Способ патоморфологической диагностики хронического аппендицита

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для патоморфологической диагностики хронического аппендицита. Способ заключается в следующем: образец ткани фиксируют, изготавливают срезы, инкубируют с реагентом и проводят обработку проявляющим агентом, дегидратацию и заключение в среду. В качестве реагента используют антитела к р44 МАРК (Erkl) (МАРК3) в разведении 1:100 - 1:250, длительность инкубации с реагентом во влажной камере при температуре 25°C составляет 60 минут. Способ позволяет по выявлению в препарате специфической окраски в субсерозном и мышечном слоях стенки аппендикса диагностировать хронический аппендицит. 1 пр., 4 ил.

 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии.

Известно, что диагностика хронического аппендицита, а особенно дифференциальная диагностика его различных форм, представляет определенные трудности [Bittinger F., Brochhausen С, Köhler Н., Lehr Н.А., Otto М., Skarke С, Walgenbach S., Kirkpatrick C.J. Differential expression of cell adhesion molecules in inflamed appendix: correlation with clinical stage // J. Pathol. - 1998. - Vol. 186, N 4. - P. 422-428].

Известен способ дифференциальной диагностики хронического аппендицита, включающий подсчет плотности эозинофильной инфильтрации и количества тучных клеток в гистологическом препарате. Выявление тучных клеток на препарате проводят окрашиванием срезов 1%-ным толлуидиновым синим. При хроническом аппендиците количество эозинофилов во всех слоях аппендикса ниже, чем при остром аппендиците, а количество тучных клеток выше [Mysorekar V.V., Chanda S., Dandeka C.P. Mast cells in surgically resected appendices // Indian J. Pathol. Microbiol. - 2006. - Vol.; 49, N 2. - P. 229-233].

Недостатком известного способа является отсутствие четких критериев постановки диагноза "хронический аппендицит" при необходимости проведения трудоемких морфометрических исследований.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ диагностики хронического аппендицита путем фиксации образца ткани, изготовления срезов, инкубирования во влажной камере с реагентом и обработки проявляющим агентом, дегидратации и заключения в среду. Известный способ основан на оценке дифференциальной экспрессии молекул клеточной адгезии в воспаленном аппендиксе [Bittinger F., Brochhausen С, Köhler Н., Lehr Н.А., Otto М., Skarke С, Walgenbach S., Kirkpatrick С.J. Differential expression of cell adhesion molecules in inflamed appendix: correlation with clinical stage // J. Pathol. - 1998. - Vol. 186, N 4. - P. 422-428].

Известный способ осуществляют следующим образом. Криосрезы аппендикса, фиксированные 4% параформальдегидом, окрашивают имуногистохимическим методом с использованием в качестве первичных антител моноклональные мышинные антитела к ICAM-1 (молекула межклеточной адгезии 1) (в разведении 1:200), VCAM-1 (васкулярная молекула клеточной адгезии 1) (в разведении 1:50), E-selectin (эндотелиально-лейкоцитарная молекула адгезии 1) (в разведении 1:50) (Biermann, Bad Nauheim, Germany). Первичные антитела инкубируют на срезах в течение 16 часов при 4°С. В качестве вторичных антител применяют кроличьи антимышинные IgG. Затем на срезы наносят АРААР complex (меченные щелочной фосфатазой моноклональные антитела к щелочной фосфатазе) (Dako, Hamburg, Germany) и инкубируют в течение 15-30 минут с хромогенами. Для докрашивания ядер на срезах применяют гемалаун.

Экспрессию молекул клеточной адгезии оценивают полуколичественным методом с помощью световой микроскопии по интенсивности окраски клеток. При отсутствии окраски интенсивность экспрессии обозначают как 0, при слабой фокальной окраске менее 30% клеток - 1, при средней интенсивности фокальной окраски менее 30% клеток - 2, при выраженной окраске менее 30% клеток - 3, при выраженной окраске большинства клеток - 4.

При этом:

- в неизмененном аппендиксе отмечают легкую гомогенную окраску в сосудах на ICAM-1, в то же время на VCAM-1 и E-selectin окраска не регистрируется;

- в ранний период острого аппендицита регистрируют умеренно положительную окраску на ICAM-1, слабо положительный результат на VCAM-1 и слабо (менее 6 ч после начала клинических симптомов) или умеренно (более 6 ч) положительный результат на Е-селектин;

- при флегмонозном аппендиците окраска выявлялась от умеренной до сильной положительной на ICAM-1, слабоположительной на VCAM-1 и от умеренно до сильноположительной на Е-селектин;

- при подостром аппендиците - слабая экспрессия на ICAM-1, легкая на VCAM-1 и минимальная на Е-селектин;

- при хроническом аппендиците экспрессия ICAM-1 и VCAM-1 сильнее, чем при подостром аппендиците. В отличие от раннего острого аппендицита, наблюдается более интенсивное окрашивание на VCAM-1, аналогичное флегмонозному аппендициту, и умеренная экспрессия ICAM-1.

