Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа а/рr/8/59/m2 (h1n1), предназначенный для получения вакцинных штаммов вируса гриппа в качестве донора аттенуации, вакцинные штаммы вируса гриппа а/59/м2/калифорния/66/2211 (н2n2) и а/59/м2/токио/67/22111 (н2n2)

Изобретения касаются штаммов вируса гриппа A/PR/8/59/M2 (H1N1), A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67 (H2N2). Вакцинные штаммы A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2) и A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2) - реассортанты, полученные путем скрещивания эпидемических вирусов A/Калифорния/1/66 (H2N2) и А/Токио/3/67 (H2N2) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом A/PR/8/59/M2 (H1N1). Штаммы A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2) и A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2) характеризуются температурочувствительностью, холодоадаптированностью, безвредностью и иммуногенностью для лабораторных животных. Реассортанты унаследовали два гена, кодирующие поверхностные антигены вируса (гемагглютинин и нейраминидазу), от эпидемического вируса и остальные шесть генов, кодирующие негликозилированные белки, от донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1). Представленные изобретения могут быть использованы при получении живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении. Создан донор аттенуации для получения вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины для профилактики гриппа (Ortomyxoviridae, род Influenza) подтипа A(H2N2) среди взрослых и детей в случае его возвращения в циркуляцию. Также получены два вакцинных штамма вируса гриппа подтипа A(H2N2) - А/59/М2/Калифорния/66/2211 (H2N2) и А/59/М2/Токио/67/22111 (H2N2) на основе заявляемого донора аттенуации.

Известен донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука.- 1994.-151 с]. Указанный штамм А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) по антигенным свойствам близок к вирусам A(H2N2), циркулировавшим в 1957-1968 годах, и при подготовке вакцинных штаммов A(H2N2) методом классической реассортации возникают методические сложности, т.к. гипериммунная сыворотка к донору А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) перекрестно реагирует с эпидемическими A(H2N2) вирусами, не позволяя образоваться реассортантам.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение нового донора аттенуации с антигенной структурой, отличной от A(H2N2).

Такой штамм был создан в результате тщательного изучения многочисленных вариантов объектов исследования, это - донор аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1). Прототипом полученного штамма A/PR/8/59/M2 (H1N1) явился известный донор аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1) [Egorov AYu, Medvedeva ТЕ, Polezhaev Fl, et al. Peculiarities of obtaining and characterization of a cold-adapted A/PR/8/34 influenza virus variant // Acta Virol.- 1984.- Vol.28.- No.1.- Р.19-25]. Причиной создания нового донора было следующее (недостатки известного штамма): прототип A/PR/8/59/1 (H1N1) является устойчивым к химиопрепаратам адамантанового ряда (амантадин, ремантадин).

Из литературы известно, что устойчивость вирусов гриппа типа А к адамантанам развивается в результате единичной мутации в любой из следующих позиций аминокислот в М2 белке: 26 (лейцин), 27 (валин), 30 (аланин), 31 (серии) или 34 (глицин) [Belshe RB, Smith МН, Hall СВ, et al. Genetic basis of resistance to rimantadine emerging during treatment of influenza virus infection // J Virol.- 1988.-Vol.62.- P.1508-1512; D.M. Weinstock and G. Zuccotti. Adamantane Resistance in Influenza A // JAMA.- 2006.- Vol.295, No.8, Р.934-936]. По данным полногеномного секвенирования, прототип A/PR/8/59/1 (H1N1) является устойчивым к адамантанам благодаря наличию аминокислот треонина и аргинина в позициях 27 и 31 М2 белка соответственно.

Устойчивость к данным препаратам ограничивает использование вакцинного штамма вируса на его основе для массовой иммунизации населения, поскольку именно ремантадин является наиболее легкодоступным средством для лечения гриппозной инфекции в случае возникновения непредвиденной реакции на вакцинацию.

