Способ диагностики туберкулеза и дифференциальной диагностики туберкулеза и латентной туберкулезной инфекции

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ диагностики туберкулеза, заключающийся в том, что выделяют мононуклеарные клетки периферической крови, культивируют их в питательной среде, получают образец супернатанта культуры мононуклеарных клеток периферической крови и проводят иммуноферментный анализ (ИФА), при этом перед проведением ИФА в лунки отрицательного контроля вносят питательную среду для культивирования клеток, а в лунки положительного контроля вносят сыворотку крови больного туберкулезом, заведомо содержащую анти-Mtb IgG и анти-Mtb IgA и разведенную 1:100, при ИФА используют в качестве сорбента раствор антигенов Mtb и определяют оптическую плотность образца супернатанта культуры мононуклеарных клеток периферической крови испытуемых ОП^обр, образца отрицательного контроля К^- и образца положительного контроля К⁺, после чего определяют критическое значение оптической плотности из соотношения ОП^кр=К^-+0,1 и при значениях ОП^обр>ОП^кр и К⁺>ОП^кр устанавливают диагноз активный туберкулез, при значениях ОП^обр<ОП^кр и К⁺>ОП^кр устанавливают отсутствие туберкулезной инфекции или латентную туберкулезную инфекцию, а при значениях К⁺<ОП^кр и любых значениях ОП^обр результат анализа считают недостоверным. Изобретение обеспечивает повышение эффективности диагностики туберкулеза при одновременном расширении области применения способа и для дифференциальной диагностики туберкулеза, и латентной инфекции. 6 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для диагностики туберкулеза.

Во всем мире туберкулез является ведущей причиной заболеваемости и смертности от инфекционных заболеваний. В настоящее время треть населения Земли латентно инфицирована микобактериями туберкулеза (M. tuberculosis - Mtb) (ВОЗ, 2008). В 2012 году по данным ВОЗ зафиксировано 8,6 миллионов случаев туберкулеза, число смертей от туберкулеза и его осложнений за 2012 год составило 1,3 миллиона: 320 тысяч среди ВИЧ-инфицированных лиц и 980 тысяч среди ВИЧ-негативных пациентов (WHO, Global tuberculosis report 2013). В России смертность от туберкулеза составляет 14,2 на 100.000 населения (WHO, Global tuberculosis report 2013). По данным Росстата с января по декабрь 2012 года причиной 56,7% всех случаев смерти от инфекционных и паразитарных болезней стал туберкулез и его осложнения.

Несмотря на все усилия по контролю над заболеваемостью туберкулезом, подтверждение диагноза методами с доказанной эффективностью получают лишь 30% больных туберкулезом, только 2,6 млн случаев ТБ из 8,7 млн подтверждены бактериоскопически (WHO, Global tuberculosis report 2012). Таким образом, разработка методов диагностики туберкулеза и дифференциальной диагностики латентной туберкулезной инфекции (ЛТИ) является приоритетной задачей.

Для диагностики и мониторинга туберкулеза (ТБ) в настоящее время используются клинические, микробиологические, молекулярно-генетические и лучевые методы исследования. Однако каждый из этих подходов имеет свои ограничения.

Основным способом диагностики ТБ является идентификация микобактерий в мокроте с помощью микробиологических (мазок, посев, ВАСТЕС) или молекулярно-генетических (ПЦР) методов [Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. / Под ред. А.А.Воробьева. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. - 671 с.]. Недостатком способа является его относительно низкая эффективность для диагностики ТБ у пациентов с ограниченными процессами в легочной ткани без деструкции, а также при внелегочной локализации ТБ. При этом отрицательный результат бактериоскопии и (или) посева не может служить показателем отсутствия ТБ инфекции или ее низкой активности.

К существенным недостатками микробиологических методов следует также отнести трудоемкость и длительность проведения лабораторных исследований. Окончательный результат посева можно получить только через 5-6 недель, даже ускоренный способ бактериологической диагностики туберкулеза по методу Прайса позволяет идентифицировать Mtb только через 7-14 дней.

Лучевые методы исследования, особенно компьютерная томография, дают наиболее адекватную информацию о патологических процессах в легочной ткани. Однако компьютерная томография не всегда позволяет однозначно определить активность процесса и дифференцировать ТБ, пневмонии нетуберкулезной этиологии, опухолевые процессы и ряд других заболеваний. Помимо высокой стоимости рентгенологического обследования его нельзя назвать абсолютно безопасным, вследствие воздействия ионизирующего излучения на организм обследуемого.

