; кальция хлорид двухводный 264,9; нитрат железа девятиводный 0,1; калия хлорид 400; магния сульфат семиводный 200; натрия хлорид 6400; натрия бикарбонат 3700; натрия дигидроортофосфат двухводный 141,3; Д-глюкоза 4500; натриевая соль фенола красного 15; натрия пируват 110.

NeyDIL №37 St.III содержит регуляторные пептиды из клеток роговиц фетальных и ювенильных животных в концентрации 100 мкг/мл.

Каждая в отдельности взятая среда, как-то: среда М-199 как наиболее сложная по своему составу, среда Хэма F-10 и Среда Дюльбекко-Игла как наиболее универсальные, поддерживает высокую жизнеспособность чувствительных клеток перевиваемых линий. Однако для органных культур, которые в процессе культивирования остаются интактными и не относятся к перевиваемым линиям, требуется экспериментальный подбор соотношений нескольких сред, в зависимости от гистогенетической характеристики органной культуры. В этой связи для эндотелия трупной донорской роговицы, который относится к глиальной ткани, наиболее оптимальным является выбор трех сред - среда М-199, среда Хэма F-10 и Среда Дюльбекко-Игла, в заявленных соотношениях, имитирующих аминокислотный и метаболический состав водянистой влаги передней камеры интактного глаза.

Хондроитин-сульфат А относится к цитопротекторам - вискоэлластикам, обладая соответствующим знаком и электронным зарядом, он образует поверхностную защитную пленку на клетках эндотелиального пласта роговицы. Тем самым предотвращаются механическое повреждение и десквамация клеток эндотелия роговицы в процессе гипотермической консервации донорского материала.

Декстран с молекулярной массой 40'000 D относится к высокомолекулярным онкотическим компонентам среды и, таким образом, подобранный в оптимальной концентрации создает в среде онкотическое давление, равное 320 млОсм/л, при котором предотвращается процесс набухания клеток и коллоидного вещества стромы донорской роговой оболочки в процессе длительного гипотермического культивирования.

Для предотвращения роста патогенной микрофлоры добавлены: гентамицин-сульфат, оказывающий бактерицидное действие в отношении широкого спектра грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, и амфотерицин В, обладающий фунгицидным и фунгистатическим действиями.

Пептидный препарат NeyDIL №37 St.III в концентрации 1 мкг/мл содержит регуляторные пептиды клеточной цитоплазмы эмбриональных роговых оболочек животных, то есть полученные из гомологичных тканей и имеющие высокий тропизм к клеткам и тканям роговицы. Данный препарат значительно повышает устойчивость липопротеидного слоя мембран эндотелия донорской роговицы к гипотермическим факторам консервации, повышает антиоксидантную активность предлагаемого средства для консервации, тормозит процесс β-окисления липидов эндотелиальных мембран, то есть способствует поддержанию цитоархитектоники клетки.

Заявленное средство для консервации донорской роговицы благодаря входящим в его состав компонентам в обозначенных концентрациях обладает патогенетически направленным, восстанавливающим и защитным действиями на эндотелиальные клетки донорских роговиц, обладает способностью нормализации внутриклеточного метаболизма за счет оптимальной фармакокинетики. Средство, будучи достаточно мощным цитопротектором и метаболитным посредником с физиологически активным началом, также обладает антиоксидантными и мембраностабилизирующими свойствами, тормозит процесс β-окисления липидов эндотелиальных мембран и, помимо этого, способно поддерживать цитоархитектонику клетки. В результате этого создаются наиболее оптимальные условия энергетического анабиоза эндотелиальных клеток донорской роговицы в процессе гипотермической консервации, тем самым продлевается сохранность жизнеспособности и цитоархитектоники эндотелиальных клеток и снижается их консервационная потеря.

Это подтверждает морфометрическое и ультраструктурное исследование 20 донорских роговиц лиц зрелого трудоспособного возраста (28-36 лет). Были сформированы две группы: опытная и контрольная, включающие по 10 донорских роговиц каждая. Опытная группа состояла из 10 роговиц от 10 доноров трупов, данные роговицы хранились в предложенном средстве для консервации роговицы в гипотермических условиях. Контрольная группа включала 10 роговиц от тех же 10 доноров, хранение этих роговиц осуществлялось в среде для консервации роговицы глаза (патент РФ №2069951 - прототип). Для оценки состояния эндотелия использовалась трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия. Сканирующая микроскопия проводилась на растровом ионно-электронном микроскопе Quanta 200 3D с возможностью проведения исследований объектов в режиме естественной среды без глубокого вакуума и напыления и без жесткой фиксации с помощью альдегидов, что не нарушало архитектонику и морфометрию эндотелиальных клеток роговицы. Для подсчета плотности эндотелиальных клеток применялись два подхода: автоматизированный с помощью кератоанализатора, и рутинный, с использованием инвертированного светового микроскопа. Площадь и гексоганальность клеток оценивалась на кератоанализаторе для Глазных банков (модель 98, «Canon», Япония).

Сроки консервации в опытной и контрольной группе составили 3, 6, 9 суток, в эти же сроки проводился анализ морфометрических и ультраструктурных характеристик эндотелиальных клеток донорских роговиц.

При трансмиссионной микроскопии эндотелиальных клеток донорских роговиц наибольшая разница между опытной и контрольной группой была отмечена в образцах на 9 сутки консервации. На Фигуре 1 представлена трансмиссионная электронная микроскопия эндотелиальной клетки роговицы образца из опытной группы на 9 сутки консервирования, увеличение ×40000. Отмечается начинающейся отек митохондриальных мембран и их небольшая сглаженность, в то время как в контроле выявлены грубые ультраструктурные изменения с паринхематозной дегенерацией, то есть осаждением клеточных белков в матриксе цитоплазмы эндотелиальной клетки роговицы, что является проявлением необратимых клеточных процессов. На Фигуре 2 представлена трансмиссионная электронная микроскопия эндотелиальной клетки роговицы образца из контрольной группы на 9 сутки консервирования, увеличение ×40000.

