Способ определения нуклеотидной последовательности r(5mc)gy в заданном положении протяженной днк


 


Владельцы патента RU 2587631:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной генетике. Описан способ определения нуклеотидной последовательности (сайта) 5'-R(5mC)GY-3'/3'-YG(5mC)R-5' в заданном положении протяженной ДНК. Способ включает гидролиз высокоочищенной геномной ДНК метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой GlaI, лигирование универсального олигонуклеотидного адаптера с последующей амплификацией в реальном времени с использованием геномного праймера и зонда, комплементарных исследуемой ДНК и гибридного праймера, 3' конец которого комплементарен 3' концу ДНК от заданного места гидролиза GlaI, а оставшаяся часть комплементарна адаптерной последовательности и составление заключения о наличии последовательности R(5mC)GY (где 5mC - 5-метилцитозин, R - А или G, Y - Τ или С) по появлению флуоресцентного сигнала. Адаптерная последовательность - 5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5'. Способ проводят в единой реакционной смеси с добавлением состава компонентов, обеспечивающих восстанавление S-S связей в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп. Изобретение упрощает способ определения нуклеотидной последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК, расширяет его функциональные возможности и сокращает время анализа. 2 з.п.ф-лы, 2 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной генетике и касается способа определения нуклеотидной последовательности (сайта) 5'-R(5mC)GY-373'-YG(5mC)R-5' (здесь и далее 5mC - 5-метилцитозин, R - А или G, Y - Т или С) в заданном положении протяженной ДНК.

Основным эпигенетическим механизмом, обеспечивающим регуляцию генной активности, служит метилирование ДНК, широко распространенное в живых организмах. У высших эукариот модификация ДНК происходит преимущественно в CG-динуклеотидах путем добавления метальных групп к цитозиновым остаткам в положении С5 пиримидинового кольца, что приводит к образованию 5-метилцитозиновых остатков (5mC) в составе ДНК. Метилирование ДНК играет важную роль в таких биологических процессах, как дифференцировка клеток и тканей, геномный импринтинг, инактивация мобильных элементов генома и других [Sontag LB, Lorincz МС, Georg Luebeck Ε. Dynamics, stability and inheritance of somatic DNA methylation imprints. J Theor Biol. 2006; 242(4):890-899.]. Аномальное de novo метилирование сайтов PuCGPy (с образованием последовательности Pu(5mC)GPy, где Pu=R-А или G, Py=Y-С или Т) осуществляется ДНК-метилтрансферазами человека DNMT3a и DNMT3b в регуляторных участках генов и повторяющихся элементов генома наблюдается в клетках пораженных тканей при ряде заболеваний, в частности при онкопатологиях. Определение степени модификации тех или иных участков генома в норме и патологии позволяет выявлять нарушения в регуляции экспрессии генов и имеет большой диагностический потенциал [de Caseres I.I., Cairus P. Methylated DNA sequences for early cancer detection, molecular classification and chemotherapy response prediction // Clin. Transi. Oncol. - 2007. - Vol. 9. - Р. 429-437]. Изучение метилирования ДНК также важно для понимания молекулярных механизмов онтогенеза, старения, приспосабливаемости организмов к изменениям среды обитания.

Известен способ определения нуклеотидной последовательности Pu(5mC)GPy в заданном положении протяженной ДНК, включающий предварительный гидролиз исследуемой ДНК метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой Glal и последующую амплификацию в реальном времени с ПЦР-хелперами [Rand KN, Young GP, Но Τ, Molloy PL. Sensitive and selective amplification of methylated DNA sequences using helper-dependent chain reaction in combination with a methylation-dependent restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 2013 January; 41(1): e15.]. Использование хелперов, представляющих собой сложные олигонуклеотидные структуры, 3' половина которых комплементарна исследуемой ДНК до места предполагаемого гидролиза, а 5' конец кодирует последовательность для праймера, позволяет точно отметить место гидролиза GlaI, таким образом, наличие ПНР сигнала однозначно говорит о наличии последовательности Pu(5mC)GPy.