Клинический метод диагностики зачастую затруднен, так как симптомы ТБ не носят специфического характера, а их отсутствие не может служить показателем отсутствия активного ТБ процесса.

В связи с этим в последние годы большое внимание уделяется поиску и разработке иммунологических методов, которые в связи с высокой специфичностью иммунного ответа должны позволить проводить диагностику ТБ.

Наиболее распространенным иммунологическим методом выявления и диагностики ТБ является туберкулиновая проба (тест TST). Результаты постановки внутрикожных проб учитывают уже через 72 часа, однако данный подход преимущественно выявляет инфицированность М. tuberculosis (Mtb), а не активный туберкулезный процесс, поэтому в странах с высоким распространением ТБ, где имеется высокий процент инфицированности населения Mtb, вероятность получения ложноположительного результата достаточно высока, в связи с чем ВОЗ не рекомендует его использование для диагностики туберкулеза (WHO. Use of tuberculosis interferon-gamma release assays (IGRAs) in low- and middle-income countries: Policy statement, 2011). Таким же ограничением обладают и разработанный недавно в России тест Диаскинтест (RU 2360926 С9, С07К 19/00, 01.2006), а также «интерфероновые» тесты (QuantiFERON-TB® gold-in tube (Cellestis Limited Chadstone, Австралия) и T-SPOT.TB (US 20100279324)).

Все указанные тесты основаны на регистрации ответа Т-лимфоцитов на стимуляцию антигенами микобактерий. В провокационном Диаскинтесте антигены ESAT-6 и CFP-10 вводятся подкожно; в «интерфероновых» тестах антигены (ESAT-6, CFP-10, ТВ 7.7) добавляются к клеткам крови in vitro, после чего производится оценка уровня продукции интерферона-гамма (тест QuantiFERON-TB® Gold-in tube) или определение частоты интерферон-гамма продуцирующих клеток (тест T-SPOT.TB). Основным недостатком данных подходов является невозможность проведения дифференциальной диагностики ТБ и латентной туберкулезной инфекции (ЛТИ). В 2011 г. ВОЗ пришла к заключению, что «интерфероновые тесты» не могут быть использованы для диагностики ТБ в странах с низким и средним уровнем дохода на душу населения (к числу которых относится Российская Федерация) в связи с широким распространением латентной туберкулезной инфекции в этих странах (WHO. Use of tuberculosis interferon-gamma release assays (IGRAs) in low- and middle-income countries: Policy statement, 2011).

Среди недавно разработанных способов диагностики туберкулеза следует упомянуть метод, в котором проводят инкубацию цельной крови пациента с микобактериальными антигенами, представляющими собой смесь белков ESAT-6, CFP-10, ТВ 7.7, центрифугирование пробы с отделением плазмы и определение в супернатантах содержания антигениндуцированного гамма-интерферона (IFN^γ), антигениндуцированного интерлейкина-6 (IL-6) и спонтанной продукции трансформирующего ростового фактора-^α (TGF^α), причем при уровне IFN^γ≥6,4 МЕ/мл, или IL-6≥2039 пг/мл, или TGF^α≥17,0 пг/мл констатируют активную туберкулезную инфекцию, при значениях ниже пороговых по всем трем показателям - латентную инфекцию [RU 2503005, C1, G01N 33/53, 27.12.2013]. Недостатком способа является его относительно высокая сложность и необходимость проведения валидационных исследований.

Известен также способ диагностики туберкулеза [RU 2285263 С1, G01N 33/577, 10.10.2006], согласно которому исследуют слюну путем проведения иммуноферментного анализа, при котором используют микобактериальный антиген, специфически связывающийся только с секреторным иммуноглобулином A (sIgA) человека, и специфические моноклональные антитела, направленные против sIgA человека. Недостатком способа является его относительно низкая эффективность.

Широко используются для диагностики туберкулеза серологические тесты, основанные на определении уровня анти-Mtb IgG, IgA и IgM антител в сыворотке или плазме крови методом иммуноферментного анализа (ИФА), что по замыслу создателей, позволяет по пороговому уровню определить наличие в организме туберкулезной инфекции.

