Способ оценки токсической опасности антихолинэстеразных соединений


 


Владельцы патента RU 2526817:

ВОЙСКОВАЯ ЧАСТЬ 41598 (RU)

Изобретение относится к медицине, касается способа оценки токсической опасности антихолинэстеразных соединений (АнХЭС). Суть заявляемого способа заключается в определении антихолинэстеразного эффекта растворов исследуемых АнХЭС на препарат холинэстеразы - фермент пропионилхолинэстераза мозговой ткани кальмара (ПХЭ), а именно в оценке процента угнетения активности ПХЭ в растворах малой - 0,04 Е/мл и высокой - 4 Е/мл концентрации. Токсическую опасность растворов исследуемых АнХЭС определяют по различию их воздействия на активность ПХЭ в растворах малой и высокой концентрации. Если процент угнетения активности ПХЭ в растворе высокой концентрации падает до нуля или не превышает 5-10%, делают заключение о том, что анализируемый раствор содержит высокотоксичное АнХЭС 1 класса опасности. Если величина ингибирующего эффекта остается постоянной или падает не более чем на 10%, делают заключение о наличии малотоксичного АнХЭС. Использование заявленного способа позволяет в течение 30-60 минут оценить токсическую опасность АнХЭС в самых различных ситуациях, когда их состав не известен и они находятся в виде растворов неизвестной концентрации. 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии, касается способа оценки токсической опасности аптихолинэстеразных соединений (АнХЭС), и может быть использовано в непредвиденных чрезвычайных ситуациях (техногенные аварии, террористические акты и т.п.) для выявления чрезвычайно опасных для человека веществ.

В настоящее время АнХЭС находят широкое применение в медицине, сельском хозяйстве и других областях народного хозяйства. Некоторые из них относятся к первому классу опасности [1] и являются потенциальными отравляющими веществами нервно-паралитического типа действия. В этой связи, важное практическое значение имеет оценка токсической опасности подобных чрезвычайно опасных химических соединений и выявление их в условиях непредвиденных чрезвычайных ситуаций.

Известный и широко применяемый в настоящее время способ определения степени опасности любых веществ, в том числе и АнХЭС, основан на оценке показателей их токсичности (например, среднесмертельной дозы (ЛД50)) и подразумевает использование биологических моделей, в качестве которых служат крысы, мыши, кошки, кролики и другие животные. Указанный способ принят в качестве способа-прототипа.

Способ-прототип имеет ряд существенных недостатков, не позволяющих использовать его в условиях непредвиденных чрезвычайных ситуаций. Так, очень важным условием способа-прототипа является необходимость использования исследуемого соединения в ходе экспериментов в чистом виде для того, чтобы затем приготовить его различные разведения и обеспечить введение подопытному животному точного количества токсиканта. В тех же случаях, когда в условиях чрезвычайных ситуаций имеются растворы неизвестных концентраций неизвестных по составу АнХЭС, провести эксперименты с использованием подопытных животных и определить показатели токсичности исследуемых соединений практически не представляется возможным. Определение показателей токсичности с использованием способа-прототипа становится возможным только после анализа качественного и количественного состава исследуемых растворов, то есть после проведения их химико-аналитической экспертизы.

Кроме того, при осуществлении способа-прототипа только для определения порядка уровня показателя токсичности требуется постановка ряда экспериментов с использованием достаточно большого количества подопытных животных [2, 3, 4]. При этом содержаться подопытные животные должны определенным образом, а исследования проводиться в условиях стационарной лаборатории с привлечением специально подготовленного персонала, что обуславливает их высокую трудоемкость, длительность осуществления (до 24 ч) и большие материальные затраты.

Как видно, использование способа-прототипа для оценки токсической опасности АнХЭС в условиях непредвиденных чрезвычайных ситуаций, когда исследуемые соединения находятся в виде растворов неизвестной концентрации и их составы не известны, практически не представляется возможным.

