Средство для консервации донорской роговицы

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии. Средство содержит среду М-199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат, декстран-40, гентамицин-сульфат, амфотеррицин В, среду Дюльбекко-Игла, препарат NeyDIL №37 St.III при следующем соотношении компонентов, мас.%: среда М-199 25,0; среда Хэма F-10 25,0; хондроитин-сульфат А 0,5; декстран-40 5,0; гентамицин-сульфат 0,00014; амфотерицин В 0,00015; NeyDIL №37 St.III 0,00015; Среда Дюльбекко-Игла остальное. Изобретение позволяет повысить биохимическую устойчивость эндотелия к срокам и факторам консервации, сохранить высокую плотность эндотелиальных клеток и ускорить адаптацию трансплантата. 9 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для длительного сохранения, продления жизнеспособности трансплантата роговицы и улучшения его трансплантационных качеств для сквозной кератопластики.

Известна среда для консервации роговицы глаза (патент РФ №2069951), содержащая среду 199 и декстран, дополнительно содержащая среду F-10, среду Дюльбекко-Игла, хондроитин-сульфат, гентамицина сульфат, амфотерицин Б при следующем соотношении компонентов, мас.%: среда М-199 25, среда F-10 25, хондроитин-сульфат 2,7, декстран-40 2,0, гентамицин-сульфат 0,00014, амфотерицин Б 0,00015, среда Дюльбекко-Игла - остальное.

Недостатком этой среды является то, что при низкотемпературной консервации клетки эндотелия роговицы испытывают холодовой стресс с инициацией перекисного окисления и нарушением липо-протеидного слоя клеточных мембран, что приводит к их последующей деструкции и повреждению эндотелиальных клеток трансплантата донорской роговицы на ультраструктурном уровне. Это приводит к потере жизнеспособности донорского материала, к уменьшению плотности эндотелиальных клеток роговицы и соответственно к повышению полиморфизма и полимегетизма клеток и снижению процента гексагональных клеток. Такой донорский материал не пригоден для сквозных кератопластик при наиболее тяжелых бельмах ожоговой этиологии, которые сопровождаются большой потерей эндотелиальных клеток в посттрансплантационном периоде.

Задачей изобретения является создание многокомпонентного средства для длительного сохранения донорской роговицы в режиме глубокой гипотермии (при температуре 4…8°С), длительно сохраняющего жизнеспособность и цитоархитектонику эндотелия (до 9 суток), способного оказывать протективное действие на липопротеидные компоненты мембран, уменьшающего потерю эндотелиальных клеток (менее чем на 5%).

Техническим результатом является улучшение трансплантационных качеств трансплантата роговицы, а именно повышенная биохимическая устойчивость эндотелия к срокам и факторам консервации, сохранение высокой плотности эндотелиальных клеток и быстрая адаптация донорского трансплантата после кератопластики.

Технический результат достигается тем, что данное средство для консервации донорской роговицы, в режиме гипотермической консерваии, содержащее среду М-199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат, декстран-40, гентамицин-сульфат, амфотеррицин В и среду Дюльбекко-Игла, дополнительно содержит препарат NeyDIL №37 St.III (Р/У ЛРС-008827/08-061108), содержащий регуляторные пептиды, полученные из цитоплазмы клеток роговиц фетальных и ювенильных животных по оригинальной технологии.

Средство имеет следующее соотношение компонентов, мас.%:

Среда М-199	25,0
Среда Хэма F-10	25,0
Хондроитин-сульфат А	0,5
Декстран-40	5,0
Гентамицин-сульфат	0,00014
Амфотерицин В	0,00015
NeyDIL №37 St.III	0,00015
Среда Дюльбекко-Игла	остальное