Основным ограничением серологической диагностики является высокая вероятность ложноположительного результата, т.е. низкая специфичность тестов (в частности, положительные результаты отмечаются у ряда здоровых доноров, латентно инфицированных лиц и лиц, переболевших туберкулезом). Одной из возможных причин низкой специфичности серологических тестов является поддержание высокого уровня анамнестических анти-Mtb антител после перенесенной ТБ инфекции или латентного инфицирования за счет синтеза иммуноглобулинов долгоживущими плазматическими клетками в костном мозге [Pereira Arias-Bouda L.M., Kuijper S., Van Der Werf A., Nguyen L.N, Jansen H.M., Kolk A.H. Changes in Avidity and Level of Immunoglobulin G Antibodies to Mycobacterium tuberculosis in Sera of Patients Undergoing Treatment for Pulmonary Tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 2003 July; 10(4): 702-709. doi: 10.1128/CDLI. 10.4.702-709.2003]. Помимо невысокой специфичности в рандомизированных контролируемых исследованиях серологическая диагностика показала неудовлетворительную чувствительность. В связи с этими ВОЗ в 2011 г. рекомендовала не использовать серологические методы в диагностике туберкулеза (WHO. Commercial serodiagnostic tests for diagnosis of tuberculosis: policy statement. 2011).

Наиболее близким по своей сущности к методу, разрабатываемому в настоящем изобретении, является способ диагностики туберкулеза [Raqib R et al. (Raqib R., Rahman J., Kamaliddin A.K.M., Kamal S.M.M., Banu F.A., Ahmed S., Rahim Z., Bardhan P.K., Andersson J., Sach D. Rapid Diagnosis of Active Tuberculosis by Detecting Antibodies from Lymphocyte Secretions. J Infect Dis 2003; 188(3): 364-370.], в соответствии с которым выделяют мононуклеары периферической крови (МНК), культивируют клетки в питательной среде, а затем проводят детекцию IgG антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), при этом в качестве сорбированного на твердой фазе антигена используют вакцинный штамм M. bovis - бациллу Кальметта-Герена (BCG) [US 7638271 В2, А61К 39/04, 29.12.2009]. Критическая оптическая плотность (ОП^кр) - пороговая величина оптической плотности образца супернатанта культуры МНК в ИФА, выше которой образец признается положительным, была определена Raqib et al. по построению операционной характеристической кривой (ROC-кривой) и равнялась для всех исследований 0,42 единицы оптической плотности (ОП).

Недостатком наиболее близкого технического решения является его относительно низкая эффективность, поскольку, хотя чувствительность предложенного способа достигала 92,5%, однако специфичность не превышала 80%, т.е. у 20% людей, не имеющих туберкулеза, определялась ложноположительная секреция анти-BCG IgG (в группу входили люди с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии, а также здоровые доноры).

Кроме того, наиболее близкое техническое решение обладает относительно узкой областью применения, поскольку при возможности его использования для диагностики туберкулеза оно не используется для дифференциальной диагностики туберкулеза и латентной инфекции.

В последующих работах авторы исследовали секрецию анти-BCG IgG антител у здоровых лиц, находящихся в контакте с больными ТБ. Из 42 обследованных положительные результаты теста были выявлены у 13 человек. При этом у 6 из них в последствии развился туберкулез легких, а у 7 (16%) заболевание туберкулезом не было выявлено по крайней мере в течение 10 месяцев (время наблюдения) [Raqib R, Kamal SM, Rahman MJ, Rahim Z, Banu S, Bardhan PK, Chowdhury F, Ara G, Zaman K, Breiman RF, Andersson J, Sack DA. Use of antibodies in lymphocyte secretions for detection of subclinical tuberculosis infection in asymptomatic contacts. Clin Diagn Lab Immunol. Nov 2004; 11(6): 1022-1027]. Одной из возможных причин положительных результатов секреции антител у людей, не имеющих заболевание туберкулеза, является использование в качестве антигена в ИФА (сорбента) вакцинного штамма M. bovis - BCG. Хотя в валидационных исследованиях использование в качестве сорбента BCG показало хорошую чувствительность и специфичность (90% и 88% соответственно), попытки авторов повысить специфичность диагностики путем применения в качестве иммуносорбента белков M.tuberculosis (PPD, LAM, ТВ 15.3, ТВ51А, CFP10-ESAT-6-A, CFP, CW) приводила к снижению чувствительности (89-82%) и не увеличивала специфичность (87-83%) [Rekha R.S., Mostafa Kamal S.M., Andersen P., Rahim Z., Hoq M.I., Ara G., Andersson J., Sack D., Raqib R. Validation of the ASL Assay in Adult Patients with Culture Confirmed Pulmonary Tuberculosis. Plos One. Jan 2011; 6(1): el6425].

