Способ изготовления образцов биологических тканей в комплексе с имплантированными элементами для исследования световой микроскопией


 


Владельцы патента RU 2564895:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" (НИИ КПССЗ) (RU)

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для изготовления гистологических образцов биологических тканей с элементами имплантированных металлических и/или полимерных конструкций для изучения с помощью световой микроскопии. Способ заключается в том, что биологический образец последовательно обрабатывают раствором фиксаторов, отмывают, обезвоживают, пропитывают раствором прозрачной смолы для холодной заливки в течение 6-24 часов, погружают в чистую смолу на 12-24 часа и окрашивают красителями на глубину 1-2 мкм. При этом микроскопию последующих слоев выполняют после шлифовки, полировки и повторного окрашивания поверхности образца. Изобретение позволяет проводить послойное исследование образцов без повреждения клеточных компонентов и изменения архитектуры ткани в зоне контакта с инородным телом. 1 ил., 1 пр.

 

Настоящее изобретение относится к медицине и биологии, а именно к технике изготовления гистологических образцов биологических тканей, с элементами имплантированных металлических и/или полимерных конструкций для изучения с помощью световой микроскопии.

На сегодняшний день важной клинической проблемой остается изучение взаимодействия между тканями организма человека и металлическими или синтетическими имплантатами, такими, например, как эндоваскулярные стенты и протезы кровеносных сосудов. Исследование различных видов стентов и протезов, материалов, используемых для их изготовления, лекарственных покрытий и других способов модификации поверхности требует детального гистологического анализа тканей на границе с имплантатом.

Наиболее известный метод подготовки биологических тканей, содержащих металлический компонент, для исследования с помощью световой микроскопии заключается в фиксации материала в формальдегиде/параформальдегиде с последующим удалением металлической конструкции из биологической ткани (Giessen W.J., Serruys P.W., Beusekom H.M. Coronary stenting with a new, radiopaque, balloon-expandable endoprosthesis in pigs. Circulation. 1991; 83:1788-1798). После фиксации материал обезвоживают, заключают в парафин, изготавливают гистологические срезы и окрашивают их. Недостатком данного способа является повреждение биологических тканей в результате механического удаления металлических или полимерных фрагментов имплантата, приводящего к нарушению архитектуры ткани и невозможности оценить клеточные реакции на поверхности материала.

Наиболее близким к заявляемому способу является метод, основанный на фиксации биологического материала в формальдегиде с дальнейшим заключением в смолы на основе метакрилатов и акрила (Major A., Guidoin R., Soulez G. Implant degradation and poor healing after endovascular repair of abdominal aortic aneurysms: an analysis of explanted stent-grafts. J Endovasc Ther. 2006; 13: 457-467). Из образца, заключенного в смолу, с помощью алмазного ножа или высокоточного отрезного станка готовят тонкие срезы толщиной 10-20 мкм, которые тщательно полируют и окрашивают гистологическими красителями.

Основными недостатками данного способа является трудоемкость, сложность получения тонких срезов образцов и необходимость в специальном оборудовании для их изготовления.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность послойного исследования гистологических образцов биологических тканей, с элементами имплантированных металлических и/или полимерных конструкций без повреждения клеточных компонентов и изменения архитектуры ткани в зоне контакта с инородным телом.

Технический результат достигается за счет того, что биологический материал, содержащий металлические и/или полимерные конструкции, обрабатывают раствором фиксаторов, последовательно обезвоживают и погружают в прозрачную смолу для холодной заливки; после получения твердого образца выполняют полировку и окрашивание поверхности исследуемого биологического материала, а исследование образца осуществляют на глубину 1-2 мкм, при этом микроскопию последующих слоев выполняют после шлифовки и повторного окрашивания поверхности образца.