Таким образом, целью изобретения является разработка способа оценки токсической опасности соединений, обладающих антихолинэстеразным типом действия, в различных условиях, в том числе и в непредвиденных чрезвычайных ситуациях, когда их состав не известен и они находятся в виде растворов неизвестной концентрации, отличающегося простотой проведения и позволяющего в короткий срок выявить чрезвычайно опасные соединения.

Поставленная цель достигается за счет использования способа, основу которого составляет определение антихолинэстеразного эффекта исследуемого соединения на препарат холинэстеразы, в качестве которого используют фермент пропионилхолин-эстераза мозговой ткани кальмара (ПХЭ).

Суть заявляемого способа заключается в определении степени угнетения активности ПХЭ под воздействием раствора исследуемого соединения. Фермент ПХЭ используют в двух фиксированных концентрациях - малой (0,04 Е/мл) и высокой (4 Е/мл).

В ходе эксперимента сначала находят разведение раствора исследуемого соединения, которое обеспечивает 30-60% угнетение активности ПХЭ в растворе малой концентрации. Затем это же разведение раствора исследуемого соединения используют для определения эффекта его воздействия на активность ПХЭ в растворе высокой концентрации.

По различию воздействия исследуемого АнХЭС на активность ПХЭ в растворах малой и высокой концентрации определяют, относится исследуемое соединение к высокотоксичным или малотоксичным веществам. В том случае, если процент угнетения активности ПХЭ в растворе высокой концентрации падает до нуля или не превышает 5-10%, делают заключение о том, что анализируемый раствор содерхит высокотоксичное антихолинэстеразное соединение 1 класса опасности, то есть выявляют чрезвычайно опасное для человека соединение. Если же величина ингибирующего эффекта остается постоянной или падает не более чем на 10%, делают заключение о наличии малотоксичного АнХЭС.

Возможность достижения цели изобретения подтверждается результатами проведенных исследований, представленными в следующих примерах.

Пример 1. Реализация заявляемого способа оценки токсической опасности антихолинэстеразных соединений.

При осуществлении заявляемого способа определяют антихолинэстеразный эффект исследуемого соединения на фермент ПХЭ, а именно оценивают степень угнетения активности ПХЭ под воздействием раствора исследуемого соединения. При этом фермент ПХЭ используют в растворах двух концентраций, отличающихся по содержанию фермента в 100 раз. Готовят два раствора ПХЭ в 0,2 М фосфатном буфере pH 7,5 с активностью фермента 0,04 Е/мл и 4,0 Е/мл.

Используют также водный раствор ацетилтиохолинйодида (АТХЙ) в концептрации 5,78 мг/мл и раствор реактива Эллмана в концентрации 0,792 мг/мл.

В ходе эксперимента сначала находят разведение раствора исследуемого соединения, которое при смешивании с равным объемом раствора фермента малой концентрации (0,04 Е/мл) вызывает угнетение активности ПХЭ на 30-60%. Затем это же разведение исследуемого соединения используют для определения степени угнетения активности ПХЭ в его растворе высокой концентрации (4 Е/мл).

Для проведения исследований к 1 мл раствора фермента с активностью 0,04 Е/мл добавляют 1 мл раствора исследуемого соединения и выдерживают в течение 3 минут при комнатной температуре. Полученную смесь смешивают с заранее приготовленным раствором, содержащим 1 мл дистиллированной воды, 1 мл фосфатного буфера, 0,5 мл раствора АТХЙ и 0,5 мл раствора реактива Эллмана. Раствор перемешивают и через 3 минуты измеряют его оптическую плотность с помощью спектрофотометра при длине волны 412 нм. Параллельно готовят контрольную пробу, в которой вместо разведения раствора исследуемого соединения используют дистиллированную воду.

Расчет процента угнетения активности фермента (i %) проводят по формуле:

i % = ( 1 D о п D к ) 100, ( 1 )

где Dоп - оптическая плотность опытной пробы;

Dк - оптическая плотность контрольной пробы.