Таким образом, способ, описанный Raquib R. et al., позволяет выявлять острую туберкулезную инфекцию при анализе небольшого образца крови. Ограничениями способа являются: а) детекция исключительно секреции IgG, что может приводить к снижению чувствительности, поскольку часть активированных циркулирующих В-лимфоцитов могут являться предшественниками клеток-продуцентов других классов Ig (например, IgA-продуценты); б) использование в качестве сорбента BCG (при использовании других сорбентов, более специфичных для Mtb, чувствительность и специфичность становились ниже).

Задачей, на решение которой направлено предложенное изобретение, является повышение эффективности диагностики туберкулеза при одновременном расширении области применения способа путем реализации возможности его использования для дифференциальной диагностики туберкулеза и латентной инфекции.

Требуемый технический результат, достигаемый при реализации предложенного способа, заключается в повышении эффективности диагностики туберкулеза при одновременном расширении области применения способа путем введения дополнительных операций способа, позволяющих реализовать возможность его использования одновременно и для дифференциальной диагностики туберкулеза, и латентной инфекции.

Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается, тем, что в способе диагностики туберкулеза, заключающемся в том, что выделяют мононуклеарные клетки периферической крови, культивируют их в питательной среде, получают образец супернатента культуры мононуклеарных клеток периферической крови и проводят иммуноферментный анализ, согласно изобретению перед проведением иммуноферментного анализа в лунки отрицательного контроля вносят питательную среду для культивирования клеток, в лунки положительного контроля вносят сыворотку крови больного туберкулезом, заведомо содержащую анти-Mtb IgG и анти-Mtb IgA и разведенную 1:100, а при иммуноферментном анализе используют в качестве сорбента раствор антигенов Mtb и определяют оптическую плотность образца супернатента культуры мононуклеарных клеток периферической крови испытуемых ОП^обр, образца отрицательного контроля К^- и образца положительного контроля К⁺, после чего определяют критическое значение оптической плотности из соотношения ОП^кр=К^-+0,1 и при значениях ОП°^бр>ОП^кр и К⁺>ОП^кр устанавливают диагноз активный туберкулез, при значениях ОП^обр<ОП^кр и К⁺>ОП^кр устанавливают отсутствие туберкулезной инфекции или латентную туберкулезную инфекцию, а при значениях К⁺<ОП^кр и любых значениях ОП^обр результат анализа считают недостоверным.

В отличие от способа, выбранного в качестве прототипа, в предложенном определяют уровень как специфичных awm-Mtb антител IgG, так и IgA, а при проведении ИФА в качестве сорбента используют раствор антигенов M.tuberculosis - Mtb, содержащий другой (по сравнению с BCG, PPD, LAM, ТВ 15.3, ТВ51А, CFP10-ESAT-6-A, CFP, CW, использованными в способе-прототипе) набор антигенов микобактерий.

Кроме того, в отличие от прототипа для оценки результатов теста используют «критическую оптическую плотность» (ОП^кр), которая определяется как показатель оптической плотности образца отрицательного контроля ОП^- плюс 0,1 (ОП^кр=ОП^-+0,1) и рассчитывается каждый раз при постановке теста.

Изобретение основано на выявлении того факта, что в культуре мононуклеарных клеток (МНК), содержащих в том числе В-лимфоциты и плазматические клетки, происходит спонтанная продукция антител, специфичных по отношению к активировавшему их внутриорганизменному антигену. Ранее возможность детекции спонтанной продукции специфичных антител в культуре МНК была показана в случае первичной инфекции -токсоплазмоза [Vendrell J Р, Pratlong F, Decoster A, Boulot P, Conge A M, Darcy F, Segondy M, Huguet M F, Serre A. Secretion of Toxoplasma gondii-specific antibody in vitro by peripheral blood mononuclear cells as a new marker of acute toxoplasmosis. Clin Exp Immunol. 1992 July; 89(1): 126-130].