Для устранения этого недостатка необходимо было модифицировать донор аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1) путем внесения двух мутаций в М2 белок вируса: замена треонина (Thr) на валин (Val) и аргинина (Аrg) на серии (Ser) в позициях 27 и 31 соответственно.

Новый донор аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) был получен генно-инженерным путем после модификации набора плазмид, несущих полноразмерные ДНК-копии восьми сегментов «дикого» вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) [Hoffmann, Е., Neumann, G., Hobom, G., et al. "Ambisense" approach for the generation of influenza A virus: vRNA and mRNA synthesis from one template // Virology.- 2000. -Vol.267.- No.2.- P.310-317; Subbarao, K., Chen, H., Swayne, D. et al. Evaluation of a genetically modified reassortant H5N1 influenza A virus vaccine candidate generated by plasmid-based reverse genetics // Virology.- 2003.- Vol.305.- No.1.- Р.192-200]. Полученный штамм A/PR/8/59/M2 (H1N1) по аминокислотной последовательности внутренних генов идентичен вирусу A/PR/8/59/1 (H1N1), за исключением М2 белка, в который были внесены две мутации (Thr-27-Val и Arg-31-Ser), отвечающие за его адамантан-чувствительность.

Известно, что штамм A/PR/8/59/1 (H1N1) является аттенуированным для людей, так как обладает свойствами температурочувствительности и холодоадаптированности [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука.- 1994.-151 с]. Полученный нами донор A/PR/8/59/M2 (H1N1) также обладает признаками температурочувствительности и холодоадаптированности. Поэтому новый донор также является аттенуированным для человека.

Пример выполнения

Штамм A/PR/8/59/M2 (H1N1) был получен с использованием методов обратной генетики, которые включали в себя следующее. Была определена нуклеотидная последовательность шести внутренних генов известного донора A/PR/8/59/1 (H1N1) с использованием автоматического секвенатора. Далее полученный сиквенс сравнивался с нуклеотидной последовательностью генов вируса A/PR/8/34 (H1N1), клонированных в векторы для обратной генетики [Hoffmann, Е., Neumann, G., Hobom, G., et al. "Ambisense" approach for the generation of influenza A virus: vRNA and mRNA synthesis from one template // Virology.- 2000. -Vol.267.- No.2.- Р.310-317].

Найденные аминокислотные различия представлены в Таблице 1. С помощью целенаправленного точечного мутагенеза были модифицированы шесть генов вируса A/PR/8/34 (H1N1) таким образом, чтобы их аминокислотная последовательность стала идентичной вирусу A/PR/8/59/1 (H1N1). Далее в М ген были внесены дополнительные мутации AC-792,793-GT и A-805-G, отвечающие за адамантан-чувствительность вируса. Мутагенез ДНК-копий генов вируса A/PR/8/34 (H1N1) проводили при использовании набора для мутагенеза «QuikChange XL Multi site-directed mutagenesis kit» (Stratagene, La Jolla, Калифорния, США) согласно инструкциям производителя.

Новый донор аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) был получен в результате трансфекции линии клеток 293Т набором из восьми плазмид: шесть модифицированных плазмид, несущих внутренние гены вируса A/PR/8/59/1 (H1N1), и две плазмиды, несущие гены гемагглютинина и нейраминидазы вируса A/PR/8/34 (H1N1). Далее полученный вирус накапливали в 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах при оптимальных условиях: 33°С, 48 часов.

Используя метод полногеномного секвенирования вируса гриппа, была определена полная нуклеотидная последовательность штамма A/PR/8/59/M2 (H1N1), что подтвердило идентичность аминокислотной последовательности его внутренних генов исходному вирусу A/PR/8/59/1 (H1N1), за исключением двух позиций в М2-белке (Val-27 и Ser-31).

Нуклеотидная последовательность генов гемагглютинина и нейраминидазы была идентична вирусу A/PR/8/34 (H1N1).