При этом среда М-199 имеет следующий состав, мг/л: Л-аланин 25; Л-аргинина хлорид 70; аспарагиновая кислота 30; Л-цистеина хлорид - 0,0987; Л-цистина двунатриевая соль; Л глютаминовая кислота 66,82; Л-глютамин 100; глютатион 0,05; глицин 50; Л гистидина хлорид одноводный 21,88; Л гидрооксипролин 10; Л-изолейцин 20; Л-лейцин 60; Л лизина хлорид 70; Л-метионин 15; Л-фенилаланин 25; Л-пролин 40; Л-серин 25; Л-треонин 30; Л-триптофан 10; Л-тирозина двунатриевая соль - 49,72; Л-валин 25; Л-аскорбиновая кислота 0,05; биотин 0,01; кальциферол 0,1; Д-кальция пантотенат 0,01; холина хлорид 0,5; фолиевая кислота - 0,01; и-инозитол 0,05; менафтона натрия бисульфат трехводный 0,019; никотиновая кислота 0,025; никотинамид 0,025; пара-амино-бензойная кислота 0,05; пиридоксальхлорид 0,025; пиридоксинхлорид 0,025; рибофлавин 0,01; тиамина хлорид 0,01; Д-Л-токоферола фосфата двунатриевая соль 0,01; витамина А-ацетат 0,1147; кальция хлорид двухводный 185,5; железа нитрат девятиводный 0,01; калия хлорид 400; калия дегидроортофосфат 60; магния сульфат семиводный 200; натрия хлорид 8000; натрия гидроортофосфат 47,5; аденина сульфат 10; 5-АМФ 0,2; АТФ двунатриевая соль 10; холестерол 0,2; 2-дезоксирибоза 0,5; Д-глюкоза 1000; гуанина хлорид - 0,3; гипоксантин 0,3; Д-рибоза 0,5; натрия ацетата 36,71; натриевая соль фенола красного 17; тимин 0,3; твин 80-5; урацил 0,3; ксантин 0,3.

Среда Хэма F-10 имеет следующий состав, мг/л: Л-аланин 8,91; Л-аргинина хлорид 210,7; Л-аспарагин 1-водный - 15,01; Л-аспарагиновая кислота 13,31; Л-цистеина хлорид 31,53; Л-глютаминовая кислота 14,71; Л-глютамин 146,2; глицин 7,51; Л-гистидина хлорид одноводный 20,96; Л-изолейцин 2,62; Л-лейцин 13,12; Л-лизин 29,3; Л-метионин 4,48; Л-фенилаланин 4,96; Л-пролин 11,51; Л-серии 10,5; Л-треонин 3,57; Л-триптофан 0,61; Л-тирозина натриевая соль 2,25; Л-валин 3,51; биотин 0,024; Д кальция пантотенат 0,715; хлорид холина 0,698; фолиевая кислота 1,32; и-инозитол 0,541; никотинамид 0,611; пиридоксин-хлорид 0,206; рибофлавин 0,376; тиамина хлорид 1,012; витамин В12 1,36; кальция хлорид двухводный 44,1; сульфат меди пятиводный 0,0025; сульфат железа семиводный 0,8346; хлорид калия - 285; калия дегидрофосфат 83; магния сульфат семиводный 152,7; натрия хлорид 7400; натрия гидроортофосфат 156,2; цинка сульфат семиводный 0,0288; Д-глюкоза 1100; гипоксантин 4,08; липоевая кислота 0,206; натриевая соль фенола красного 12; натрия пируват 110; тимидин 0,727.

Среда Дюльбекко-Игла имеет следующий состав, мг/л: Л-аргинин 84; Л-цистина двунатриевая соль 56,78; Л-глютамин 584; глицин 30; Л-гистидина хлорид одноводный 42; Л-изолейцин 104,8; Л-лейцин 104,8; Л-лизина хлорид 146,2; Л-метионин 30; Л-фенилаланин - 66; Л-серии 42; Л-треонин 95,2; Л-триптофан 16; Л-тирозина двунатриевая соль 89,5; Л-валин 93,6; Д кальция пантотенат 4; холина хлорид 4; фолиевая кислота 4; и-инозитол 7; никотинамид 4; пиридоксаль-хлорид 4; рибофлавин 0,4; тиамина хлорид 4; кальция хлорид двухводный 264,9; нитрат железа девятиводный 0,1; калия хлорид 400; магния сульфат семиводный 200; натрия хлорид 6400; натрия бикарбонат 3700; натрия дигидроортофосфат двухводный 141,3; Д-глюкоза 4500; натриевая соль фенола красного 15; натрия пируват 110.

NeyDIL №37 St.III содержит регуляторные пептиды из клеток роговиц фетальных и ювенильных животных в концентрации 100 мкг/мл.

Каждая в отдельности взятая среда, как-то: среда М-199 как наиболее сложная по своему составу, среда Хэма F-10 и Среда Дюльбекко-Игла как наиболее универсальные, поддерживает высокую жизнеспособность чувствительных клеток перевиваемых линий. Однако для органных культур, которые в процессе культивирования остаются интактными и не относятся к перевиваемым линиям, требуется экспериментальный подбор соотношений нескольких сред, в зависимости от гистогенетической характеристики органной культуры. В этой связи для эндотелия трупной донорской роговицы, который относится к глиальной ткани, наиболее оптимальным является выбор трех сред - среда М-199, среда Хэма F-10 и Среда Дюльбекко-Игла, в заявленных соотношениях, имитирующих аминокислотный и метаболический состав водянистой влаги передней камеры интактного глаза.