В проведенных ранее исследованиях предлагаемый подход позволил диагностировать вторичную инфекцию, вызванную вирусом ветряной оспы и опоясывающего лишая (herpes zoster), а также провести дифференциальную диагностику острой и латентной инфекции этого возбудителя, которая сопровождается циркуляцией специфичных антител в крови [Казанова А.С., Лавров В.Ф., Кузин С.Н., Кузина Л.Е. Новый метод диагностики инфекции, возникающей вследствие реактивации вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2012. - №4 (65). - С. 57-62].

Пример осуществления предложенного способа диагностики туберкулеза.

У пациентов с подозрением на туберкулез методом ИФА в супернатанте культуры МНК определяют уровень анти-Mtb IgG и IgA антител, продукция которых происходит спонтанно (без дополнительной стимуляции МНК антигенами микобактерий). Для этого у пациента берут венозную кровь натощак в объеме 8-9 мл в пробирку, содержащую антикоагулянт - гепарин натрия. Из разведенной фосфатно-солевым буферным раствором крови на градиенте плотности (р=1077) выделяют МНК. Отбирают лимфоцитарное кольцо, переносят его в другую пробирку, разводят в фосфатно-солевом буферном растворе и осаждают клетки центрифугированием. Удаляют надосадочную жидкость и повторяют промывку МНК еще 2 раза на холоде. Далее клетки в течение 48 часов инкубируют при 37°C, 0,5% СО₂ в полной питательной среде RPMI с добавлением L-глутамина, пенициллина/стрептамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Затем клетки осаждают цетрифугированием, а полученный супернатант анализируют на наличие анти-Mtb IgG и IgA с помощью ИФА. Для проведения ИФА в лунки полистиролового планшета вносят раствор антигенов Mtb и инкубируют при 37°C в течение 12 часов. Затем лунки планшета трижды отмывают и вносят в них исследуемые образцы супернатантов (в две лунки). В лунки отрицательного контроля вносят питательную среду, в лунки положительного контроля - сыворотку крови больного туберкулезом, заведомо содержащую анти-Mtb IgG и/или анти-Mtb IgA и разведенную 1:100. Инкубируют планшет в течение 1 часа при 37°C. Затем планшет отмывают промывочным раствором и добавляют конъюгат антител, специфичных к IgG (в первую лунку с образцом) и IgA (во вторую) человека, меченных пероксидазой хрена. Планшет инкубируют 1 час при 37°C, затем отмывают и вносят в лунки индикаторный раствор (тетраметилбензидин в цитратном буферном растворе), далее планшет инкубируют в темноте при комнатной температуре 25 минут. Для остановки реакции добавляют 1М серной кислоты.

Оценка результатов

Учет проводится в спектрофотометре при длине волны 450 нм, референс 620 нм. Результаты выражают в единицах оптической плотности (ед.ОП). Определяют значения оптической плотности в лунках отрицательного контроля (К^-), положительного контроля (К⁺) и исследуемых образцов (ОП^обр). Величина оптической плотности культуральной среды - отрицательного контроля (К^-) при повторных постановках ИФА на детекцию анти-Mtb IgG колебалась от 0,099 до 0,155 ед.ОП, а в случае анти-Mtb IgA была в диапазоне 0, 032 - 0, 050 ед.ОП. Исходя из этого предложено рассчитывать значение ОП^кр по формуле: ОП^кр=К^-+0,1. При значениях ОП^обр>ОП^кр и К⁺>ОП^кр делают заключение о наличие активного туберкулезного процесса в организме и происходящем на момент обследования активном ответе В-клеток на Mtb. При значениях ОП^обр<ОП¹⁴⁵ и К⁺>ОП^кр можно говорить об отсутствии на момент обследования ответа В-лимфоцитов на Mtb, что интерпретируется как отсутствие инфицированности Mtb или как ЛТИ (при наличии данных, подтверждающих предшествующее инфицирование Mtb, например, при положительном результате «интерферонового» теста или кожной пробы).

При значениях К⁺<ОП^кр и любых значениях ОП^обр результат постановки считают недостоверным.

При использовании такого подхода положительный результат ИФА образцов культуральной жидкости возможен только при наличии синтеза и секреции специфичных антител в культуре МНК. Поскольку предлагаемый метод не требует стимуляции МНК антигенами микобактерий in vitro, наличие синтеза и секреции анти-Mtb IgG и IgA антител может быть следствием только предшествующей активации В-лимфоцитов антигенами микобактерий в организме испытуемого.