В соответствии с предлагаемым способом образец биологической ткани в комплексе с металлической и/или полимерной конструкцией фиксируют в любом из известных химических фиксаторов: альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид), хромовая кислота, спирты (этанол, метанол), ацетон, соли ртути (сулема), кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная). После фиксации образцы отмывают в течение 0,5-1 часа в фосфатно-солевом буфере и далее проводят их обезвоживание с помощью этилового спирта. Для чего гистологические образцы помещают последовательно в растворы этилового спирта с возрастающей концентрацией от 30% до 100% на время 1-24 часов в каждой порции. Кроме этанола для обезвоживания может быть применен безводный ацетон, изопропанол, диоксан, глицерин. После обезвоживания материал помещают на 1-3 часа в растворитель (ацетон, окись пропилена, 1,2-эпоксипропан).

После обезвоживания материал погружают в прозрачную смолу для холодной заливки, в качестве которой может быть использована эпоксидная, акриловая или полиэфирная смолы. Перед тем как поместить образец в смолу осуществляют его пропитывание раствором, содержащим смолу и растворитель в соотношении 1:1 на 6-24 часов. После чего образец пропитывают чистой смолой в течение 12-24 часов и далее проводят ее полимеризацию.

Полученный твердый образец, заключенный в смолу, шлифуют и полируют до поверхности биологического материла, которую необходимо исследовать. Окраску препарата выполняют щелочными растворами метиленового синего, толуидинового синего, азура II и другими. При этом происходит окрашивание только поверхностного слоя на глубину 1-2 мкм.

Для дифференциальной окраски спиртовыми красителями, например гематоксилин и эозин, предварительно осуществляют травление верхнего слоя препарата насыщенным раствором гидроксида натрия в этиловом спирте. После чего выполняют отмывку от щелочи и окрашивают образец по стандартному протоколу.

Полученный окрашенный препарат исследуют с помощью световой микроскопии в проходящем и в отраженном свете с использованием люминесценции и без нее. При необходимости дальнейшего изучения более глубоких слоев материала образец шлифуют до нужной глубины, после чего выполняют полировку и повторное окрашивание поверхностного слоя образца.

Технический результат предлагаемого изобретения поясняет изображение, где на фиг. 1 - представлен гистологический образец биологической ткани, извлеченный из легочной артерии, содержащий металлические стойки эндоваскулярного стента при окрашивании метиленовым синим с увеличением световой микроскопии × 200. На изображении отмечены: 1 - материал стента; 2 - грануляционная соединительная ткань, содержащая отдельные макрофаги, фибробласты и гигантские многоядерные клетки инородных тел; 3 - зрелые волокна соединительной ткани, образующие фиброзную капсулу.

Пример 1.

Эндоваскулярный стент с участками нативной ткани был извлечен из легочной артерии при проведении реоперации. Материал фиксировали в забуференном формалине в течение двух суток, после чего отмывали дважды по 30 минут в фосфатно-солевом буфере. Для обезвоживания материала осуществляли его проводку в растворах этилового спирта следующим образом:

1. 30% этиловый спирт - 2 раза по 30 минут.

2. 50% этиловый спирт - 2 раза по 30 минут.

3. 70% этиловый спирт - 2 раза по 40 минут.

4. 80% этиловый спирт - 2 раза по 60 минут.

5. 95% этиловый спирт - 60 минут, затем еще 120 минут.

6. 100% этиловый спирт - 2 раза по 60 минут.

После обезвоживания образец помещали в 100% ацетон - 2 раза по 60 минут, и далее еще на 120 минут. Затем образец выдерживали в смеси ацетона и смолы в соотношении 1:1 в течение 12 часов, а после этого в чистой смоле под вакуумом для полного пропитывания - 6 часов. Пропитанные кусочки материала помещали в специальные формы, заливали смолой и выдерживали 12 часов при комнатной температуре, далее проводили полимеризацию смолы при температуре 60°C до полного застывания.

Дальнейшую обработку осуществляли на шлифовально-полировальном станке с использованием шлифовальных дисков в следующем порядке: 1200, 1000 и 800. Для полировки последовательно использовали сукно различной упругости в комбинации с суспензиями, содержащими монокристаллические алмазы:

1. Шерстяное сукно с 9 мкм алмазной суспензией.

2. Шелковое сукно с 6 мкм алмазной суспензией.

3. Бархатное сукно с лубрикантом.