Хондроитин-сульфат А относится к цитопротекторам - вискоэлластикам, обладая соответствующим знаком и электронным зарядом, он образует поверхностную защитную пленку на клетках эндотелиального пласта роговицы. Тем самым предотвращаются механическое повреждение и десквамация клеток эндотелия роговицы в процессе гипотермической консервации донорского материала.

Декстран с молекулярной массой 40'000 D относится к высокомолекулярным онкотическим компонентам среды и, таким образом, подобранный в оптимальной концентрации создает в среде онкотическое давление, равное 320 млОсм/л, при котором предотвращается процесс набухания клеток и коллоидного вещества стромы донорской роговой оболочки в процессе длительного гипотермического культивирования.

Для предотвращения роста патогенной микрофлоры добавлены: гентамицин-сульфат, оказывающий бактерицидное действие в отношении широкого спектра грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, и амфотерицин В, обладающий фунгицидным и фунгистатическим действиями.

Пептидный препарат NeyDIL №37 St.III в концентрации 1 мкг/мл содержит регуляторные пептиды клеточной цитоплазмы эмбриональных роговых оболочек животных, то есть полученные из гомологичных тканей и имеющие высокий тропизм к клеткам и тканям роговицы. Данный препарат значительно повышает устойчивость липопротеидного слоя мембран эндотелия донорской роговицы к гипотермическим факторам консервации, повышает антиоксидантную активность предлагаемого средства для консервации, тормозит процесс β-окисления липидов эндотелиальных мембран, то есть способствует поддержанию цитоархитектоники клетки.

Заявленное средство для консервации донорской роговицы благодаря входящим в его состав компонентам в обозначенных концентрациях обладает патогенетически направленным, восстанавливающим и защитным действиями на эндотелиальные клетки донорских роговиц, обладает способностью нормализации внутриклеточного метаболизма за счет оптимальной фармакокинетики. Средство, будучи достаточно мощным цитопротектором и метаболитным посредником с физиологически активным началом, также обладает антиоксидантными и мембраностабилизирующими свойствами, тормозит процесс β-окисления липидов эндотелиальных мембран и, помимо этого, способно поддерживать цитоархитектонику клетки. В результате этого создаются наиболее оптимальные условия энергетического анабиоза эндотелиальных клеток донорской роговицы в процессе гипотермической консервации, тем самым продлевается сохранность жизнеспособности и цитоархитектоники эндотелиальных клеток и снижается их консервационная потеря.

Это подтверждает морфометрическое и ультраструктурное исследование 20 донорских роговиц лиц зрелого трудоспособного возраста (28-36 лет). Были сформированы две группы: опытная и контрольная, включающие по 10 донорских роговиц каждая. Опытная группа состояла из 10 роговиц от 10 доноров трупов, данные роговицы хранились в предложенном средстве для консервации роговицы в гипотермических условиях. Контрольная группа включала 10 роговиц от тех же 10 доноров, хранение этих роговиц осуществлялось в среде для консервации роговицы глаза (патент РФ №2069951 - прототип). Для оценки состояния эндотелия использовалась трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия. Сканирующая микроскопия проводилась на растровом ионно-электронном микроскопе Quanta 200 3D с возможностью проведения исследований объектов в режиме естественной среды без глубокого вакуума и напыления и без жесткой фиксации с помощью альдегидов, что не нарушало архитектонику и морфометрию эндотелиальных клеток роговицы. Для подсчета плотности эндотелиальных клеток применялись два подхода: автоматизированный с помощью кератоанализатора, и рутинный, с использованием инвертированного светового микроскопа. Площадь и гексоганальность клеток оценивалась на кератоанализаторе для Глазных банков (модель 98, «Canon», Япония).

Сроки консервации в опытной и контрольной группе составили 3, 6, 9 суток, в эти же сроки проводился анализ морфометрических и ультраструктурных характеристик эндотелиальных клеток донорских роговиц.

При трансмиссионной микроскопии эндотелиальных клеток донорских роговиц наибольшая разница между опытной и контрольной группой была отмечена в образцах на 9 сутки консервации. На Фигуре 1 представлена трансмиссионная электронная микроскопия эндотелиальной клетки роговицы образца из опытной группы на 9 сутки консервирования, увеличение ×40000. Отмечается начинающейся отек митохондриальных мембран и их небольшая сглаженность, в то время как в контроле выявлены грубые ультраструктурные изменения с паринхематозной дегенерацией, то есть осаждением клеточных белков в матриксе цитоплазмы эндотелиальной клетки роговицы, что является проявлением необратимых клеточных процессов. На Фигуре 2 представлена трансмиссионная электронная микроскопия эндотелиальной клетки роговицы образца из контрольной группы на 9 сутки консервирования, увеличение ×40000.