Новый донор аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) характеризуется признаками температурочувствительности и холодоадаптированности, характерными для исходного вируса A/PR/8/59/1 (H1N1). Он обладает пониженным уровнем репродукции в куриных эмбрионах при 39°С (RCT39, разница в активностях репродукции клона при 33°С и 39°С составляет 6,4 lg ЭИД50/0,2 мл), и активно размножается при температуре 26°С (RCT26, разница в репродукциях при 33°С и 26°С составляет 2,3 lg ЭИД50/0,2 мл). Таким образом, по этим двум признакам модифицированный донор не отличается от исходного донора аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1) (Таблица 2).

Аттенуацию нового донора оценивали по интенсивности его репродукции в респираторном тракте (носовых ходах и легких) мышей линии СВА в сравнении с исходным вирусом A/PR/8/59/1 (H1N1) и вирусом «дикого» типа A/PR/8/34 (H1N1). Репродукция в носовых ходах мышей всех исследованных вирусов колебалась в пределах 3.9-5.3 lg ЭИД50/мл.

«Дикий» вирус активно репродуцировался в легких. Отмечен сниженный уровень репродукции в легких мышей донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) и его прототипа по сравнению с «диким» вирусом (1,5 Ig ЭИД50/мл против 6,8 Ig ЭИД50/мл соответственно) (Таблица 2). Снижение уровня репродукции вируса гриппа в легких мышей более чем в 10000 раз по сравнению с «диким» вирусом является весьма существенным для созданного донора.

Чувствительность нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) к препаратам адамантанового ряда оценивали путем титрования вируса в культуре клеток MDCK в присутствии или отсутствии в ростовой среде производного адамантана - ремантадина (0,5 или 5,0 мкг/мл). Титр вируса выражали в Ig TCID50/мл, при этом чувствительность вируса к ремантадину оценивали по степени снижения титра вируса в присутствии ремантадина по сравнению с титром вируса без препарата. В качестве контрольного адамантан-устойчивого вируса брали «дикий» штамм вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1).

Из таблицы 3 видно, что добавление ремантадина к новому донору аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) приводило к существенному снижению титра вируса в культуре клеток MDCK. Так, добавление рементадина в концентрации 0,5 мкг/мл снижало титр вируса на 1,8 Ig TCID50, а увеличение концентрации препарата до 5,0 мкг/мл привело к снижению титра вируса на 2,3 Ig TCID50, т.е. в 200 раз.

Контрольный вирус A/PR/8/34 (H1N1) не проявлял чувствительности к ремантадину, сохраняя высокий титр даже в присутствии 5,0 мкг/мл препарата.

Таким образом, заявляемый штамм A/PR/8/59/M2 (H1N1) по своим характеристикам соответствует требованиям, предъявляемым к донорам аттенуации для живой гриппозной вакцины.

Штамм A/PR/8/59/M2 (H1N1) депонирован 10.03.2011 года в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под № V-654.

Прототипом полученных на основе нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) вакцинных штаммов является известный холодоадаптированный штамм вируса гриппа A/Москва/21/17/65 (H2N2), входивший в состав живой гриппозной вакцины для детей в 1967 году [Александрова Г.И., Микуцкая Б.А., Сиротенко Е.А. и др. Итоги изучения специализированного варианта живой гриппозной вакцины для иммунизации детей дошкольного и младшего школьного возраста // Вестник АМН СССР. - 1968. - №9. - С.41-45]. Данный вакцинный штамм был приготовлен серийными пассажами при сниженной температуре эпидемического вируса, выделенного в 1965 году.

Однако в последние годы циркуляции (1966-1967) вирусы H2N2 претерпели значительные антигенные изменения, и вакцинный штамм А/Москва/21/17/65 (H2N2) в случае возвращения в человеческую популяцию вирусов, циркулировавших в конце H2N2 волны, не сможет вызвать защитную реакцию у привитых людей [Lindstrom SE, Сох NJ, Klimov A. Genetic analysis of human H2N2 and early H3N2 influenza viruses, 1957-1972: evidence for genetic divergence and multiple reassortment events // Virology.- 2004.- Vol.328.- p.101-119].