Затем подбирают разведение раствора исследуемого соединения, которое вызывает угнетение активности ПХЭ на 30-60% при концентрации раствора фермента 0,04 Е/мл. Это же разведение раствора исследуемого соединения в дальнейшем используют для угнетения активности ПХЭ в растворе концентрации 4 Е/мл. С этой целью, к 1 мл раствора фермента с активностью 4 Е/мл добавляют 1 мл раствора исследуемого соединения и выдерживают в течение 3 минут при комнатной температуре. Затем отбирают 0,02 мл и выливают в заранее приготовленную смесь, содержащую 2,98 мл дистиллированной воды, 1 мл фосфатного буфера, 0,5 мл раствора АТХЙ и 0,5 мл раствора реактива Эллмана. Полученную смесь перемешивают и через 3 минуты измеряют ее оптическую плотность при длине волны 412 нм. Для расчета процента угнетения активности ПХЭ используют показатель оптической плотности параллельно проведенной контрольный пробы, в которой вместо разведения раствора исследуемого соединения используют дистиллированную воду.

В том случае, если процент угнетения активности ПХЭ в растворе высокой концентрации падает до пуля или не превышает 5-10%, делают заключение о том, что анализируемый раствор содержит высокотоксичное антихолинэстеразное соединение 1 класса опасности, то есть выявляют чрезвычайно опасное для человека соединение. Если же величина ингибирующего эффекта остается постоянной или падает не более чем па 10%, делают заключение о наличии малотоксичного АнХЭС.

Как видно, заявляемый способ довольно просто осуществить, причем в самых различных условиях. Для проведения исследований затрачивается не более 30-60 минут. В отличие от способа-прототипа исключается длительное, трудоемкое и дорогостоящее определение показателей токсичности с использованием большого количества подопытных животных.

Пример 2. Оценка токсической опасности антихолинэстеразных соединений с применением заявляемого способа.

При использовании заявляемого способа проведена оценка токсической опасности различных антихолинэстеразных соединений, в том числе:

- O-изопропил-метил-фтор-фосфонат (вещество 1);

- O-пинаколил-метил-фтор-фосфонат (вещество 2);

- O-этил-S-диизопропил-аминоэтил-метил-тио-фосфоиат (вещество 3);

- O-изобутил-S-диэтил-аминоэтил-метил-тио-фосфонат (вещество 4);

- O,O-диметил-O,2,2-дихлорвинил-фосфат (ДДВФ);

- O-паранитрофенил-O,O-диэтилфосфат (фосфакол);

- О-паранитрофенил-O-этил-этилфосфонат (армии);

- Дихлоргидрат-N,N-диметил-(2-диметиламиноэтил-пиридил-3) карбамат (аминостигмин);

- N-метил-N-децил-(2-N,N-диметил-амино-метил-пиридил-3) карбамат (оксалат) (ИХ-118);

- 1,3A,8-триметил-2-3-a,8a-тетрагидропирроло[3'2b]-индол-5ил-N-метил-карбамат салициловокислый (эзерин).

Включение в эксперимент указанных широко известных соединений связано прежде всего с тем, что в литературе имеются сведения по оценке их токсичности с использованием способа-прототипа [5, 6, 7, 8]. Кроме того, известно, что согласно требованиям ГОСТ [9] при токсичности 0,1 мг/кг и ниже соединение относится к первому классу опасности, а при токсичности 1,1-10,0 мг/кг - к третьему классу. Сведения по оценке опасности всех рассматриваемых соединений на основании оценки показателей их токсичности в доступных источниках информации также имеются. Так, известно, что вещества 1-4 являются высокотоксичными и относятся к 1 классу опасности, а остальные используемые в эксперименте соединения - малотоксичные вещества 3 класса опасности.