Недостатками известного способа являются длительность, дороговизна и ограниченные функциональные возможности. Так, каждый раунд амплификации содержит две стадии отжига и элонгации: на первой гибридизуется хелпер и затем с него достраивается последовательность ДНК, являющаяся комплементарной к праймеру, а далее, после денатурации, гибридизуется праймер и происходит дальнейшая наработка ампликона. Так как хелпер и праймер имеют схожие структуры, то между ними происходит сильная конкуренция, для уменьшения которой необходимо тщательно подбирать соотношение праймер/хелпер и использовать в структуре хелпера единичные замены нуклеотидов на инозин. Кроме того, подобная система отличается низкой эффективностью ПНР, длительностью времени реакции (для получения данных необходимо провести до 85 раундов ПЦР), высокой вероятностью преждевременного разложения компонентов реакционной смеси и необходимостью синтеза уникального хелпера для каждой исследуемой последовательности.

Наиболее близким аналогом (прототипом) к заявляемому техническому решению является способ определения последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК, включающий получение образцов высокоочищенной ДНК; предварительную фрагментацию выделенной ДНК эндонуклеазой рестрикции, не имеющей сайта узнавания в амплифицируемом районе, в частности TaqI; гидролиз фрагментированной ДНК метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой GlaI; лигирование универсального олигонуклеотидного адаптера к гидролизованной ДНК с последующей амплификацией в реальном времени с использованием геномного праймера и зонда, комплементарных исследуемой ДНК и гибридного праймера, 5' конец которого комплементарен 3' концу ДНК у исследуемого места гидролиза GlaI, а оставшаяся часть комплементарна адаптерной последовательности; и составление заключения по появлению флуоресцентного сигнала в случае наличия последовательности R(5mC)GY [Патент РФ №2525710, МПК C12Q 1/68, опубл. 20.08.2014 г.].

Недостатками известного способа являются длительность анализа, наличие нескольких разобщенных стадий и ограниченные функциональные возможности. Так, три независимых реакции, а следовательно, три акта пипетирования увеличивают риск кросс-контаминации исследуемых образцов и повышают вероятность ошибок, связанных с человеческим фактором. Подобная схема анализа плохо поддается автоматизации, что негативно сказывается на возможности применения метода для одновременного исследования большого количества образцов. Кроме того, для пометки мест гидролиза последовательности R(5mC)GY используется универсальный адаптер, структура которого подразумевает появление условий для правильного отжига гибридного праймера, в лучшем случае, на второй цикл реакции ПЦР, что приводит к существенному снижению эффективности анализа некоторых участков ДНК. Соотношение длин цепей универсального адаптера также не оптимально: длинная верхняя цепь (21 нуклеотид) обладает праймерными свойствами, что приводит к активному протеканию неспецифических реакций и ускоренному расходованию компонентов реакционной смеси.

Техническим результатом заявляемого изобретения является упрощение способа определения нуклеотидной последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК, расширение его функциональных возможностей и сокращение времени анализа.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК, включающем гидролиз высокоочищенной геномной ДНК метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой GlaI, лигирование универсального олигонуклеотидного адаптера с последующей амплификацией в реальном времени с использованием геномного праймера и зонда, комплементарных исследуемой ДНК и гибридного праймера, 3' конец которого комплементарен 3' концу ДНК от заданного места гидролиза GlaI, а оставшаяся часть комплементарна адаптерной последовательности, и составление заключения о наличии последовательности R(5mC)GY (где 5mC-5-метилцитозин, R-А или G, Y-Τ или С) по появлению флуоресцентного сигнала, согласно изобретению в качестве адаптерной последовательности используют универсальный олигонуклеотидный адаптер 5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5', а реакции гидролиза высокоочищенной геномной ДНК, лигирования универсального олигонуклеотидного адаптера и амплификации фрагментов геномной ДНК в реальном времени с использованием праймеров и зонда проводят в единой реакционной смеси с добавлением состава компонентов, обеспечивающих восстанавление S-S связей в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп.

Состав компонентов, обеспечивающих восстанавление S-S связей в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп, содержит β-меркаптоэтанол в концентрации 5-7 мМ, бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрации (100-200) нг/мкл и бетаин в концентрации 0,4-0,6 М.

