Способ подготовки культур сульфидогенных бактерий для выделения днк



Способ подготовки культур сульфидогенных бактерий для выделения днк
Способ подготовки культур сульфидогенных бактерий для выделения днк

 


Владельцы патента RU 2562176:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет" (ТГУ, НИ ТГУ) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ подготовки культур сульфидогенных бактерий для выделения ДНК. В способе используют 15 мл культуральной жидкости. Центрифугируют культуральную жидкость при 1000 об/мин. Проводят трехкратную отмывку клеток фосфатно-солевым буфером в соотношении 10:1. Перемешивают в течение 10 секунд и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Преимуществом изобретения является эффективность выделения ДНК и возможность быстрого и точного проведения последующего молекулярно-биологического анализа. 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к биологии, а именно для проведения подготовки накопительных и чистых культур сульфидогенных бактерий, растущих на жидкой среде, для молекулярно-биологического анализа путем очистки клеточной массы от осадка сульфидов.

Методы молекулярно-биологического анализа на основе ПЦР широко применяют для поиска функциональных генов, кодирующих ферменты микроорганизмов, для оценки биоразнообразия и определения доминирующих групп прокариот в различных экосистемах. Методы молекулярной детекции применяются и для изучения культивируемых микроорганизмов для скрининга накопительных культур и для определения филогенетической принадлежности микроорганизмов, выделенных в чистые культуры.

Накопительные и чистые культуры сульфидогенных бактерий образуют сульфиды железа и микроэлементов, входящих в состав питательной среды для культивирования, а также металлов, вносимых в среду в экспериментальных целях. Сульфиды металлов представляют собой осадок черного цвета. Сульфиды металлов затрудняют выделение ДНК и могут препятствовать эффективному проведению полимеразной цепной реакции. Для эффективного выделения ДНК из небольших объемов культуральной жидкости (15 мл) с целью проведения молекулярно-биологического анализа необходимо максимально очистить клеточную массу от осадка сульфидов.

Известен способ выделения ДНК из сульфатредуцирующих бактерий (СРБ). Процедура включает получение сырой массы клеток массой 3 г, ресуспендирование клеток в буфере для лизиса, с добавлением додецилсульфата натрия, инкубации при повышенной температуре, экстракции с хлороформ-изоамиловым спиртом, осаждением ДНК ацетат-2-пропанолом, и промывку этанолом (T. Hai, D. Lange, R. Rabus, A.Steinbuchel. Polyhydroxyalkanoate (PHA) Accumulation in Sulfate-Reducing Bacteria and Identification of a Class III PHA Synthase (PhaEC) in Desulfococcus multivorans // Applied and environmental microbiology. Aug. 2004, Vol. 70, No. 8, p. 4440-4448).

Наиболее близким по существу является способ выделения ДНК психротолерантных, ацидофильных железоокисляющих бактерий. Для выделения ДНК культуру клеток из культуральной жидкости объемом не менее 100 мл осаждают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 минут. Полученный осадок используют для выделения ДНК: двукратно промывают 10мМ Tris (pH 8,0) и ресуспендируют осадок с 0,5 мл 10мМ Tris, 1мМ буфером EDTA, содержащим 20 мг/мл лизоцима, и инкубируют при 37 °С в течение 30 минут, далее выделяют ДНК с использованием набора Wizard DNA Clean Up System (Promega) (D. Kupka, O.I. Rzhepishevska, M. Dopson, E. B. Lindstrom, O.V. Karnachuk, O.H. Tuovinen. Bacterial oxidation of ferrous iron at low temperatures // Biotechnology and Bioengineering, 2007, Aug 15; 97(6):1470-8).

Недостатком вышеперечисленных способов является необходимость использования больших объемов культуральной жидкости для получения ДНК и проведения молекулярно-биологического анализа (3 г сырой массы, как в прототипе 1, может быть получено только более, чем из 1 л культуры; во втором прототипе использовано 100 мл культуры). Сульфидогенные бактерии демонстрируют низкую урожайность (биомасса обычно не выше 1 г белка на 1 л) и их культивирование в больших объемах связано с техническими трудностями. При выделении ДНК из небольшого объема (15 мл) вышеперечисленными способами количество ДНК низкое и не превышает 2 нг/мкл. Оставшиеся сульфиды металлов могут препятствовать эффективному проведению полимеразной цепной реакции, что осложняется низкой концентрацей ДНК. Кроме того, при применении вышеперечисленных способов для небольших объемов культуральной жидкости (15 мл) сульфидогенных бактерий невозможно полностью очистить клеточную массу от сульфидов металлов, которые мешают проведению молекулярно-биологического анализа.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения очищенной клеточной массы сульфидогенных бактерий для выделения ДНК из небольшого объема культуральной жидкости (15 мл), что обеспечивает высокую эффективность и точность результатов последующего молекулярно-биологического анализа.