Результаты оценки токсической опасности антихолинэстеразных соединений с применением заявляемого способа свидетельствуют о том, что растворы веществ 1, 2, 3 4 следует отнести к чрезвычайно опасным АнХЭС 1 класса опасности, так как они вызывают угнетение активности ПХЭ в растворах малой концентрации (0,04 Е/мл) на 30-60%. Степень же угнетения ими активности ПХЭ в растворах высокой концентрации (4 Е/мл) составляет 5-8%. Такая оценка полностью подтверждает имеющиеся сведения по токсичности и опасности рассматриваемых высокотоксичных веществ.

В то же самое время, остальные используемые в эксперименте антихолинэстеразные соединения более значительно угнетают активность ПХЭ и растворах высокой концентрации (4 Е/мл) - на 28-42%, Падение же ингибирующей активности для таких соединений (по сравнению с растворами малой концентрации - 0,04 Е/мл) не превышало 10%. Это свидетельствует о том, что указанные соединения не относятся к 1 классу опасности, что также совпадает с имеющимися сведениями об указанных малотоксичных веществах, относящихся к 3 классу опасности (таблица).

Таким образом, заявляемый способ позволяет быстро оценить токсическую опасность антихолинэстеразных соединений неизвестного состава, находящихся в виде растворов неизвестных концентраций, что практически невозможно осуществить в экспериментах на животных с использованием способа-прототипа. При этом заявляемый способ достаточно прост в проведении и может быть использован в самых различных ситуациях, в том числе и в непредвиденных чрезвычайных (техногенные аварии, террористические акты и т.п.).

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «новизна», так как впервые для оценки токсической опасности и выявления чрезвычайно опасных веществ антихолинэстеразного типа действия предложено использовать способ, предусматривающий определение степени угнетения растворами антихолинэстеразных соединений активности фермента пропионилхолинэстераза мозговой ткани кальмара, взятого в двух различных концентрациях.

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», так как в известных и доступных источниках информации, содержащих описания способов определения токсической опасности антихолинэстеразных соединений, нет сведений, указывающих на возможность и целесообразность определения для этой цели антихолинэстеразных эффектов на фермент пропионилхолинэстераза мозговой ткани кальмара, и использование при этом растворов фермента двух концентраций.

Соответствие критерию «пригодность для применения» подтверждается результатами проведенного исследования, показавшими, что предлагаемый способ достаточно прост в проведении, позволяет в любых условиях быстро и надежно различить высокотоксичные и малотоксичные антихолинэстеразные соединения и выявить чрезвычайно опасные для человека вещества.

Способ оценки токсической опасности антихолинэстеразных соединений

Таблица.

Оценка токсической опасности антихолинэстеразных соединений с применением заявляемого способа

Исследуемое антихолинэстеразное соединение Процент угнетения активности фермента ПХЭ в растворе концентрации Класс токсической опасности
0,04 Е/мл 4,0 Е/мл
Вещество 1 60 8 1
Вещество 2 55 5 1
Вещество 3 60 0 1
Вещество 4 40 0 1
ДДВФ 44 34 3
Фосфакол 38 30 3
Армин 30 28 3
Аминостигмин 44 34 3
ИХ-118 40 42 3
Эзерин 52 42 3

ЛИТЕРАТУРА

1. ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества, классификация и общие требования безопасности». М.: ФГУП «Стаидартинформ». - 2007. - 6 с.

2. Прозоровский В.Б. Практическое пособие по ускоренному определению средних эффективных доз и концентраций биологически активных веществ. Институт Экологической Токсикологии, МООСПР РФ, г. Байкальск. - 1994. - 46 с.

3. Прозоровский В.Б., Козяков В.П. Скорость наступления эффекта - токсикомет-рический критерий воздействия яда в малых дозах. Токсикологический вестник. - 2002. №2, март-апрель. - С.18-20.

4. «Руководство по токсикологии отравляющих веществ». Под ред. академика С.Н. Голикова. М: Изд-во Медицина. - 1972. - 472 с.

5. Прозоровский В.Б. Саватеев Н.В. Неантихолинэстеразные механизмы действия антихолинэстеразных средств. Л: Медицина. - 1976. - 160 с.