Для получения единой реакционной смеси берут не менее 0,3 нг исследуемой высокоочищенной геномной ДНК; состав компонентов, обеспечивающих восстанавление S-S связей в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп: β-меркаптоэтанол в концентрации 5-7 мМ, бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрации (100-200) нг/мкл и бетаин в концентрации 0,4-0,6 М; реакционный буфер с рН 9.0: 50 мМ Tris-SO4, 30 мМ КСl, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% Tween-20, (3-5) мМ MgCl2, 0,5 мМ АТФ; 0,2 мМ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов; (400-800) нМ универсального адаптера; смесь геномного и гибридного праймеров и зонда по 0,8 мкМ каждого; (1-3) е.а. метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы GlaI; (500-1000) е.а. высокоактивной Т4 ДНК-лигазы; (0,04-0,1) е.а./мкл Hot Start ДНК-полимеразы.

Предлагаемый способ позволяет анализировать наличие метилцитозина в образцах, содержащих не менее 0,3 нг ДНК человека, что обусловлено ограничениями реакции ПЦР.

Концентрации биологических агентов, восстанавливающих S-S связи в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп, подобраны экспериментально и отражают диапазоны оптимумов для данной реакции, а именно: β-меркаптоэтанол в концентрации 5-7 мМ, бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрации 100-200 нг/мкл и бетаин в концентрации 0,4-0,6 М.

Бетаин является важным продуктом, который выступает «донором» метальных групп и принимает участие в реакциях переметилирования. К группе бетаинов относятся различные подобные соединения, однако под названием «бетаин» обычно подразумевают триметилглицин (триметиламиноуксусная кислота) - триметильное производное глицина (http://vesvnorme.net/preparaty/betain.html); (http://finzim.ru/chto-takoe-betafin/betafin-donor-metilnyh-labilnvh-grupp/).

Существенными преимуществами предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются:

1. Отсутствие предварительной фрагментации ДНК эндонуклеазой рестрикции TaqI или другой, не имеющей сайта узнавания в изучаемом регионе;

2. Гидролиз метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой GlaI, лигирование адаптера и реакция ПЦР происходят в одной реакционной смеси (в одной пробирке) за счет введения в указанную смесь состава компонентов, обеспечивающих восстанавление S-S связей в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп, что позволяет упростить способ и расширить его функциональные возможности: уменьшается время проведения анализа, снижается риск кросс-контаминации образцов, сокращается количество манипуляций со стороны исследователя, что позволяет одновременно анализировать большое количество образцов и, при необходимости, полностью автоматизировать процесс.

3. Использование адаптера 5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5', в котором в нижней цепи присутствуют фосфаты на 3'- и 5'-конце, позволяет создать условия для правильной гибридизации (правильному отжигу) гибридного праймера уже в первом раунде ПЦР, а также исключает возможность праймирования ПЦР непрореагировавшими молекулами верхней цепи адаптера (избавление от неспецифической амплификации) за счет использования адаптера с укороченной до 15 нуклеотидов верхней цепью.

Способ определения нуклеотидной последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК осуществляют следующим образом. Анализ наличия метилированной последовательности R(5mC)GY в заданном положении исследуемой ДНК проводят в единой реакционной смеси в объеме 20 мкл, для чего берут:

- не менее 0,3 нг исследуемой высокоочищенной геномной ДНК;

- состав компонентов, обеспечивающих восстанавление S-S связей в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп: β-меркаптоэтанол в концентрации 5-7 мМ, бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрации (100-200) нг/мкл и бетаин в концентрации 0,4-0,6 М;

- реакционный буфер с рН 9.0: 50 мМ Tris-SO4, 30 мМ КСl, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% Tween-20, (3-5) мМ MgCl2, 0,5 мМ АТФ;

- 0,2 мМ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов;

- (400-800) нМ универсального адаптера (5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5');

- смесь геномного и гибридного праймеров и зонда по 0,8 мкМ каждого;

- (1-3) е.а. метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы GlaI;

- (500-1000) е.а. высокоактивной Т4 ДНК-лигазы;

- (0,04-0,1) е.а./мкл Hot Start ДНК-полимеразы.

Реакцию проводят в детектирующем амплификаторе по следующей программе: 25°С - 60 минут, 95°С - 5 минут, далее 5 циклов без детекции: 95°С - 10 сек, 61°С - 25 сек, 72°С - 5 сек; затем 40 циклов с детекцией (канал FAM) на стадии отжига: 95°С - 10 сек, 61°С - 25 сек, 72°С - 5 сек.

Появление флуоресцентного сигнала в ходе ПНР однозначно говорит о наличии последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК.