К недостаткам известного способа патоморфологической диагностики хронического аппендицита следует отнести недостаточную его точность, обусловленную полуколичественным анализом результатов.

Также к недостаткам данного способа следует отнести длительную инкубацию с первичными антителами - 16 часов, необходимость одновременного применения 3-х окрасок, а также и приготовление криосрезов. Все эти приемы существенно повышают трудоемкость и стоимость работ. При этом известный способ не может быть использован для анализа архивного материала, т.к. предполагает применение специального забора материала в операционной.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа патологоанатомической диагностики хронического аппендицита.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности патоморфологической диагностики хронического аппендицита, за счет специфической окраски субсерозного и мышечного слоев стенки аппендикса, а также снижение трудоемкости анализа и возможность исследования архивного материала.

Технический результат достигается тем, что способ патоморфологической диагностики хронического аппендицита включает в себя фиксацию образца ткани, изготовление срезов, инкубирование во влажной камере с реагентом и обработку проявляющим агентом.

Основным отличительным приемом заявляемого способа является то, что в качестве реагента используют антитела к р44 MAPK (Erk1) (MAPK3) (митогенактивируемая протеинкиназа 3) в разведении 1:100-1:250.

Отличительным приемом предлагаемого способа также является и то, что инкубацию с реагентом проводят при температуре 25°С и относительной влажности 100%. Длительность инкубации составляет 60 минут.

Отличие заявляемого способа заключаются и в том, что при микроскопическом выявлении в препарате свечения изумрудно-зеленой окраски в субсерозном и мышечном слоях стенки аппендикса диагностируют хронический аппендицит.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна».

Заявляемый способ обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно обеспечение возможности диагностики хронического аппендицита, повышения точности и специфичности патоморфологического установления хронического аппендицита

Совокупность приемов заявляемого способа позволила авторам получить специфическое окрашивание субсерозного и мышечного слоев стенки аппендикса и по визуализации свечения флюорохромных меток в них четко дифференцировать хронический аппендицит от других форм патологии червеобразного отростка. Отсутствие такого свечения позволяет исключить данный диагноз.

Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами.

Вышеизложенное дает основание считать, что заявляемое техническое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».

Сущность заявляемого способа поясняется примером конкретного выполнения. Приведенный ниже пример служит для иллюстрации, но не ограничивает данное изобретение.

Пример.

Объектом исследования явился интраоперационный материал 18-ти больных, оперированных по поводу различной аппендикулярной патологии. На основании клинико-морфологических данных в 12-ти случаях диагностировали острый флегмонозный аппендицит, в 2-х - острый гангренозный, в 3-х - хронический аппендицит, в 1-м - лимфофолликулярную гиперплазию слизистой червеобразного отростка. Протокол исследования одобрен Комитетом по биомедицинской этике Иркутского научного центра хирургии и травматологии.

Фрагменты дистальной части червеобразного отростка фиксировали в растворе FineFix (Milestone, Италия) и заливали в парафиновые блоки по общепринятой методике [Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. - С. 13-15, 52-59].

Затем готовили срезы толщиной 5 мкм, которые монтировали на стекла, покрытые поли-L-лизином. Препараты депарафинировали вначале в толуоле - 5 минут, а затем последовательно, по 1 минуте, в спиртах 100°, 96°, 90°, 70° и 50°. После чего препараты выдерживали в дистиллированной воде в течение 10 минут.

Для демаскирования антигенов препараты помещали в цитратный буфер (pH=6.0) и нагревали 8 минут в микроволновой печи мощностью 800 W при 100% мощности, а затем 10 минут при 60% мощности. После чего препараты охлаждали до 25°C в цитратном буфере (pH=6.0), промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (pH=7.6) 2 раза по 5 минут, обводили гидрофобным карандашом Dako Pen (Dako, Code S2002).

На препарат наносили Image-iT FX signal enhancer (Invitrogen. Cat. N 136933, Lot 681688) и инкубировали во влажной камере при температуре 25°C 30 минут.

Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (pH=7.6) 2 раза по 5 минут.

Наносили 2% раствор нормальной сыворотки козы (Normal goat serum, Invitrogen, REF PCN 5000, Lot 757418А), инкубировали при температуре 25°C 30 минут.

Наносили первичные антитела р44 МАРК (Erkl) (МАРК3) Rabbit Monoclonal Antibody (Epitomics, Clone ID: EP4967, Cat. N 3739-1, Lot YH111626 в рабочем разведении (1:100 - 1:250), инкубировали во влажной камере при температуре 25°C 60 минут.

Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (pH=7.6) 2 раза по 5 минут.

Наносили вторичные антитела Alexa fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) (Invitrogen, Cat. N 11034, Lot 870976), рабочее разведение 1:300, инкубировали во влажной камере при температуре 25°C 30 минут.

Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (рН=7.6) 2 раза по 5 минут.

Для окрашивания ядер наносили Hoechst, рабочее разведение 1:200, инкубировали 10 минут.

Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (рН=7.6) 2 раза по 5 минут.

Заключали в среду Fluoromount (Diagnostic Biosystems, REF K024, Lot P 939-B).

Визуализацию специфического свечения флюорохромных меток - изумрудно-зеленой окраски, проводили на исследовательском микроскопе Nikon Eclipse 80i с приставкой для эпифлюоресценции DIH-M. В качестве фильтров для выделения требуемых диапазонов флюоресценции использовали Nikon DAPI (возбуждение 325-375 нм, дихроичное зеркало 400 LP, эмиссия 435-485 нм), Nikon В-2А (возбуждение 450-490 нм, дихроичное зеркало 505 LP, эмиссия ≥515 нм). В качестве регистратора использовали камеру Nikon DS-Filc, подключенную к контроллеру Nikon DS-U2, с использованием программного обеспечения Nikon Elements.

Авторами установлено, что при хроническом аппендиците регистрируется яркое специфическое свечение изумрудно-зеленой окраски в субсерозном и мышечном слоях стенки аппендикса. Так, на фиг. 1 представлено специфическое свечение в субсерозном (позиция А) и мышечном (фиг. 2, позиция В) слоях при хроническом аппендиците. Специфическое свечение имеет изумрудно-зеленую окраску. Ядра клеток - синяя окраска (окрашены Hoechst).

При других формах патологии червеобразного отростка специфическое свечение не зарегистрировано. На фиг. 3 и фиг. 4 показано отсутствие специфического свечения при остром флегмонозном аппендиците, соответственно, в субсерозном и мышечном слоях стенки аппендикса. Ядра клеток окрашены Hoechst (синяя окраска).

Авторы отмечают хорошую воспроизводимость предлагаемого способа - при окрашивании серийных срезов в разных партиях достигнуты идентичные результаты окрашивания.

Таким образом, предлагаемый способ патоморфологической диагностики хронического аппендицита позволяет: четко верифицировать диагноз хронический аппендицит при патоморфологическом исследовании; снизить длительность инкубации с первичными антителами с 16 часов (в прототипе) до 1 часа, а общее время окрашивания - до 4 часов; применять для диагностики окраску с единственным первичным антителом, что снижает трудоемкость и стоимость работ. При этом предлагаемый способ обеспечивает возможность анализа архивного материала.

Данный способ может быть использован в медицине, а именно в патологической анатомии для дифференциальной диагностики хронического аппендицита.

Способ патоморфологической диагностики хронического аппендицита, включающий фиксацию образца ткани, изготовление срезов, инкубирование во влажной камере с реагентом и обработку проявляющим агентом, дегидратацию и заключение в среду, отличающийся тем, что в качестве реагента используют антитела к р44 MAPK (Erk1) (MAPK3) в разведении 1:100-1:250, длительность инкубации с реагентом при температуре 25°С и относительной влажности 100% составляет 60 минут, и при микроскопическом выявлении в препарате свечения изумрудно-зеленой окраски в субсерозном и мышечном слоях стенки аппендикса диагностируют хронический аппендицит.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его функциональному фрагменту, которые способны связывается с cMet. Также раскрыты мышиная гибридома, способная секретировать указное антитело, нуклеиновая кислота, которая экспрессирует указанное антитело и набор для прогнозирования эффективности лечения онкогенного расстройства, включающий указанное антитело.
Изобретение относится к медицине, а именно к малоинвазивным методам в хирургической эндокринологии, и касается дифференциальной диагностики образований шеи. Способ включает ультразвук-контролируемую тонкоигольную аспирационную пункционную биопсию, которую выполняют однократно одной иглой через один прокол.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и предназначено для прогнозирования течения вакцинального процесса у детей, имеющих неврологические нарушения ЦНС.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для диагностики формирования фетоплацентарной недостаточности при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации.