6. Прозоровский В.Б., Павлова Л.В., Суслова И.М. Фармакологическая характеристика нового антихолинэстеразного средства амипостигмина // Эксперим. и клин. фармакол. - 1992. №1. - С.13-16.

7. Колла В.Э., Сыропятов Б.Я. Дозы лекарственных средств и химических соединений для лабораторных животных. М: Медицина. - 1998. - 263 с.

8. Справочник по пестицидам (Гигиена применения и токсикология). Под редакцией академика АМН СССР Л.И. Медведя. Киев: Изд-во Урожай. - 1974. - 448 с.

9. ГОСТ 12.1.005-88 «Общие сапитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны». М.: ФГУП «Стандартинформ». - 1988. - 49 с.

Способ оценки токсической опасности антихолинэстеразных соединений, отличающийся тем, что определяют антихолинэстеразный эффект растворов исследуемых соединений с антихолинэстеразным типом действия на препарат холинэстеразы, в качестве которого используют фермент пропионилхолинэстераза мозговой ткани кальмара, а именно оценивают процент угнетения активности фермента, который используют в растворах двух концентраций - 0,04 Е/мл и 4 Е/мл, для чего сначала подбирают разведение раствора исследуемого соединения, которое обеспечивает 30-60% угнетение активности пропионилхолинэстеразы в растворе малой концентрации, составляющей 0,04 Е/мл, а затем это же разведение раствора исследуемого соединения используют для оценки процента угнетения активности пропионилхолинэстеразы в растворе высокой концентрации, составляющей 4 Е/мл, причем токсическую опасность растворов исследуемых антихолинэстеразных соединений определяют по различию их воздействия на активность пропионилхолинэстеразы в растворах малой и высокой концентрации, и в том случае, если процент угнетения активности пропионилхолинэстеразы в растворе высокой концентрации падает до нуля или не превышает 5-10%, делают заключение о том, что анализируемый раствор содержит высокотоксичное антихолинэстеразное соединение 1 класса опасности, а если величина ингибирующего эффекта остается постоянной или падает не более чем на 10%, делают заключение о наличии малотоксичного антихолинэстеразного соединения.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к мониторингу окружающей среды и биологических объектов на предмет определения содержания ионов металлов в жидких средах с использованием фотохромных соединений.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности комплексного лечения больных раком легкого в раннем послеоперационном периоде.

Изобретение относится к медицине, в частности к биологической химии, и предназначено для более полной оценки окислительной модификации белков (ОМБ) и анализа соотношения альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ) и кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ) основного и нейтрального характера в плазме и клетках крови, а также в тканях животных с целью определения степени выраженности и стадии окислительного стресса.

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения высокого тромбогенного риска у беременных при проведении экстракорпорального оплодотворения в плазме крови.

Изобретение относится к области медицины, включающей исследования биологического материала, и касается определения относительной длины теломер на хромосомах. Способ заключается в выявлении укорочения относительной длины теломер на отдельных хромосомах Т-лимфоцитов периферической крови с помощью метода количественной флуоресцентной гибридизации in situ (Q-FISH).

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано для раннего выявления дисметаболической нефропатии у детей 3-7 лет. Способ заключается в исследовании пробы мочи после взаимодействия мочи с 10% водным раствором хлорида кальция фотометрически на микропланшетном ридере при длине волны 620 нм и количественном определении кристаллообразующей способности мочи по формуле: Соп-(Dn-Dn-1)·13,4/(D4-D3), где D4 - оптическая плотность стандартного раствора 13,4 г/л оксалата натрия с 10% раствором хлористого кальция, D3 - оптическая плотность стандартного раствора 13,4 г/л оксалата натрия с дистиллированной водой, Dn - оптическая плотность опытной пробы пациента №Х с 10% раствором хлористого кальция, Dn-1 - оптическая плотность опытной пробы пациента с дистиллированной водой, 13,4 г/л - концентрация стандартного раствора оксалата натрия.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и неонатологии, и может быть использовано для прогнозирования патологического течения неонатального периода.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для экспресс-диагностики злокачественных опухолей в условиях больницы на интраоперационном этапе.