На фиг. 1 показаны кривые накопления продукта с метилированных ДНК с течением времени при определении последовательности R(5mC)GY в первом экзоне гена-онкосупрессора RARB. На фиг. 2 показаны кривые накопления продукта с метилированных ДНК с течением времени при определении последовательности R(5mC)GY в первом экзоне гена-онкосупрессора NEYROG1.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Определение последовательности R(5mC)GY в первом экзоне гена-онкосупрессора RARB.

Для анализа наличия последовательности R(5mC)GY была выбрана ДНК из клеток Raji (лимфома Беркитта), в которой гиперметилирована исследуемая область гена RARB, в качестве отрицательного контроля неспецифической ДНК была выбрана ДНК мыши линии А/Не.

Реакцию проводили в 20 мкл реакционной смеси, следующего состава: 15 нг исследуемой ДНК, 50 мМ Tris-SO4, рН 9.0, 30 мМ КСl, 10 мМ сульфата аммония, 100 нг/мкл BSA, 0,01% Tween-20, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 5 мМ MgCl2, 0,5 мМ АТФ, 0,2 мМ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, 400 нМ универсального адаптера (5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5'), смесь праймеров и зонда по 0,8 мкМ каждого, 1 е.а. метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы GlaI, 500 е.а. высокоактивной Т4 ДНК-лигазы и 0,1 е.а./мкл Hot Start ДНК-полимеразы. Структура праймеров и зонда следующая: геномный - 5'-TTCAGAGGCAGGAGGGTCTATTC-3', гибридный - 5'-CCTGCTCTTTCATCGGTTC-3' (подчеркнута часть праймера, комплементарная исследуемой ДНК), зонд - 5'-FAM-TCCCAGTCCTCAAACAGCTCGCATGG-BHQ1-3'. Программа амплификации (для термоциклера CFX96 (Bio-Rad, США)): 25°С - 60 минут, 95°С - 5 минут, далее 5 циклов без детекции: 95°С - 10 сек, 61°С - 25 сек, 72°С - 5 сек; затем 40 циклов с детекцией (канал FAM) на стадии отжига: 95°С - 10 сек, 61°С - 25 сек, 72°С - 5 сек.

Параллельно с этим проводился анализ наличия последовательности R(5mC)GY в тех же ДНК согласно протоколу прототипа [1]. Праймеры и зонд использовались те же.

На фиг. 1 показаны кривые накопления продукта с метилированных ДНК с течением времени. Полученные данные говорят об одинаковой эффективности анализа наличия метилированных последовательностей R(5mC)GY в первом экзоне гена RARB при использовании предлагаемого метода и прототипа. Однако для проведения анализа по протоколу прототипа затраты времени составили ~6 часов, тогда как при использовании протокола изобретения результат был получен за 3 часа.

Пример 2. Определение последовательности R(5mC)GY в первом экзоне гена-онкосупрессора NEYROG1.

Для анализа наличия последовательности R(5mC)GY была выбрана ДНК из клеток Raji (лимфома Беркитта), в которой исследуемый район гена NEYROG1 гиперметилирован, в качестве неметилированного отрицательного контроля ДНК мыши линии А/Не.

Анализ ДНК проводили аналогично примеру 1, но использовали другие концентрации некоторых компонентов смеси. А именно: β-меркаптоэтанола 7 мМ, MgCl2 3мМ, универсального адаптера (5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5') 800 нМ, смесь праймеров и зонда по 0,4 мкМ каждого, 2 е.а. метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы GlaI, 1000 е.а. высокоактивной Т4 ДНК-лигазы и 0,04 е.а./мкл Hot Start ДНК-полимеразы. Структура праймеров и зонда следующая: геномный - 5'-GCCTCGGCCGCTAATCGC-3', гибридный - 5'-CCTGCTCTTTCATCGGTCT-3' (подчеркнута часть праймера, комплементарная исследуемой ДНК), зонд - 5'-FAM-CGACCCCGCCTCTGTTTCACTGCC-BHQ1-3'. Амплификацию проводили по программе из примера 1.

Параллельно с этим проводился анализ наличия последовательности R(5mC)GY в тех же ДНК согласно протоколу прототипа [1]. Праймеры и зонд использовались те же.

На фиг. 2 показаны кривые накопления продукта с метилированных ДНК с течением времени. Сравнение пороговых циклов кривых (Ct Raji (изобретение)=24,27; Ct Raji (прототип)=26,07) показало, что в результате использования предлагаемого способа удалось проанализировать в ~3,5 раза больше последовательностей R(5mC)GY в изучаемой ДНК.