Изобретение относится к медицине и касается способа оценки эффективности лечения больных хроническим бруцеллезом. Сущность способа заключается в том, что у больных хроническим бруцеллезом в фазе обострения до начала терапии и по ее окончании проводится определение сывороточного уровня ФНО α, ИФН γ, ИЛ 10, рассчитывается соотношение ИФН γ / ИЛ 10.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и может быть использовано для прогнозирования развития безрецидивной выживаемости у больных множественной миеломой после аутологической трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования рецептивности эндометрия при бесплодии у женщин с повторными неудачами программ ЭКО.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики метастазов рака и неходжкинских лимфом. Клеточный материал из образцов лимфатических узлов помещают в питательную среду накопления, состоящую из раствора Хенкса, реоплиглюкина и альбумина, смешанных в равных объемах.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и касается способа прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы в зависимости от наличия/отсутствия сопутствующей неинфекционной патологии глаз у индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья России.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены диагностический инструмент для анализа образца и способ подготовки и анализа образца.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики меланомы хориоидеи. Сущность способа состоит в том, что у пациента с подозрением на меланому хориоидеи осуществляют забор слезной жидкости из обоих глаз, далее определяют концентрацию в слезной жидкости интерлейкина-8 и при значении этого показателя выше 17,7 пг/мл диагностируют меланому хориоидеи. Сущность способа состоит в упрощении способа и повышении его точности. 1 з.п. ф-лы, 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов. Для этого используют бруцеллин для специфической активации лимфоцитов. Детекцию бластных форм лимфоцитов проводят с помощью моноклональных антител к CD34 с последующим подсчетом клеток методом проточной цитофлуориметрии. Использование данного способа позволяет проводить учет активированных бруцеллином лимфоцитов в РБТЛ с использованием моноклональных антител CD34 у больных бруцеллезом и здоровых доноров. 1 табл.
Изобретение относится к медицинской аллергологии, иммунологии, медицинской лабораторной диагностике. Сущность способа состоит в том, что в периферической крови обследуемых лиц определяют концентрацию IgE и абсолютное содержание лимфоцитов СD23+. При содержании СD23+ более 0,6×109 кл./л выявляют риск формирования гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ). Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность формирования гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ). 3 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен диагностикум для индикации специфических антител к F1 антигену чумного микроба, который представляет собой взвесь композитных частиц, состоящих из углеродной метки размером не более 500 нм, заключенных в полимерную матрицу, представляющую собой привитой сополимер бычьего сывороточного альбумина с чумным капсульным антигеном F1, при соотношении компонентов, мг/мл: углеродная метка - 20-30, бычий сывороточный альбумин - 5-10, антиген F1 - 0,2-1,0; при этом полученные частицы композита стабилизированы в забуференном физиологическом растворе рН 7,0-7,4 высокомолекулярными полимерами и неионными детергентами. Изобретение направлено на повышение чувствительности метода дот-иммуноанализа за счет стабилизации антигена на поверхности углеродной метки, что приводит к повышению эффективности анализа, позволяющего выявлять специфические антитела в более низких титрах. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 3 пр.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено выделенное моноклональное антитело к FcRH5, охарактеризованное последовательностями HVR. Также рассмотрены: полинуклеотид, вектор экспрессии и клетка-хозяин для получения антитела по изобретению. Кроме того, на основе антитела по изобретению предложены иммуноконъюгаты, предназначенные для ингибирования роста клеток, экспрессирующих FcRH5; для определения присутствия FcRH5; для лечения расстройства, связанного с повышенной экспрессией и/или активностью FcRH5; а также фармацевтическая композиция для лечения расстройства, связанного с повышенной экспрессией и/или активностью FcRH5. Показано применение иммуноконъюгата по изобретению для получения лекарственных средств для ингибирования роста клеток, экспрессирующих FcRH5, и для лечения пролиферативного расстройства, опосредованного FcRH5. Также представлен способ получения конъюгата по изобретению и способ in vitro определения присутствия FcRH5 в образце. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии и диагностике заболеваний, связанных FcRH5. 14 н. и 47 з.п. ф-лы, 31 ил., 7 табл., 13 пр.