Известно, что в конце эпидемического цикла H2N2 циркулирующие вирусы разделились на две ветви, значительно различающиеся по антигенным свойствам.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение потенциально пандемических вакцинных штаммов для взрослых и детей с антигенной структурой вирусов H2N2, действовавших в конце эпидемического цикла - вирусов А/Калифорния/1/66 (H2N2) и А/Токио/3/67 (H2N2), принадлежащих к двум разным ветвям вирусов H2N2 конца эпидемической волны 1966-1967 гг.

Вакцинный штамм вируса гриппа А/59/М2/Калифорния/66/2211 (H2N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Калифорния/1/66 (H2N2) с холодоадаптированным температурочувствительным донором аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1), с последующей селекцией при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации.

Вакцинный штамм А/59/М2/Калифорния/66/2211 (H2N2) является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 39°С составляет 7,5 lg ЭИД50/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 26°С равна 3,1 lg ЭИД50/0,2 мл).

Ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА идентичен вирусу А/Калифорния/1/66 (H2N2), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется.

Методом полногеномного секвенирования установлено, что вакцинный штамм А/59/М2/Калифорния/66/2211 (H2N2) унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS), от донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1), а поверхностные белки гемагглютинин и нейраминидазу (NA) от эпидемического вируса А/Калифорния/1 /66 (H2N2).

Таким образом, представленный вакцинный штамм А/59/М2/Калифорния/66/2211 (H2N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Калифорния/1/66 (H2N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34°С в течение 48 часов - 9,2 lg ЭИД50/МЛ. Гемагглютинирующая активность -1:1024.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Пример получения вакцинного штамма А/59/М2/Калифорния/66/2211 (H2N2) представлен в прилагаемом паспорте.

Штамм депонирован в коллекции Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под №2652.

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма А/59/М2/Калифорния/66/2211 (H2N2).

2. Серия: серия 1 (первая).

3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:

а) эпидемический вирус-А/Калифорния/1/66 (H2N2);

б) донор аттенуации: A/PR/8/59/M2 (H1N1).

4. Количество пассажей: 5 в процессе реассортации.

5. Характеристика штамма до лиофилизации:

а) оптимальные условия репродукции: 33°С, 48 часов;

б) гемагглютинирующая активность: 1:1024;

в) инфекционная активность: 8.5 lg ЭИД50/0,2 мл;

г) чувствительность к ингибиторам: ингибитороустойчивый в РТГА с нормальной сывороткой крови лошади и морской свинки;

д) разность в показателях инфекционной активности при 33°С / 39°С: 7,5 lg ЭИД50/0,2 мл;

е) разность в показателях инфекционной активности при 33°С / 26°С: 3,1 lg ЭИД50/0,2 мл;

ж) структура генома реассортанта по данным частичного секвенирования генов:

гены от эпидемического вируса: НА, NA;

гены от донора аттенуации: РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS.

6. Антигенная специфичность гемагглютинина:

гемагглютинин в РТГА идентичен вирусу А/Калифорния/1 /66 (H2N2), крысиной антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Антигенная специфичность нейраминидазы:

нейраминидаза идентична А/Калифорния/1/66 (H2N2) по данным полного секвенирования генов.

7. Характеристика штамма после лиофилизации:

а) дата лиофилизации - 25 апреля 2011 г.;

б) объем материала в ампуле - 1,0 мл;

в) инфекционная активность - 7,7 lg ЭИД50/0.2 мл;

8. Бактериологический контроль: дата учета - 1 июня 2011 года, результат - стерилен.

9. Безвредность для мышей и морских свинок при подкожном и внутрибрюшинном введении: безвреден.

Вакцинный штамм А/59/М2/Токио/67/22111 (H2N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Токио/3/67 (H2N2) с холодоадаптированным температурочувствительным донором аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) с последующей селекцией при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации.

Вакцинный штамм А/59/М2/Токио/67/22111 (H2N2) является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 39°С составляет 6,9 lg ЭИД50/мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 26°С равна 3,2 lg ЭИД50/мл).

Ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА идентичен вирусу А/Токио/3/67 (H2N2), антисывороткой к которому он полностью нейтрализуется.

Методом полногеномного секвенирования установлено, что вакцинный штамм А/59/М2/Токио/67/22111 (H2N2) унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS), от донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1), а поверхностные белки гемагглютинин и нейраминидазу (NA) от эпидемического вируса А/Токио/3/67 (H2N2).

Таким образом, представленный вакцинный штамм А/59/М2/Токио/67/22111 (H2N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Токио/3/67 (H2N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34°С в течение 48 часов - 9,0 lg ЭИД50/мл. Гемагглютинирующая активность -1:1024.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Пример получения вакцинного штамма А/59/М2/Токио/67/22111 (H2N2) представлен в прилагаемом паспорте.

Штамм депонирован в коллекции Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под №2653.

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма А/59/М2/Токио/67/22111 (H2N2).

2. Серия: серия 1 (первая).

3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:

а) эпидемический вирус - А/Токио/3/67 (H2N2);

б) донор аттенуации: A/PR/8/59/M2 (H1N1).

4. Количество пассажей: 5 в процессе реассортации.

5. Характеристика штамма до лиофилизации:

а) оптимальные условия репродукции: 33°С, 48 часов;

б) гемагглютинирующая активность: 1:1024;

в) инфекционная активность: 8.8 lg ЭИД50/0,2 мл;

г) чувствительность к ингибиторам: ингибиторочувствительный в РТГА с нормальной сывороткой крови лошади и морской свинки;

д) разность в показателях инфекционной активности при 33°С / 39°С: 6,9 lg ЭИД50/0,2 мл;

е) разность в показателях инфекционной активности при 33°С / 26°С: 3,2 lg ЭИД50/0,2 мл;

ж) структура генома реассортанта по данным частичного секвенирования генов:

гены от эпидемического вируса: НА, NA;

гены от донора аттенуации: РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS.

6. Антигенная специфичность гемагглютинина:

гемагглютинин в РТГА идентичен вирусу А/Токио/3/67 (H2N2), крысиной антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Антигенная специфичность нейраминидазы:

нейраминидаза идентична вирусу А/Токио/3/67 (H2N2) по данным полного секвенирования генов.

7. Характеристика штамма после лиофилизации:

а) дата лиофилизации - 25 апреля 2011 г.;

б) объем материала в ампуле -1,0 мл;

в) инфекционная активность - 7,5 lg ЭИД50/0.2 мл;

8. Бактериологический контроль: дата учета - 1 июня 2011 года, результат - стерилен.

9. Безвредность для мышей и морских свинок при подкожном и внутрибрюшинном введении: безвреден.