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано для скрининга детей дошкольного возраста с целью раннего выявления у них возможности инфекции мочевыводящих путей.

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к использованию бактериальной бета-лактамазы для диагностики in vitro и визуализации, диагностики и лечения in vivo.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и касается диагностики функционального класса хронической сердечной недостаточности (ХСН). Диагностику осуществляют по разработанной формуле, учитывающей оценку значений изменения конечного диастолического объема левого желудочка сердца и толщины межжелудочковой перегородки в диастолу, определяемых при проведении эхокардиографии, а также изменения значений NT-концевого фрагмента предшественника мозгового натрийуретического пептида.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности лечения больных неходжкинскими лимфомами с поражением костного мозга.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для автоматического анализа образцов кала. Автоматический анализатор образцов кала содержит автоматический контроллер, контейнер для образцов, разжижающее устройство, перемешивающее и смешивающее устройство, анализирующее устройство, устройство всасывания и очистки, соединенное трубопроводами с анализирующим устройством.
Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики паразитозов желудочно-кишечного тракта животных в молочный период. Пробу помещают в стакан, заливают флотационной жидкостью, размешивают, процеживают, дают взвеси отстояться в течение 15-20 минут для обнаружения ооцист простейших или в течение 40 минут для обнаружения яиц гельминтов.
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для дифференциальной морфометрической диагностики эритродермической формы грибовидного микоза и синдрома псевдолимфомы кожи.

Группа изобретений относится к системе и методу для мониторинга соответствующего по меньшей мере одного параметра крови различных пациентов посредством устройств для обеспечения доступа, обеспечивающих соответствующий по меньшей мере один доступ к крови каждого пациента через кожу, отборных устройств для отбора образов для отбора соответствующего некоторого количества крови у каждого пациента с получением соответствующего по меньшей мере одного образца крови, аналитического устройства для анализа крови, выполненного с возможностью совместного анализа образцов крови, для анализа предварительно определенных параметров крови образца крови, общего вычислительного устройства для вычисления параметров медикаментов, которые необходимо ввести соответствующим пациентам, на основании записей данных, соответствующих определенным параметрам проанализированной крови, и подающих устройств для подачи соответствующих медикаментов с вычисленными параметрами медикаментов.

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для управления биохимическими реакциями in vitro и in vivo. Управление осуществляется посредством воздействия на магнитную наносуспензию, содержащую биоактивную макромолекулу, прикрепленную непосредственно или через лиганд к однодоменным магнитным наночастицам, внешним низкоинтенсивным низкочастотным переменным магнитным полем, обеспечивающим деформацию и/или изменение конформации участвующих в реакции биоактивных макромолекул.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, неонатологии и пульмонологии, и может быть использовано для оценки эффективности лечения пневмонии у новорожденных детей с очень низкой (ОНМТ) и экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) при рождении.
Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для приготовления гистологических препаратов. Способ включает взятие материала и его фиксацию в жидкости, обезвоживание и заливку в парафин, приготовление срезов.

Изобретение относится к медицине и описывает способ прогнозирования эффективности защиты лимфоцитов от переокисления путем определения концентрации гидроксирадикалов, в котором при комплексном внесении в среду инкубации лимфоцитов 1,4-дитиоэритритола и аскорбиновой кислоты в конечной концентрации 2,5 мМ и 0,07 мМ соответственно защиту лимфоцитов от гидроксирадикалов оценивают как эффективную при росте в среде гидроксирадикалов до 7% и менее, а неэффективную при росте в среде гидроксирадикалов до 8% и более.
Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и представляет собой способ диагностики наружного генитального эндометриоза, включающий исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют уровень липопротеинов высокой плотности и при величине 0,77 ммоль/л и выше диагностируют наружный генитальный эндометриоз. Изобретение позволяет повысить точность и упростить процедуру диагностики наружного генитального эндометриоза. 3 пр.
Наверх