Для проведения окраски готовили краситель: 0,5% раствор метиленового синего в 0,5% водном растворе тетрабората натрия. Отполированный образец помещали в краситель на 7 минут при 60°C, после чего отмывали водой, высушивали и изучали светом на микроскопе в проходящем и отраженном свете с люминесценцией.

При микроскопическом исследовании было обнаружено образование фиброзной капсулы вокруг металлических стоек стента. В окружающих тканях наблюдали умеренную воспалительную инфильтрацию мононуклеарными клетками, а также фибробласты и отдельные гигантские многоядерные клетки инородных тел. Кроме того, были выявлены небольшие участки неоинтимы и организованного тромба.

Таким образом, предлагаемый метод подготовки биологического материала позволяет изучать морфологию и клеточный состав тканей, контактирующих с металлическими и полимерными конструкциям, без механического нарушения целостности комплекса ткань-имплантат.

Способ изготовления образцов биологических тканей в комплексе с имплантированными элементами для исследования световой микроскопией, включающий последовательную фиксацию, отмывание и обезвоживание биологического образца с последующим пропитыванием его раствором прозрачной смолы для холодной заливки в течение 6-24 часов и погружением в чистую смолу на 12-24 часа, а также окрашивание красителями, отличающийся тем, что окрашивание образца осуществляют на глубину 1-2 мкм, а исследование материала выполняют послойно без подготовки срезов, для чего проводят шлифовку поверхности на нужную глубину, полировку и повторное окрашивание образца.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для оценки повышенной чувствительности крупного рогатого скота к лейкозной инфекции. Способ включает выделение нейтрофильных гранулоцитов из венозной крови крупного рогатого скота путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см3), внесение по 100 мкл клеточной взвеси в две параллельные лунки 96 луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу определения адаптационной способности пациента с новообразованиями челюстно-лицевой области к съемным пластиночным конструкциям ортопедических протезов.

Группа изобретений относится к медицине, онкологии и касается формирования плана индивидуальной терапии пациента. Способ включает формирование исходного плана терапии с помощью вероятностной модели осложнения здоровой ткани (NTCP) и вероятностной модели подавления опухоли (TCP) целевой области.
Изобретение относится к медицине, а именно к оториноларингологии, и может быть использовано для лечения больных риносинуситом с болевым симптомом. Для этого в сыворотке крови больного до начала лечения определяют уровень субстанции Р.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу определения адаптационной способности пациента с новообразованиями челюстно-лицевой области к съемным пластиночным конструкциям ортопедических протезов.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы. Для этого проводят измерение и оценку внутриглазного давления, исследование полей зрения и слезной жидкости с последующим определением уровня провоспалительных и противоспалительных цитокинов с дополнительным определением их уровня в сыворотке крови.

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и описывает способ диагностики муковисцидоза. Способ характеризуется тем, что определяют концентрации Na, В и Pb в пробоподготовленных волосах детей раннего возраста методами атомной эмиссионной спектрометрии с индукционно связанной аргоновой плазмой и/или масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой, при этом у больных муковисцидозом относительно контрольной группы увеличивается содержание Na и В соответственно в 8,5; 3,3 раза и уменьшается содержание Pb в 1,3 раза.

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для снижения токсического эффекта энрофлоксацина на опсонофагоцитарную активность нейтрофилов с применением гомеопатических препаратов in vitro.

Группа изобретений относится к области экспериментальной биологии и медицины для приготовления тотальных препаратов биологических тканей для оптической проекционной томографии, конфокальной, мультифотонной и светоплоскостной микроскопии и может быть использована для предклинических испытаний фармакологических препаратов и оценки физиологических воздействий на организм, а также для работы с материалом биопсий в диагностических и исследовательских целях.

Изобретение относится к области медицины и касается способов прогнозирования достижения ПМР у больных ТНР молочной железы. Проводят иммунногистохимическое исследование ткани опухоли.