При сканирующей электронной микроскопии образцов роговиц контрольной группы на 9 сутки консервации выявлено разрушение межклеточных взаимоотношений и деструкция липидного слоя мембран. Уменьшение электронно-оптической плотности внутри клеток, говорящее о деструкции и потере внутриклеточных органелл (Фигура 3, Фигура 4). Вышеперечисленные изменения не наблюдались при изучении образцов донорских роговиц, входивших в опытную группу, где клетки сохранили гексо- и пентогональность, без разрушения межклеточных взаимоотношений и без выраженной деструкции липидного слоя мембран (Фигура 5).

При оценке морфометрических характеристик выявлено, что за 9 суток консервации потеря плотности эндотелиальных клеток донорских роговиц в опытной группе составила 4,1%, в контрольной - 7,2%. Процент потери эндотелиальных клеток отображен на Фигуре 6. Динамика снижения плотности эндотелиальных клеток донорских роговиц в опытной и контрольной группах на 3, 6 и 9 сутки консервации показана на Фигуре 7.

Изменение площади эндотелиальных клеток на 3, 6 и 9 сутки консервации отображено на Фигуре 8. Площадь эндотелиальных клеток донорских роговиц к 9 суткам консервации в опытной группе увеличилась на 1,8%, в контрольной группе на 2,9%. Снижение процента гексагональных эндотелиальных клеток донорских роговиц изображено на Фигуре 9. Процент гексагональных эндотелиальных клеток к 9 суткам в опытной группе снизился на 6,86%, а в контрольной группе на 28,31%.

При этом удалось добиться значительного экономического эффекта за счет двукратного сокращения объема консервационной среды (использование 5 мл среды на 1 роговицу вместо 10 мл) и заметно повысить трансплантационные качества трупных донорских роговиц на этапе гипотермической консервации.

Средство для консервации роговицы получают следующим образом: в условиях ламинарной комнаты в химически чистую и стерильную мерную колбу сливают вместе две среды: 25 мл среды 199 и 25 мл среды Хэма F-10. Далее последовательно вносят 0,00014 г гентамицина сульфата 0,00015 г амфотерицина В и 0,0005 пептидного препарата NeyDIL №37 St.III. Состав разделяют на две равные части по 25 мл и растворяют в первой части 5 г декстрана-40, а во второй части 0,5 г хондроитин-сульфата А путем медленного нанесения сухого вещества на поверхность жидкой смеси. После внесения всего количества порошков растворы оставляют до полного набухания на 80-120 минут, после чего полностью растворяют. Затем оба раствора сливают вновь вместе в мерную колбу и добавляют среду Дюльбекко-Игла до метки 100 мл. Затем, после префильтрации через фильтр «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм, среду разливают в пенициллиновые флаконы по 5 мл с одновременной «Глубинной стерилизацией» через систему миллипоровых фильтров с диаметром пор 0,22 мкм. Склянки укупориваются стерильными силиконовыми пробками под жесткую обкатку.

Средство используют следующим образом. В условиях стерильного бокса выкраивают роговицу с ободком склеры диаметром 16 мм. Изолированный корнео-склеральный лоскут помещают во флакон с предварительно охлажденным до +4°С средством, плотно закрывают и помещают в холодильник для сохранения при температуре 4…8°С на срок до 7 суток.

Использование предлагаемого средства для сохранения донорской роговицы в Глазном банке ГУ МНТК «Микрохирургия глаза» позволило увеличить объем заготавливаемого трупного материала для сквозных кератопластик за счет сокращения требований к его отбору и улучшения трансплантационных качеств в процессе хранения в данном средстве.

Средство для сохранения донорской роговицы глаза человека, включающее среду М-199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат, декстран-40, гентамицин-сульфат, амфотерицин В, среду Дюльбекко-Игла, отличающееся тем, что она дополнительно содержит препарат NeyDIL №37 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Среда М-199 25,0
Среда Хэма F-10 25,0
Хондроитин-сульфат А 0,5
Декстран-40 5,0
Гентамицин-сульфат 0,00014
Амфотерицин В 0,00015
NeyDIL №37 St.III 0,00015
Среда Дюльбекко-Игла Остальное


 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной и клинической хирургии и трансплантологии. .
Изобретение относится к области медицины. .
Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине. .

Изобретение относится к медицине. .
Изобретение относится к области медицины. .
Изобретение относится к сельскому хозяйству. .

Изобретение относится к животноводству. .

Изобретение относится к пищевой промышленности. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к криоконсервации клеточных суспензий человека, и может быть использовано в медицине. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии
Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине и касается создания раствора для консервирования ядерных клеток крови при субумеренно низкой температуре и сохранения их в физиологически активном состоянии после отогрева
Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии грыж, и может быть использовано для подготовки аутотрансплантата для герниопластики
Изобретение относится к технологии переработки, консервирования и хранения сырья животного происхождения

Изобретение относится к области медицины, а именно к нормальной, патологической анатомии и судебно-медицинской экспертизе
Изобретение относится к комбинированному криопротекторному раствору для замораживания тромбоцитов при низкой (-80°C) температуре, включающему гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину, лимонную кислоту и воду для инъекций, отличающемуся тем, что дополнительно содержит диметилацетамид при следующем соотношении ингредиентов, мас.%: гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина 1,0%; диметилацетамид 1,25%; лимонная кислота 0,1%; вода для инъекций остальное

Изобретение относится к медицине
Наверх