Таким образом, заявляемый способ более простой в реализации, позволяет расширить функциональные возможности, позволяя анализировать ДНК с большей эффективностью, и сокращает время анализа.

1. Способ определения последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК, включающий гидролиз высокоочищенной геномной ДНК метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой Glal, лигирование универсального олигонуклеотидного адаптера с последующей амплификацией в реальном времени с использованием геномного праймера и зонда, комплементарных исследуемой ДНК и гибридного праймера, 3′ конец которого комплементарен 3′ концу ДНК от заданного места гидролиза Glal, а оставшаяся часть комплементарна адаптерной последовательности, и составление заключения о наличии последовательности R(5mC)GY (где 5mC - 5-метилцитозин, R - А или G, Y - Т или С) по появлению флуоресцентного сигнала, отличающийся тем, что в качестве адаптерной последовательности используют универсальный олигонуклеотидный адаптер 5′-CCTGCTCTTTCATCG-3′/3′-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5′, а реакции гидролиза высокоочищенной геномной ДНК, лигирования универсального олигонуклеотидного адаптера и амплификации фрагментов геномной ДНК в реальном времени с использованием праймеров и зонда проводят в единой реакционной смеси с добавлением состава компонентов, обеспечивающих восстанавление S-S связей в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что состав компонентов, обеспечивающих восстанавление S-S связей в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп, содержит β-меркаптоэтанол в концентрации 5-7 мМ, бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрации (100-200) нг/мкл и бетаин в концентрации 0,4-0,6 М.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что для получения единой реакционной смеси берут не менее 0,3 нг исследуемой высокоочищенной геномной ДНК; состав компонентов, обеспечивающих восстанавление S-S связей в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп: β-меркаптоэтанол в концентрации 5-7 мМ, бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрации (100-200) нг/мкл и бетаин в концентрации 0,4-0,6 М; реакционный буфер с рН 9.0: 50 мМ Tris-SO4, 30 мМ KCl, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% Tween-20, (3-5) мМ MgCl2, 0,5 мМ АТФ; 0,2 мМ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов; (400-800) нМ универсального адаптера; смесь геномного и гибридного праймеров и зонда по 0,8 мкМ каждого; (1-3) е.а. метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы Glal; (500-1000) е.а. высокоактивной Т4 ДНК-лигазы; (0,04-0,1) е.а./мкл Hot Start ДНК-полимеразы.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биохимии. Описан способ ПЦР-секвенирования, включающий следующие стадии: получение образца; амплификация; смешивание; фрагментация; секвенирование и сплайсинг.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и молекулярной биологии, и предназначено для диагностики плоскоклеточного рака легкого (ПКРЛ). Осуществляют получение исходной пары образцов ткани от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженной раком ткани, а второй - из прилегающей гистологически нормальной ткани, выделение и очистку препаратов РНК, синтез кДНК на матрице РНК, амплификацию фрагмента гена CALL и сравнение количества амплифицированного фрагмента ДНК CALL для образца, полученного из предположительно пораженной раком ткани, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК для образца, полученного из нормальной ткани.
Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для неинвазивной диагностики колоректального рака. Осуществляют забор и транспортировку образцов стула пациента, выделение из стула пациента общей ДНК и определение целостности ДНК методом ПЦР-анализа.

Группа изобретений относится к области молекулярной биологии и генодиагностики, а именно к синтетическим праймерам, комплементарным высококонсервативной области гена N генома вируса эпизоотической диареи свиней (ЭДС) и способу выявления ЭДС.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются набора синтетических олигонуклеотидных праймеров и способа его использования. Представленный набор включает две пары праймеров, имеющих следующую структуру - FIV F: 5′-AAGAGTCCCAAATATGCCATAGG-3′ и FIV R: 5′-TCCATCCAAATTGCTACTGTTC-3′; FeLV F: 5′-GAATAAACCTCTTGCTGTTTGC-3′ и FeLV R: 5′-AATCAGATCGAATGACAGAGACAC-3′.