Изобретение относится к медицине и описывает способы для определения концентрации аналита в пробе, приборы и системы, используемые в связи с ними. В одном из вариантов осуществления изобретения способ включает обнаружение содержащей аналит пробы, введенной в электрохимический сенсор, содержащий два электрода в разнесенной конфигурации; реагирование аналита с вызыванием физического превращения аналита между двумя электродами; измерение выходов тока на дискретных интервалах для выведения времени заполнения сенсора пробой и емкости сенсора с пробой; определение первого значения концентрации аналита по выходам тока; расчет второго значения концентрации аналита по выходам тока и первому значению концентрации аналита; корректировку второго значения концентрации аналита на влияния температуры для обеспечения третьего значения концентрации аналита; корректировку третьего значения концентрации аналита как функции времени заполнения сенсора для обеспечения четвертого значения концентрации аналита; и корректировку четвертого значения концентрации аналита как функции емкости для обеспечения конечного значения концентрации аналита. Изобретение обеспечивает более точное определение концентрации аналита в пробе. 7 н. и 66 з.п. ф-лы, 21 ил., 6 пр., 4 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики функциональной задержки полового развития у мальчиков-подростков. Сущность способа состоит в том, что предварительно у ребенка определяют росто-весовой индекс (РВИ), если его значение менее 340 отн.ед., дополнительно атомно-абсорбционным методом определяют в суточной моче концентрации цинка, селена, свинца и вычисляют соотношения концентраций пар свинец/цинк, свинец/селен. Если индекс соотношения превышает не менее чем в 2 раза установленные нормативы, то диагностируют у данного мальчика-подростка задержку полового развития полимикроэлементозного генеза. У мальчиков с росто-весовым индексом более 400 отн.ед. определяют концентрацию хрома в моче и если его уровень не менее чем в 2 раза ниже установленного норматива, диагностируют задержку полового развития мономикроэлементозной этиологии. Использование заявленного способа позволяет повысить точность и достоверность диагностики функциональной задержки полового развития у мальчиков-подростков с ранним его выявлением. 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для прогнозирования органоспецифической аутоиммунизации при воспалительных заболеваниях глаз. Во влаге передней камеры глаза определяют концентрацию трансформирующего ростового фактора бета1 (TGFβ1). При ее уровне менее 1000 пг/мл прогнозируют органоспецифическую аутоиммунизацию. Использование изобретения обеспечивает раннее выявление аутоиммунного компонента или процесса при воспалительных заболеваниях глаз с повышением точности диагностики и выбора адекватной тактики лечения. 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ прогнозирования эффективности комбинированной терапии ХГС у детей, включающий исследование абсолютного количества нейтрофилов крови, отличающийся тем, что до начала терапии определяют исходный уровень абсолютного количества нейтрофилов, при этом уровень 2000-3400/мкл считают положительным предиктором получения первичной вирусологической ремиссии, а уровень, превышающий 3500/мкл, расценивают как отрицательный предиктор получения ремиссии; в динамике через 12 и 24 недели от начала комбинированной терапии определяют уровень абсолютного количества нейтрофилов, и при уровне нейтрофилов ≤1400/мкл делают вывод о положительном прогнозе эффективности терапии, а при уровне абсолютного числа нейтрофилов ≥2500/мкл достижение первичной вирусологической ремиссии маловероятно. Использование изобретения позволяет прогнозировать эффективность комбинированной терапии ХГС пегилированным IFNα-2b и рибавирином у детей и дает возможность избежать длительного нерационального лечения, предотвратить развитие осложнений. 2 ил., 2 табл., 3 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно кардиологии. Оценивают обширность поражения миокарда, нарушение сердечной проводимости, признаки хронической сердечной недостаточности, уровень гликемии, мочевины в крови и артериальное систолическое давление при поступлении, и рассчитывают вероятность благоприятного или неблагоприятного прогноза (Р) по формуле. При величине Р≥0,6 прогнозируют благоприятный исход инфаркта миокарда (ИМ), а при Р<0,4 - неблагоприятный исход. Способ позволяет с высокой вероятностью сделать прогноз исхода ИМ у больных сахарным диабетом 2 на госпитальном этапе, является более простым и доступным, так как включает 6 наиболее значимых показателей для пациентов с сахарным диабетом 2 типа. 3 табл., 3 пр.