Таблица 1
Нуклеотидные и аминокислотные различия внутренних генов донора аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1) и генов вируса A/PR/8/34 (H1N1), клонированных в векторы для обратной генетики.
Ген нуклеотид Белок аминокислота
позиция 59/11 PR-wt2 позиция 59/11 PR-wt2
РВ2 342 А G РВ2 105 Не Met
779 G А 251 Arg Lys
923 G А 299 Arg Lys
1106 А С 360 Туr Ser
1537 А G 504 llе Val
1660 Т G 545 Leu Val
1916 А G 630 Lys Arg
2132 А G 702 Lys Arg
РВ1 196 G А РВ1 58 Asp Asn
549 С А 175 Asn Lys
639 G А 205 Met He
647 А G 208 Lys Arg
670 А G 216 Ser Gly
1335 С G 437 Cys Trp
294 G А PB1-F2 59 Arg Lys
297 G А 60 Arg Gin
РА 65 С Т РА 14 Ala Val
497 А G 158 Lys Arg
1101 А Т 359 Lys Asn
1672 А С 550 lle Leu
NP 98 G А NP 18 Gly Glu
328 Т С 95 Ser Pro
1102 С G 353 Leu Val
1318 А G 425 lle Val
1334 А С 430 Asn Thr
М 434 А G М1 137 Thr Ala
476 А Т 151 Ser Cys
NS 94 С Т NS1 23 Ala Val
329 С А 71 Asp Glu
575 G А NS2 25 Gly Glu
763 А G 88 lle Val
1донор аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1);
2гены вируса A/PR/8/34 (H1N1), клонированные в векторы для обратной генетики.
Таблица 2
Фенотипическая характеристика нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) и исходного донора A/PR/8/59/1 (H1N1) в сравнении с вирусом «дикого» типа A/PR/8/34 (H1N1)
Вирусы Показатели репродукции в РКЭ ((Ig ЭИД50/мл) Титр вируса (Ig ЭИД50/мл) в легких и носовых ходах мышей Фенотип
RCT26 RCT39 носовые ходы легкие
A/PR/8/34 6,5 1,0 5,3 6,8 non-ca, non-ts, non-att
A/PR/8/59/1 2,8 7,3 3,9 1,5 Ca, ts, att
A/PR/8/59/M2 2,3 6,4 4,3 1,5 Ca, ts, att
Таблица 3
Изучение чувствительности нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) к ремантадину в сравнении с вирусом «дикого» типа A/PR/8/34 (H1N1)
Вирус Титр вируса, Ig TCID50/мл Снижение титра вируса в присутствии ремантадина, Ig TCID50
без ремантадина ремантадин 0,5 мкг/мл ремантадин 5,0 мкг/мл 0,5 мкг/мл 5,0 мкг/мл
A/PR/8/34 8,8 8,6 8,6 0,2 0,2
A/PR/8/59/M2 8,6 6,8 6,3 1,8 2,3

Пример 1. РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ И ЗАЩИТНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ H2N2 В ЭКСПЕРИМЕНТАХ НА МЫШАХ

Иммуногенность вакцинных штаммов H2N2

Иммуногенность вакцинных штаммов A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2) (59/Кал/2211) и A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2) (59/Ток/22111) оценивали путем двукратной иммунизации мышей линии СВА (18 животных в группе) вакцинными штаммами, взятыми в дозах 100 МИД50 и 1000 МИД50 (50%-ных мышиных инфицирующих доз). Контрольные животные получали препарат плацебо (PBS). Забор образцов сывороток крови проводили на 28 день после первой вакцинации, и на 28 день после второй иммунизации. Титры антигемагглютинирующих антител выявляли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В качестве антигенов в РТГА использовали эпидемические вирусы A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67 (H2N2). Из таблицы 4 видно, что иммунизация вакцинными штаммами приводила к формированию гуморальных антител не только против гомологичного вируса, но и против гетерологичного штамма. Иммунизация мышей более высокой дозой 1000 МИД50 вызывала образование достоверно более высоких титров как гомологичных, так и гетерологичных антител. Животные контрольной группы не вырабатывали антитела к вирусам H2N2.

Таблица 4
Иммуногенность вакцинных штаммов H2N2, введенных в дозах 100 МИД50 и 1000 МИД50, в экспериментах на мышах
Вакцинная группа Доза, МИД50 Среднее геометрическое обратных титров антигемагглютинирующих антител в РТГА с антигеном H2N2
A/Калифорния/1/66 A/Токио/3/67
День 28 День 56 День 28 День 56
59/Кал/2211 100 6,8 156,6 5,0 12,3
1000 22,3 255,8 5,0 41,2
59/Ток/22111 100 5,0 20,5 10,2 60,3
1000 6,9 42,5 20,6 122,8
Плацебо - 5,0 5,0 5,0 5,0