Техническим результатом при осуществлении заявленного способа также является возможность быстрого и точного определения филогенетической принадлежности прокариот по последовательности гена 16S рРНК и поиска функциональных генов в чистых и накопительных культурах сульфидогенных бактерий.

Поставленная задача решается тем, что способ получения очищенной клеточной массы сульфидогенных бактерий из небольших объемов культуральной жидкости (15 мл) для молекулярно-биологического анализа включает отделение клеток от питательной среды посредством центрифугирования культуральной жидкости при 10000 об/мин в течение 10 минут с последующей трехкратной отмывкой собранных клеток однократным фосфатно-солевым буфером (1xPBS). Каждая отмывка представляет собой добавление к осадку 1хPBS в соотношении 10:1, перемешивание на приборе Vortex в течение 10 секунд и центрифугирование при 10000 об/мин в течение 10 минут. Отмывка фосфатно-солевым буфером обеспечивает достаточную очистку клеточной массы от сульфидов металлов даже при небольших объемах культуральной жидкости, что очень важно при работе с сульфидогенными бактериями. Полученная клеточная масса бактерий используется для выделения ДНК и последующего молекулярно-биологического анализа.

Предложенный способ можно применять для выделения ДНК из накопительных и чистых культур сульфидогенных бактерий, в том числе промышленных штаммов, использующихся в биотехнологиях осаждения металлов, с последующим молекулярно-биологическим анализом на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Пример осуществления изобретения приведен ниже.

Пример 1.

Для анализа использовали жидкую чистую культуру ацидотолерантных грамположительных сульфидогенных бактерий объемом 15 мл. Предполагалось определение филогенетической принадлежности выделенного микроорганизма путем секвенирования последовательности ПЦР-амплифицированного гена 16S рРНК. Были проведены работы по оценке эффективности выделения ДНК из клеток бактерий, выращенных на стандартной среде Видделя (Widdel, Bak, 1992) без отмывки фосфатно-солевым буфером и с проведением отмывки. Отделение клеток сульфидогенных бактерий от питательной среды проводили посредством центрифугирования культуральной жидкости при 10000 об/мин в течение 10 минут с последующей трехкратной отмывкой собранных клеток однократным фосфатно-солевым буфером (1xPBS). Для отмывки использовали готовый фосфатно-солевой буфер (Invitrogen), pH 7.4. Каждая отмывка представляет собой добавление к осадку 1хPBS в соотношении 10:1, перемешивание на приборе Vortex в течение 10 секунд и центрифугирование при 10000 об/мин в течение 10 минут. ДНК после отмывки клеток выделяли с помощью набора Power Soil DNA isolation kit (MoBio).

Из данных, представленных в таблице 1 (эффективность выделения ДНК из чистой культуры сульфидогенных бактерий и последующей ПЦР без отмывки и с отмывкой фосфатно-солевым буфером (1хPBS)), следует, что без отмывки препарата фосфатно-солевым буфером получение препарата тотальной ДНК из небольшого объема культуры (15 мл) и последующее получение из препарата продуктов ПЦР гена 16S рРНК невозможно. Наилучший результат получен при 3-кратной отмывке препарата фосфатно-солевым буфером.

Пример 2.

Для анализа использовали жидкую накопительную культуру сульфидогенных бактерий из подземной термальной воды объемом 15 мл. Предполагалось определение филогенетической принадлежности доминирующих бактерий в культуре путем секвенирования последовательностей фрагментов гена 16S рРНК, ПЦР-амплифицированных и разделенных в химическом градиенте (ПЦР-ДГГЭ). Провели оценку эффективности выделения ДНК из клеток бактерий, выращенных на стандартной среде Видделя (Widdel, Bak, 1992), без отмывки фосфатно-солевым буфером и с проведением отмывки. Отделение клеток накопительной культуры сульфидогенных бактерий из подземной термальной воды от питательной среды проводили посредством центрифугирования культуральной жидкости при 10000 об/мин в течение 10 минут с последующей трехкратной отмывкой собранных клеток однократным фосфатно-солевым буфером (1xPBS). Каждая отмывка представляет собой добавление к осадку 1хPBS в соотношении 10:1, перемешивание на приборе Vortex в течение 10 секунд и центрифугирование при 10000 об/мин в течение 10 минут. Для отмывки клеток от сульфидов использовали фосфатно-солевой буфер, содержащий 137 мM NaCl, 2.7 мM KCl, 10 мM Na2HPO4 и 1.8 мM KH2PO4, pH 7.4. Геномную ДНК после отмывки клеток выделяли стандартным методом (Wilson, 2004).