Изобретение относится к ветеринарии и предназначено для оценки степени нарушения рубцового пищеварения у жвачных животных. Определяют в содержимом рубца количество веществ, имеющих «средний» (500-5000 D) диапазон молекулярной массы. На клинически здоровое состояние животных указывает уровень содержания средних молекул (ССМ) в рубцовой жидкости, определяемый на волне 237 нм - менее 2,0 усл. ед., на волне 254 нм - менее 1,0 усл. ед., на волне 280 нм - менее 1,0 усл. ед. О наличии патологии рубцового пищеварения свидетельствует увеличение ССМ на волне 237 нм более 2,0 усл. ед., на 254 нм более 1,0 усл. ед. и на 280 нм более 1,0 усл. ед. Способ позволяет выявлять патологию на ранних этапах развития, а у больных - оценивать степень нарушения рубцового пищеварения и эффективность проводимого лечения. 4 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к оториноларингологии, и может быть использовано при выборе тактики лечения гипертрофии глоточной миндалины и хронического аденоидита. Проводят комплексное обследование больного ребенка: сбор жалоб, фибровидеоэндоскопию носа, носоглотки и гортани, тимпанометрию. Проводят потенциометрическое исследование антиоксидант/окислительной активности кожи (АОА/ОА) на внутренней стороне предплечья пациента. При значении АОА/ОА кожи 2,5-4,0*105 М-экв и больше и при наличии у пациента трех из следующих результатов: наличия улучшения от ранее проведенного консервативного лечения, длительности храпа и сопения во сне до трех месяцев, отсутствия синдрома обструктивного апноэ сна, снижении слуха до трех месяцев, отсутствии рецидивирующих острых средних отитов в последние три месяца в анамнезе, гипертрофии глоточной миндалины II-III степени, тимпанометрии - тип А, В, С, типе тимпанометрии В длительностью до 3 месяцев, пациенту проводят консервативный курс лечения. При значении АОА/ОА кожи менее 2,5-4,0*105 М-экв и при наличии у пациента трех из следующих результатов: неэффективность минимум двух курсов консервативного лечения, длительности храпа и сопения во сне более трех месяцев, наличии синдрома обструктивного апноэ сна, снижении слуха более трех месяцев в анамнезе, либо рецидивирующих острых средних отитах в последние три месяца в анамнезе, гипертрофии глоточной миндалины II-III степени, тимпанометрии - тип В, длительностью более 3 месяцев, пациенту проводят аденотомию. Способ позволяет провести диагностику неинвазивно, быстро, объективно, своевременно начать лечение за счет комплексного обследования пациентов, проведения потенциометрического исследования АОА/ОА кожи. 4 ил., 3 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу оценки эффективности лечения острого герпетического стоматита. Сущность способа состоит в том, что в ротовой жидкости ребенка спектрофотометрически определяют величину содержания меди и кальция и при соотношении величины содержания меди к величине содержания кальция свыше 45 лечение считают эффективным. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность лечения острого герпетического стоматита у детей по биохимическому анализу ротовой жидкости. 5 пр.

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ подготовки биоматериала для ПЦР диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС). Осуществляют взятие образцов крови животного. Для подготовки к ПЦР диагностике используют образцы биоматериала в виде клеточной культуры СС81, культивированной на среде Игла MEM в виде многоядерных клеточных образований - синтициев. В качестве отрицательного контроля используют лейкоциты от животного, отрицательного по ВЛ КРС, а также незараженную культуру. Достигается повышение точности выявления ВЛ КРС с помощью ПЦР за счет особенностей клеточной линии фибробластов легкого кошки СС81 формировать синцитий при наличии в образцах вируса. 2 ил., 1 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики возникновения рестеноза в ранее стентированном сегменте. Сущность способа состоит в том, что исследуют кровь пациентов, определяют уровень циркулирующих СD45+ и при показателе, равном 0,91% и более от общего числа тромбоцитов, судят о наличии рестеноза. Использование заявленного способа позволяет повысить точность диагностики возникновения рестеноза. 2 пр.
Наверх