Защитная эффективность вакцинных штаммов H2N2

Защитную эффективность вакцинных штаммов A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2) и A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2) оценивали путем экспериментального заражения иммунизированных мышей эпидемическими вирусами A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67 (H2N2), взятыми в дозе 105 ЭИД50. По 9 мышей из каждой вакцинной группы заражали вирусом A/Калифорния/1/66, а оставшиеся 9 - вирусом A/Токио/3/67 (H2N2). На 3 сутки после челленджа у 4 мышей из каждой группы забирали органы: легкие, носовые ходы, мозг, селезенку. Титр вируса в органах мышей определяли путем титрования гомогенатов тканей в развивающихся куриных эмбрионах методом предельных разведений. За оставшимися 5 мышами в группе вели наблюдение, взвешивая каждые 2 дня в течение 14 дней после заражения. Как видно из рисунка 1, иммунизированные более высокой дозой вакцинных штаммов (1000 МИД50) мыши были полностью защищены от размножения как гомологичного, так и гетерологичного «дикого» вируса. Мыши, иммунизированные меньшей дозой 100 МИД50, были полностью защищены от размножения гомологичного вируса, тогда как гетерологичный вирус обнаруживался в легких мышей в незначительных титрах. Данные титры были достоверно ниже таковых у мышей контрольных групп (p<0,001 по критерию Манна-Уитни).

Изучение динамики изменения веса мышей, иммунизированных штаммами A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2) и A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2), также указывает на защитный эффект вакцинации. Как видно из рисунка 2, снижение веса у вакцинированных мышей не превышало 7,5%, тогда как у мышей контрольной группы потеря веса достигала 15-18% на 8-10 сутки после челленджа.

Таким образом, изучение вакцинных штаммов A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2) и A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2), полученных с использованием нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1), доказало их иммуногенность и профилактическую эффективность от болезни, вызванной как гомологичным вирусом, так и гетерологичным H2N2 штаммом.

1. Аттенуированный, холодоадаптированный штамм вируса гриппа, Ortomyxoviridae, род Influenza, A/PR/8/59/M2 (H1N1), депонированный в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под № V-654, являющийся донором аттенуации для получения вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины подтипа A(H2N2).

2. Реассортантный вакцинный штамм вируса гриппа, Ortomyxoviridae, род Influenza, A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2), депонированный в Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского под № 2652, полученный с помощью донора аттенуации по п.1, и используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.

3. Реассортантный вакцинный штамм вируса гриппа, Ortomyxoviridae, род Influenza, A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2), депонированный в Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского под № 2653, полученный с помощью донора аттенуации по п.1 и используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области биотехнологии и касается специфических олигонуклеотидных праймеров. Представленные праймеры включают сайты эндонуклеазного расщепления, фланкирующие участки генома, кодирующие гликопротеины Gn и Gc, а также нуклеопротеин N, для получения библиотеки генов, кодирующих гликопротеины Gn и Gc и нуклеопротеин N вируса лихорадки долины Рифт.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для идентификации гетеромультимерных убиквитинов со способностью связываться с лигандом-антигеном.

Представлены композиция и способ ее получения. Охарактеризованная композиция содержит: эффективное количество вирусного антигена, который представляет собой живой аттенуированный ротавирус, предварительно обработанный 0,1% сывороточным альбумином человека, и фармацевтически приемлемый буфер.

Изобретения касаются инфекционной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей инфекционный вирус Torque teNO свиней (PTTV), которая содержит по меньшей мере одну копию геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, соответствующих генотипам или подтипам PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA и PTTV2c-VA, а также биологически функциональной плазмиды или вирусного вектора, содержащего такую инфекционную нуклеотидную геномную последовательность, и клетки-хозяина, содержащей такую плазмиду или вектор.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа А сем. Picomaviridae, рода Aphtovirus.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии. Объектом изобретения является новый штамм вируса Сендай Sen293nsk1, адаптированный к эффективному размножению в культуре клеток человека НЕК293.
Данное изобретение имеет отношение к таким композициям и фармацевтическим композициям, которые включают поксвирусы, и более конкретно, которые включают внеклеточные оболочечные вирусы.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и касается синтетических олигонуклеотидных праймеров и способа их использования. Предложенный способ выявления и дифференциации генома вакцинного штамма В-82 от полевых изолятов вируса миксомы кроликов включает: выделение ДНК из биологического материала, постановку мультиплексной полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров, комплементарных участкам генов M130R и M151R вируса миксомы кролика и имеющих следующий нуклеотидный состав: амплификацию ДНК вируса и оценку проведения реакции.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и иммунологии. В частности, настоящее изобретение относится к новому птичьему астровирусу; к антителам и их фрагментам, направленным против указанного нового вируса; к антигенным препаратам, белкам и ДНК-молекулам нового птичьего астровируса; к вакцинам на основе указанного нового вируса или к его антигенным препаратам, белку или ДНК; к способам получения таких вакцин и к диагностическим наборам.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Предложен способ получения вирусов гриппа А или В в культуре клеток, и композиция клеточной культуры для получения вирусов гриппа А или В.