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной генетике. Способ предусматривает картирование положений ряда метилированных нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy в протяженной ДНК для построения эпигенетического профиля и выявления аномально метилированных участков ДНК.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению Axl в качестве биомаркера для распознавания наступления эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) у субъекта, где показателем наступления EMT является повышающая регуляция экспрессии Axl.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к влиянию мутаций гена KRAS на восприимчивость к химиотерапии, и может быть использовано в предсказании терапевтического эффекта химиотерапии.

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано при разработке методов молекулярно-генетической диагностики. Заявлен способ селективного отбора целевых участков ДНК.

Изобретение относится к области медицины, в частности к травматологии, и предназначено для прогнозирования нарушения консолидации при переломах костей конечностей.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке. Осуществляют детекцию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с использованием РОСН-анализа, согласно которому РО (зондирующий олигонуклеотид), гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, расщепляется, и детекцию расщепления РО осуществляют, используя гибридизацию с СО (захватывающим олигонуклеотидом). При этом нерасщепленный РО гибридизуется с СО, иммобилизованным на твердой подложке. Конструирование РО и СО является удобной процедурой, и оптимизация реакционных условий обычно осуществляется легко. Когда детекцию сигнала на твердой подложке осуществляют непрерывно вместе с повторением циклов расщепления РО, число расщепленных РО увеличивается по мере повторения числа реакций расщепления, и сигнал изменяется параллельно с изменением числа расщепленных РО. В этом случае детекцию нуклеиновокислотной последовательности-мишени можно осуществить в режиме реального времени. В противоположность этому, в отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени изменения сигнала не наблюдается. Использование изобретений группы позволяет осуществить одновременную детекцию множества нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с использованием метки даже одного типа. 4 н. и 38 з.п. ф-лы, 24 ил., 7 табл., 7 пр.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ, машиночитаемый носитель и система для определения генетической аномалии плода, которая представляет собой анеуплоидию. Из образца периферической крови беременной женщины получают последовательности множества полинуклеотидных фрагментов, соотносят их с хромосомами путем сравнения с референсной геномной последовательностью человека, вычисляют глубину покрытия и GC содержание хромосомы и сравнивают глубину покрытия хромосомы с аппроксимированной глубиной покрытия, где различие между ними указывает на анеуплоидию. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные средства и методы для неинвазивного обнаружения анеуплоидии плода. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 21 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описаны способ прогнозирования раннего снижения вирусной нагрузки у человека, инфицированного вирусом гепатита С (ВГС), в ответ на лечение без применения интерферона, способ выбора длительности лечения без интерферона и способ прогнозирования ответа человека, инфицированного ВГС, на лечение без применения интерферона. Способы предусматривают выявление в образце, полученном от субъекта, нуклеотида, находящегося в положении однонуклеотидного полиморфизма rs12979860, и интерпретацию полученных результатов на основе наличия в данном положении аллелей С или Т. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Представлены варианты молекулы нуклеиновой кислоты, связывающейся с SDF-1. Молекула нуклеиновой кислоты содержит первый фрагмент нуклеотидов, центральную нуклеотидную последовательность и второй фрагмент нуклеотидов, где указанный первый и указанный второй фрагмент нуклеотидов имеют достаточную для гибридизации друг с другом степень обратной комплементарности, и при гибридизации образуется двунитевая структура. Также изобретение относится к применению указанных молекул нуклеиновой кислоты для лечения и профилактики, а также диагностики заболеваний или нарушений, обусловленных повышенным количеством и/или активностью SDF-1. Изобретение позволяет ингибировать хемотаксис, индуцируемый SDF-1. 6 н. и 32 з.п. ф-лы, 40 ил., 16 табл., 15 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и касается набора олигонуклеотидов-праймеров для получения первичной структуры F гена вирусов болезни Ньюкасла класса I. Представленный набор состоит из трех пар олигонуклеотидов, имеющих следующую структуру (5′→3′): Представленные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют ограничивать манипуляции одноступенчатой процедурой проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР). Разработанные праймеры позволяют получить полную информацию о F генах вирусов болезни Ньюкасла, их принадлежности к той или иной генетической линии вируса, наличии нуклеотидных/аминокислотных замен в геноме патогена. Изобретение может быть использовано в диагностических целях идентификации вируса болезни Ньюкасла в вирусологии и ветеринарии, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению данного вируса. 1 ил., 2 табл., 3 пр.
Изобретение относится к области медицины, в частности к хирургии, и предназначено для дифференциации природы происхождения рецидивных кист при цистном эхинококкозе. Осуществляют выделение ДНК из клеток герминативного слоя оболочки первичной и рецидивной эхинококковых кист. Методом полимеразной цепной реакции получают фрагменты маркерного участка гена cox1 Е. granulosus. Проводят анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. При обнаружении сходства длин рестрикционных фрагментов первичной и рецидивной эхинококковых кист устанавливают, что рецидивная киста имеет имплантационную природу происхождения. При нахождении различий устанавливают резидуальную или реинвазивную причину возникновения рецидивной кисты. Изобретение обеспечивает получение новых критериев дифференциации природы происхождения послеоперационных рецидивов цистного эхинококкоза. 2 пр.