Изобретение относится к областям биологии и генетической инженерии. Предложен выделенный пептид для терапевтических целей, содержащий последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную SEQ ID NO:4 (GG00444), или его фрагмент или вариант, способные связываться со слизью кишечника человека, а также содержащая его ворсинчатая структура, пищевой продукт, фармацевтическая композиция, полинуклеотид, экспрессионный вектор, клетка-хозяин, кластер генов, антитело, способ лечения и способ скрининга пробиотических бактериальных штаммов. 20 н. и 11 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл., 11 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики различных форм адренокортикальной карциномы (АКК), синдрома Иценко - Кушинга (СИК) и гормонально-неактивных аденом (ГНА) коры надпочечников. Способ заключается в проведении иммунохемилюминесцентного (ИХЛА), радиоиммунологического (РИА) методов анализа, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ/МС) с определением значений диагностических показателей, согласно которым присваивают соответствующую форму новообразования коры надпочечников. Изобретение обеспечивает значительное повышение точности и чувствительности дифференциальной диагностики новообразований коры надпочечников. 5 пр., 8 табл.
Изобретение относится к медицине и касается способа определения состава индивидуальных внеклеточных везикул в крови человека, заключающегося в том, что кровь пациента берут из периферической вены, центрифугируют, получают плазму, обедненную тромбоцитами, хранят в замороженном виде, после размораживания проводят связывание EVs с МНЧ, предварительно конъюгированными с антителами, специфичными к различным поверхностным антигенам везикул, и меченными флуоресцентным Fab-фрагментом иммуноглобулина G; окрашивают полученный раствор МНЧ-EVs, к половине растворов с комплексами МНЧ-EVs добавляют флуоресцентные изотипические контроли; проводят иммобилизацию комплексов МНЧ-EVs-антитело с помощью магнитных колонок и промывание магнитных колонок, растворяют в буфере и фиксируют; к полученному раствору добавляют полистереновые частицы; полученные МНЧ-EVs комплексы, меченные антителами, анализируют на проточном цитометре. Изобретение обеспечивает определение состава всех фракций индивидуальных внеклеточных везикул (EVs) в крови человека для дальнейшего изучения их роли в патогенезе атеросклероза и процессе дестабилизации атеросклеротических бляшек. 1 пр.

Изобретение относится к области профилактической медицины и предназначено для прогнозирования сенсибилизации организма к формальдегиду у подростков. Предложен способ, включающий определение в крови относительного количества эозинофилов, относительного содержания ауто-АТ к мембранным антигенам паренхимы легких и расчет диагностического коэффициента у по формуле. При у меньше 0,5 делают заключение об отсутствии реакции организма на формальдегид и отсутствии к нему сенсибилизации организма. При у больше 0,5 реакцию на формальдегид считают положительной и прогнозируют сенсибилизацию организма к формальдегиду. Изобретение обеспечивает эффективное прогнозирование сенсибилизации организма к формальдегиду. 2 табл., 4 пр.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, онкологии и может быть использовано для прогнозирования развития острого повреждения почки в условиях тепловой ишемии в эксперименте в зависимости от возраста и пола животных. При росте содержания цистатина С у молодых самцов в 1,7 раза, у старых самок в 1,3 раза и/или при росте содержания L-FABP у молодых самцов в 1,8 раз, у старых самок в 5,8 раз при длительности ишемии 15 минут прогнозируют развитие острой почечной недостаточности. При росте содержания цистатина С в 1,2 раза у молодых самок и в 1,5 раза у старых самцов и/или при росте содержания L-FABP в 1,6 раза у старых самцов при длительности ишемии 25 минут прогнозируют развитие острой почечной недостаточности. Способ позволяет доступно провести прогнозирование развития острой почечной недостаточности за счет оценки уровня цистатина С, L-FABP в зависимости от возраста и пола животных и длительности тепловой ишемии. 2 табл.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для патоморфологической диагностики хронического аппендицита. Способ заключается в следующем: образец ткани фиксируют, изготавливают срезы, инкубируют с реагентом и проводят обработку проявляющим агентом, дегидратацию и заключение в среду. В качестве реагента используют антитела к р44 МАРК в разведении 1:100 - 1:250, длительность инкубации с реагентом во влажной камере при температуре 25°C составляет 60 минут. Способ позволяет по выявлению в препарате специфической окраски в субсерозном и мышечном слоях стенки аппендикса диагностировать хронический аппендицит. 1 пр., 4 ил.

Наверх