Группа изобретений относится к области ветеринарии и биотехнологии. Иммуногенные композиции, которые содержат вирус собачьего гриппа и собачий респираторный коронавирус, а также они могут дополнительно содержать Bordetella bronchiseptica, пертактин, вирус собачьего парагриппа и собачий аденовирус серотипа 2 являются эффективными для лечения или предупреждения комплекса инфекционных респираторных заболеваний собак.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Предложен способ приготовления иммуногенной композиции.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Предложен способ получения вирусоподобных частиц вируса гриппа (ВПЧ) в растении или его части.
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для профилактики гриппа. Для этого совместно однократно вводят цитокин, в качестве которого используют интерферон гамма, и инактивированную противогриппозную вакцину.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается штамма вируса гриппа. Вакцинный штамм В/60/Массачусетс/2012/10 - реассортант, полученный путем скрещивания «дикого» вируса В/Массачусетс/2/2012 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 - донором аттенуации.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается штамма вируса гриппа. Вакцинный штамм А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) - реассортант, полученный путем скрещивания «дикого» вируса А/Индиана/10/2011 (H3N2v) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/13 4/17/57 (H2N2) - донором аттенуации.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается вакцинного штамма вируса гриппа. Охарактеризованный штамм В/60/Висконсин/2010/125 - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса В/Висконсин/1/2010 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 - донором аттенуации.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан реассортантный вирус гриппа.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для производства различных инактивированных вакцин против гриппа. Для этого проводят заражение куриных эмбрионов, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ), очистку ВАЖ методом микрофильтрации.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и биотехнологии. Штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32°С.
Группа изобретений относится к области вирусологии и касается штамма вируса гриппа A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1), используемого в качестве донора аттенуации, а также вакцинных штаммов A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) и A/17/Токио/67/912 (H2N2). Представленные вакцинные штаммы являются реассортантами и получены путем скрещивания эпидемических вирусов A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67(H2N2) соответственно со штаммом A/17/Новая Каледония/99/145 (Н1N1). Представленные штаммы A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) и A/17/Токио/67/912 (H2N2) депонированы в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского под №2650 и 2651 соответственно. Реассортанты унаследовали два гена, кодирующие поверхностные антигены вируса (гемагглютинин и нейраминидазу), от эпидемических вирусов A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67(H2N2) соответственно, и остальные шесть генов, кодирующих негликозилированные белки, от донора аттенуации A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1). Представленные изобретения позволяют получать вакцинные штаммы с последующим их использованием при производстве вакцин для интраназального применения. 3 н.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретения касаются штаммов вируса гриппа APR859M2, AКалифорния166 и AТокио367. Вакцинные штаммы A59M2Калифорния662211 и A59M2Токио6722111 - реассортанты, полученные путем скрещивания эпидемических вирусов AКалифорния166 и АТокио367 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом APR859M2. Штаммы A59M2Калифорния662211 и A59M2Токио6722111 характеризуются температурочувствительностью, холодоадаптированностью, безвредностью и иммуногенностью для лабораторных животных. Реассортанты унаследовали два гена, кодирующие поверхностные антигены вируса, от эпидемического вируса и остальные шесть генов, кодирующие негликозилированные белки, от донора аттенуации APR859M2. Представленные изобретения могут быть использованы при получении живой гриппознойинтраназальной вакцины для взрослых и детей. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 1 пр.

Наверх