Предложенный способ, основанный на ИФА анализе спонтанной продукции специфичных анти-Mtb IgG и IgA в культуре МНК, подобран на основании клинических исследований 36 больных туберкулезом легких (16 женщин и 20 мужчин в возрасте от 20 до 49 лет, средний возраст - 32 года) и 36 здоровых добровольцев. Обследование больных проводили в первые дни поступления в стационар. Кровь забирали из вены утром натощак и анализировали согласно описанному способу. У всех больных с помощью микробиологических, клинических и рентгенологических методов анализировали: наличие микобактерий в мокроте, клинические проявления ТБ, распространение инфекции, выраженность инфильтративных изменений, наличие в легочной ткани полостей деструкции.

Среди здоровых добровольцев 22 человека (61%) находились в длительном контакте с больными туберкулезом (работники противотуберкулезного стационара и лица с домашним контактом). У остальных 14 здоровых добровольцев (39%) контакта с больными открытыми формами туберкулеза не было. Все доноры были обследованы клинически и рентгенологически, а также тестированы на инфицирование М. tuberculosis: с помощью «интерферонового» теста (QuantiFERON-TB Gold in-tube) и серологической диагностики - определения суммарных антител к M.tuberculosis в сыворотке крови («Ат-Туб» ВекторБест). Все исследования проводили двойным слепым методом.

У 32 из 36 больных туберкулезом результат анализа спонтанной продукции специфических анти-Mtb IgG и/или IgA в культуре МНК был положительным. Таким образом, чувствительность предлагаемого способа диагностики туберкулеза составила 89%.

У всех 36 здоровых добровольцев включая 22 человека, находящихся в контакте с больными туберкулезом, 8 человек, инфицированных M.tuberculosis, по данным «интерферонового» теста (QuantiFERON-TB Gold in-tube) и 7 человек с положительным результатом серологической диагностики («Ат-Туб» ВекторБест), результат анализа спонтанной продукции специфических анти-Mtb IgG и IgA в культуре МНК был отрицательным. Специфичность предлагаемого метода диагностики туберкулезной инфекции составила, таким образом, 100%.

Вероятность получения положительного результата вследствие заноса антител в культуру из сыворотки/плазмы крови больных не представляется вероятным, так как уровень спонтанной продукции специфических анти-Mtb IgG в культуре МНК больных туберкулезом не зависел от уровня анти-Mtb антител в плазме крови по данным ИФА - «Ат-Туб» теста (r=0,07, р>0,05).

Проведенный анализ показал, что уровень спонтанной продукции специфических анти-Mtb IgG в культуре МНК у больных туберкулезом (0,556±0,075 ед.ОП) достоверно превышал таковой у здоровых добровольцев (0,125±0,008 ед.ОП, р<0,0001), включая лиц, находящихся в контакте с больными туберкулезом (0,126±0,011 ед.ОП, р<0,0001), и пациентов с подтвержденной латентной туберкулезной инфекцией (0,127±0,007ед.ОП, р<0,0001).

При сравнении чувствительности анализа спонтанной продукции специфических анти-Mtb IgG и IgA в культуре МНК (89%) с серологической диагностикой (суммарные антитела «Ат-туб» Вектор-Бест 79%, р=0,26) и QuantiFERON-TB Gold in-tube 89%, р=0,67) в диагностике туберкулеза достоверных различий не выявлено. Однако при оценке специфичности предлагаемый способ оказался достоверно специфичнее (100%) в диагностике активного ТБ, чем серологический метод диагностики (81%, р<0,05) и «интерфероновый» тест QuantiFERON-TB Gold in-tube (78%, р<0,05). При сравнении специфичности диагностики на выборке здоровых доноров без контакта с больными открытыми формами туберкулеза различий между способом анализа спонтанной продукции специфических анти-Mtb IgG и IgA в культуре МНК (100%) и серологическим методом диагностики (79%, р=0,11), а также «интерфероновым» тестом QuantiFERON-TB Gold in-tube (93%, р=0,5) в виду малой выборки (14 человек) не выявлено. При аналогичном сравнении у лиц, находящихся в контакте с источником Mtb (22 человека), предлагаемый метод (100%) оказался достоверно специфичнее «интерферонового» теста QuantiFERON-TB Gold in-tube (68%, р<0,01) и с достоверностью на уровне тенденции специфичнее, чем серологический метод (82%, р=0,054).