Из данных, представленных в таблице 2 (эффективность выделения ДНК из накопительной культуры сульфидогенных бактерий и последующей ПЦР без отмывки и с отмывкой фосфатно-солевым буфером (1хPBS)), следует, что без отмывки клеток фосфатно-солевым буфером получение препарата тотальной ДНК из 15 мл культуральной жидкости и получение из препарата продуктов ПЦР гена 16S рРНК невозможно.

Способ подготовки культур сульфидогенных бактерий для выделения ДНК, включающий центрифугирование культуральной жидкости при 10000 об/мин в течение 10 минут, отличающийся тем, что используют 15 мл культуральной жидкости, после центрифугирования проводят трехкратную отмывку собранных клеток фосфатно-солевым буфером в соотношении 10:1, перемешивают в течение 10 секунд и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут.



 

Похожие патенты:

Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) из клеток штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 включает разрушение клеток дрожжей в буфере с pH 7,4, содержащем 10 мМ Трис, 20 мМ ЭДТА и 0,5 М NaCl, обработку додецилсульфатом натрия в концентрации от 0,5 до 1,0% 20-25 мин при 20°C и хлороформом в концентрации до 25% 20-25 мин при 20°C.

Группа изобретений относится к области биохимии. Заявлены варианты способа скрининга и мониторинга онкологических заболеваний, включающего забор образца ткани, выделение из образца ткани РНК, синтез кДНК, амплификацию методом множественной обратной транскрипции полимеразой цепной реакции с последующим анализом амплифицированных продуктов.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения дрожжевого экстракта, содержащего биологически активную высокополимерную РНК.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения свободного от белка биологически активного препарата высокополимерной РНК из сухих пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу и диагностическому набору для диагностики коклюша и определения авирулентных мутантов возбудителя коклюша.
Изобретение относится к области биохимии. .

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии для получения представляющих практический интерес белков, являющихся продуктами молчащих генов или генов с низким уровнем экспрессии.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу анализа частоты взаимодействия нуклеотидной последовательности-мишени с одной или несколькими представляющими интерес нуклеотидными последовательностями.

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и иммунологии. Предложены способы получения библиотек последовательностей ДНК, кодирующих гомологичные полипептиды, и к применению таких библиотек для идентификации естественно диверсифицированных полипептидных вариантов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантным вакцинам против Candida albicans, и может быть использовано в медицине. Вакцина для лечения или предупреждения кандидозной инфекции содержит выделенный полипептид с SEQ ID NO: 2 в эффективном количестве, который может быть слит с партнером слияния.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ выделения коротких РНК из биологических жидкостей.

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмиду pET40CmAP/CGL, определяющую синтез гибридного бифункционального полипептида CmAP/CGL со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina (СmАР) и галактозоспецифичного лектина мидии Crenomytilus grayanus (CGL).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым гетеромультимерным белкам, полученным из модифицированного убиквитина, и может быть использовано в медицине для лечения или диагностики заболеваний, ассоциированных с гиперпродукцией экстрадомена В фибронектина (ED-B).

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ экстракции ДНК из клеток крови.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для детектирования количества копий бета-глюкуронидазы в трансгенных растениях, включающему проведение полимеразной цепной реакции с помощью праймеров и разрушаемой пробы.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются олигонуклеотидных праймеров и способа выявления ДНК Mycobacterium avium с их использованием. Охарактеризованные олигонуклеотидные праймеры комплементарны специфичной области mig-гена Mycobacterium avium и имеют следующий нуклеотидный состав: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3' и 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA СТС-3'. Способ выявления ДНК Mycobacterium avium выключает выделение ДНК, проведение амплификации ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров, перенос продукта амплификации на гель с последующим детектированием результатов анализа на трансиллюминаторе.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для идентификации гетеромультимерных убиквитинов со способностью связываться с лигандом-антигеном.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу выделения микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы. Способ включает последовательное центрифугирование, ультрафильтрацию и ультрацентрифугирование культуральной конденсированной среды.

Изобретения относятся к области ветеринарной микробиологии и касаются олигонуклеотидных праймеров для идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы D, а также способа с их использованием.
Наверх