Изобретение относится к области медицины и касается способа прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ) с неэффективной консервативной терапией у лиц русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ. Сущность способа заключается в том, что производят выделение ДНК из периферической венозной крови. Проводят анализ полиморфизмов генов TNFα(-308G/A TNFα) и осуществляют прогнозирование риска развития ПОУГ с неэффективной консервативной терапией в зависимости от выявленных вариантов по локусу -308G/A TNFα и других предикторов развития данного заболевания по уравнению:P=еy/(1+еy), (1) где «е» - математическая константа, равная 2,72; а «у» рассчитывается по уравнению логистической регрессии: у=15-0,099x1+1,232x2-0,099x3+0,091x4-1,292x5-1,825x6-0,911x7, (2) где x1 - возраст, лет; x2 - наличие сердечно-сосудистых заболеваний: нет - x2=0, да - x2=1; x3 - уровень систолического артериального давления, в мм рт.ст.; x4 - уровень диастолического артериального давления, в мм рт.ст.; x5 - наличие ПОУГ у родственников: нет - x5=0, да - x5=1; x6 - наличие сопутствующей патологии глаз: нет - x6=0, да - x6=1; x7 - генетический вариант по локусу -308G/A TNFα:для варианта AA- x7=1, для варианта AG- x7=2, для варианта GG- x7=3. В случае, если Р больше 60 - прогнозируют риск развития ПОУГ с неэффективной консервативной терапией, если Р меньше 40 - прогнозируют эффективность консервативной терапии ПОУГ, если Р больше 40, но меньше 60 - необходимо более тщательное динамическое наблюдение. 2 ил., 3 пр.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития хронического калькулезного холецистита (ХКХ). У женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России, осуществляют забор крови, выделение ДНК и анализ полиморфизмов генов интерлейкинов. В случае выявления генетического варианта -511Т IL-1В, либо сочетания аллелей и генотипов -889ТT IL-1А, -511Т IL-1В и -113Т IL-9, либо сочетания аллелей и генотипов -511Т IL-1В и -113ТТ IL-9, либо сочетания аллелей -511Т IL-1B, -113Т IL-9, -592C IL-10 и -251Т IL-8, либо сочетания аллелей -511Т IL-1B, -703Т IL-5 и -584C IL-4 прогнозируют повышенный риск развития ХКХ. В случае выявления сочетания аллелей -889С IL-1А, -511С IL-1B и -703С IL-5, либо сочетания аллелей -511C IL-1B и -703С IL-5 прогнозируют низкий риск развития ХКХ. Изобретение обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития ХКХ у женщин. 8 ил., 7 пр.

Изобретение относится к области медицинской диагностики. Предложен способ прогнозирования характера поражения желчного пузыря у женщин, больных хроническим калькулезным холециститом, русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России. В случае выявления сочетания генотипов -889ТТ и -889СТ IL-1A либо генотипа -174СС IL-6 прогнозируют образование крупного диаметра камня, а в случае выявления генотипа -584СС IL-4 прогнозируют увеличение толщины стенки желчного пузыря более 4 мм. Изобретение обеспечивает эффективное прогнозирование характера поражения желчного пузыря у женщин, больных хроническим калькулезным холециститом. 6 ил., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для оценки индивидуального генетического риска атеросклероза. Осуществляют взятие крови, выделение ДНК и генотипирование митохондриальной ДНК. Наличие варианта A1811G свидетельствует о высоком генетическом риске. Наличие вариантов Т204С, G8251A, Т10238С, G12501A свидетельствует о низком генетическом риске. Изобретение обеспечивает повышение точности диагностики предрасположенности к атеросклерозу.
Наверх