Примеры конкретного использования способа диагностики туберкулеза.

Пример 1

Больной Б., 1983 года рождения. Диагноз: фиброзно-кавернозный туберкулез верхней доли правого легкого в стадии инфильтрации.

Уровень продукции анти-Mtb IgG - 2,191 ед.ОП (К⁺=2,413 ед.ОП, ОП^кр=0,199, ОП^кр<ОП^обр<К⁺). Уровень продукции анти-Mtb IgA - 0,05 ед.ОП (К⁺=2,114 ед.ОП, ОП^кр=0,150, ОП°^бр<ОП^кр<К⁺). Результат теста - положительный.

Результат теста на инифицирование M. tuberculosis (QuantiFERO-TB Gold in tube) - отрицательный. Результат ИФА суммарных антител к Mtb в сыворотке крови - положительный. Результаты рентгенологического обследования: в верхних долях обоих легких на фоне массивной инфильтрации множества полиморфных очагов имеются полости распада до 4-5 см в диаметре в S₂, S₁, S₆ правого легкого и S₁, S₂, S₃, S₄ левого легкого. Результат бактериоскопии отрицательный. Посев мокроты - положительный «+». Жалобы на слабость, потливость, утомляемость. Температура тела субфебрильная, в общем анализе крови ускорение СОЭ - 67.

Заключение: активный туберкулезный процесс.

Пример 2

Больная Д., 1984 года рождения. Диагноз: Очаговый туберкулез обоих легких.

Уровень продукции анти-Mtb IgG - 0,253 ед. ОП (К⁺=2,413 ед. ОП, ОП^кр=0,199, ОП^кр<ОП^обр<К⁺). Уровень продукции анти-Mtb IgA - 0,055 ед.

ОП (K⁺=2,413 ед. ОП, ОП^кр=0,150, ОП^обр<ОП^кр<К⁺). Результат теста - положительный.

Результаты рентгенологического обследования: в S₁, S₂ правого легкого в кортикальных отделах небольшие полиморфные очаги, в S₁, S₂ левого легкого, в кортикальных отделах мелкие полиморфные очаги. Результаты бактериоскопии, посева мокроты отрицательные. Жалобы на слабость, потливость, утомляемость. Температура тела нормальная, общий анализ крови без патологических изменений. Результат теста на инифицирование M. tuberculosis (QuantiFERO-TB Gold in tube) - положительный. Результат ИФА суммарных антител к Mtb в сыворотке крови - положительный.

Заключение: активный туберкулезный процесс.

Пример 3

Больная Ц., 1993 года рождения. Диагноз: очаговый туберкулез легкого в фазе распада и обсеменения.

Уровень продукции анти-Mtb IgG - 0,350 ед. ОП (К⁺=2,413 ед.ОП, ОП^кр=0,199, ОП^кр<ОП^обр<К⁺). Уровень продукции анти-Mtb IgA - 0,052 ед. ОП (ОП⁺=2,114 ед.ОП, ОП^кр=0,150, ОП°^бр<ОП^кр<К⁺). Результат теста - положительный.

Результаты рентгенологического обследования: очаги в ателектатическом сегменте S₁, S₂ хаотичные очаги с распадом от 6 до 11 мм. Результаты бактериоскопии, посева мокроты отрицательные. Результат ИФА суммарных антител к Mtb в сыворотке крови - отрицательный. Жалобы на слабость, потливость, утомляемость. Температура тела нормальная, в общем анализе крови ускорение СОЭ до 36.

Заключение: активный туберкулезный процесс.

Пример 4

Больной Н., 1979 года рождения. Диагноз: очаговый туберкулез верхней доли правого легкого в стадии инфильтрации.

Уровень продукции анти-Mtb IgG - 0,069 ед.ОП (К⁺=2,413 ед.ОП; ОП^кр=0,199, ОП^обр<ОП^кр<К⁺). Уровень продукции анти-Mtb IgA - 1,149 ед.ОП (К⁺=2,114 ед.ОП, ОП^кр=0,150, ОП^кр<ОП^обр<К⁺). Результат теста - положительный.