При сканирующей электронной микроскопии образцов роговиц контрольной группы на 9 сутки консервации выявлено разрушение межклеточных взаимоотношений и деструкция липидного слоя мембран. Уменьшение электронно-оптической плотности внутри клеток, говорящее о деструкции и потере внутриклеточных органелл (Фигура 3, Фигура 4). Вышеперечисленные изменения не наблюдались при изучении образцов донорских роговиц, входивших в опытную группу, где клетки сохранили гексо- и пентогональность, без разрушения межклеточных взаимоотношений и без выраженной деструкции липидного слоя мембран (Фигура 5).

При оценке морфометрических характеристик выявлено, что за 9 суток консервации потеря плотности эндотелиальных клеток донорских роговиц в опытной группе составила 4,1%, в контрольной - 7,2%. Процент потери эндотелиальных клеток отображен на Фигуре 6. Динамика снижения плотности эндотелиальных клеток донорских роговиц в опытной и контрольной группах на 3, 6 и 9 сутки консервации показана на Фигуре 7.

Изменение площади эндотелиальных клеток на 3, 6 и 9 сутки консервации отображено на Фигуре 8. Площадь эндотелиальных клеток донорских роговиц к 9 суткам консервации в опытной группе увеличилась на 1,8%, в контрольной группе на 2,9%. Снижение процента гексагональных эндотелиальных клеток донорских роговиц изображено на Фигуре 9. Процент гексагональных эндотелиальных клеток к 9 суткам в опытной группе снизился на 6,86%, а в контрольной группе на 28,31%.

При этом удалось добиться значительного экономического эффекта за счет двукратного сокращения объема консервационной среды (использование 5 мл среды на 1 роговицу вместо 10 мл) и заметно повысить трансплантационные качества трупных донорских роговиц на этапе гипотермической консервации.

Средство для консервации роговицы получают следующим образом: в условиях ламинарной комнаты в химически чистую и стерильную мерную колбу сливают вместе две среды: 25 мл среды 199 и 25 мл среды Хэма F-10. Далее последовательно вносят 0,00014 г гентамицина сульфата 0,00015 г амфотерицина В и 0,0005 пептидного препарата NeyDIL №37 St.III. Состав разделяют на две равные части по 25 мл и растворяют в первой части 5 г декстрана-40, а во второй части 0,5 г хондроитин-сульфата А путем медленного нанесения сухого вещества на поверхность жидкой смеси. После внесения всего количества порошков растворы оставляют до полного набухания на 80-120 минут, после чего полностью растворяют. Затем оба раствора сливают вновь вместе в мерную колбу и добавляют среду Дюльбекко-Игла до метки 100 мл. Затем, после префильтрации через фильтр «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм, среду разливают в пенициллиновые флаконы по 5 мл с одновременной «Глубинной стерилизацией» через систему миллипоровых фильтров с диаметром пор 0,22 мкм. Склянки укупориваются стерильными силиконовыми пробками под жесткую обкатку.

Средство используют следующим образом. В условиях стерильного бокса выкраивают роговицу с ободком склеры диаметром 16 мм. Изолированный корнео-склеральный лоскут помещают во флакон с предварительно охлажденным до +4°С средством, плотно закрывают и помещают в холодильник для сохранения при температуре 4…8°С на срок до 7 суток.

Использование предлагаемого средства для сохранения донорской роговицы в Глазном банке ГУ МНТК «Микрохирургия глаза» позволило увеличить объем заготавливаемого трупного материала для сквозных кератопластик за счет сокращения требований к его отбору и улучшения трансплантационных качеств в процессе хранения в данном средстве.

Средство для сохранения донорской роговицы глаза человека, включающее среду М-199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат, декстран-40, гентамицин-сульфат, амфотерицин В, среду Дюльбекко-Игла, отличающееся тем, что она дополнительно содержит препарат NeyDIL №37 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Среда М-199	25,0
Среда Хэма F-10	25,0
Хондроитин-сульфат А	0,5
Декстран-40	5,0
Гентамицин-сульфат	0,00014
Амфотерицин В	0,00015
NeyDIL №37 St.III	0,00015
Среда Дюльбекко-Игла	Остальное