Результат теста на инифицирование M.tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in tube) - положительный. Результат ИФА суммарных антител к Mtb в сыворотке крови - отрицательный. Результаты рентгенологического обследования: в верхней доле правого легкого на фоне массивной инфильтрации множества полиморфных очагов в S₂. Результат бактериоскопии отрицательный. Посев мокроты - отрицательный. Жалобы на слабость, потливость, утомляемость. Температура тела нормальная, в общем анализе крови без патологических изменений, СОЭ - 5.

Заключение: активный туберкулезный процесс.

Пример 5

Медицинский работник И. со стажем работы в противотуберкулезном стационаре более 9 лет.

Уровень продукции анти-Mtb IgG - 0,1 ед.ОП (К⁺=2,413 ед.ОП, ОП^кр=0,199; ОП°^бр<ОП^кр<К⁺). Уровень продукции анти-Mtb IgA - 0,04 ед. ОП (К⁺=2,114 ед.ОП, ОП^кр=0,150, ОП^обр<ОП^кр<К⁺). Результат теста - отрицательный.

По результатам рентгенологического обследования: изменений в легочной ткани не выявлено. Жалоб нет. Клинические признаки ТБ отсутствуют. Результат теста на инфицирование M. tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in-tube): положительный. Результат ИФА суммарных антител к Mtb в сыворотке крови отрицательный.

Заключение: латентная инфекция М. tuberculosis без признаков заболевания.

Пример 6

Здоровый донор С, 1978 года рождения. Туберкулез в анамнезе отрицает. Уровень продукции анти-Mtb IgG - 0,115 ед.ОП (К⁺=2,413 ед.ОП, ОП^кр=0,199; ОП^обр<ОП^кр<К⁺). Уровень продукции анти-Mtb IgA - 0,08 ед.ОП (К⁺=2,114 ед.ОП, ОП^кр=0,150, ОП°^бр<ОП^кр<К⁺). Результаты рентгенологического обследования: изменений в легочной ткани не выявлено. Жалоб нет, клинические признаки ТБ отсутствуют. Результат теста на инфицирование М. tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in-tube): отрицательный. Результат ИФА суммарных антител к Mtb в сыворотке крови - положительный.

Заключение: латентная инфекция М. tuberculosis без признаков заболевания.

Приведенные примеры иллюстрируют возможность применения предложенного способа для диагностики активных форм туберкулеза.

Предлагаемый в настоящем изобретении способ отличается от других существующих методов и обладает рядом преимуществ: а) безопасностью для пациента; б) доступностью получения исследуемого материала - анализ небольшого образца крови; в) позволяет выявлять активный туберкулезный процесс, а также проводить дифференциальную диагностику туберкулеза и латентной туберкулезной инфекции.

Таким образом, благодаря усовершенствованию известного способа в предложенном изобретении достигается требуемый технический результат повышения эффективности диагностики и расширения области применения, поскольку он используется как для диагностики, так и для дифференциальной диагностики туберкулеза и латентной туберкулезной инфекции.

Способ диагностики туберкулеза, заключающийся в том, что выделяют мононуклеарные клетки периферической крови, культивируют их в питательной среде, получают образец супернатанта культуры мононуклеарных клеток периферической крови и проводят иммуноферментный анализ, отличающийся тем, что перед проведением иммуноферментного анализа в лунки отрицательного контроля вносят питательную среду для культивирования клеток, а в лунки положительного контроля вносят сыворотку крови больного туберкулезом, заведомо содержащую анти-Mtb IgG и анти-Mtb IgA и разведенную 1:100, при иммуноферментном анализе используют в качестве сорбента раствор антигенов Mtb и определяют оптическую плотность образца супернатанта культуры мононуклеарных клеток периферической крови испытуемых ОП^обр, образца отрицательного контроля К^- и образца положительного контроля К⁺, после чего определяют критическое значение оптической плотности из соотношения ОП^кр=К^-+0,1 и при значениях ОП^обр>ОП^кр и К⁺>ОП^кр устанавливают диагноз активный туберкулез, при значениях ОП^обр<ОП^кр и К⁺>ОП^кр устанавливают отсутствие туберкулезной инфекции или латентную туберкулезную инфекцию, а при значениях К⁺<ОП^кр и любых значениях ОП^обр результат анализа считают недостоверным.