Способ и набор реагентов для выявления полиморфизмов в генах lingo1, lingo2 и slc1a2, определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к неврологии и молекулярной биологии. Предложены способ и набор реагентов для выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках rs9652490 LINGO1 (A>G), rs11856808 LINGO1 (C>Т), rs10968280 LINGO2 (А>Т), rs7033345 LINGO2 (C>Т), rs1412229 LINGO2 (А>Т), rs10812774 LINGO2 (C>Т) и rs3794087 SLC1A2 (А>С), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором. Предложенная группа изобретений обеспечивает высокую специфичность и сокращение сроков идентификации олигонуклеотидных полиморфизмов за счет возможности в мультиплексном формате в одной постановке оценивать семь однонуклеотидных полиморфных маркеров. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 21 ил., 19 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2, ассоциациированных с мультифакториальным заболеванием - эссенциальным тремором посредством проведения медико-генетического анализа одновременно нескольких однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в этих генах.

Эссенциальный тремор является наиболее распространенным двигательным заболеванием нервной системы, нейродегенеративная природа которого доказывается рядом последних работ. Распространенность заболевания по некоторым данным может достигать 13%. Эссенциальный тремор представляет собой неуклонно прогрессирующее заболевание, приводящее к значительным трудностям в профессиональной деятельности, а затем и в самообслуживании. На молекулярно-генетическом уровне показана высокая гетерогенность этого заболевания, однако до настоящего времени, несмотря на бурное развитие молекулярно-генетических технологий, генетическая структура эссенциального тремора комплексно не определена и непосредственная ДНК-диагностика болезни пока не проводится.

Для эссенциального тремора характерна длительная доклиническая стадия, на которой возможно проведение профилактических мероприятий, предотвращающих их развитие. В свете вышеперечисленного диагностика предрасположенности к развитию такого нейродегенеративного заболевания имеет социальную значимость.

На сегодняшний день не выявлено патогенных мутаций приводящих к эссенциальному тремору, считается что комплекс генетических факторов риска приводит к развитию заболевания. При отборе генетических факторов риска развития эссенциального тремора, мы основывались на анализе результатов работ по выявлению ассоциаций между генетическими вариантами полиморфизмов и развитием заболевания. Так мета-анализ двух исследований полногеномного скрининга ассоциаций (genome-wide association study, GWAS), позволяющих осуществлять тотальный скрининг вариабельных однонуклеотидных участков генома, выявил высокую ассоциацию полиморфизмов в генах SLC1A2 (rs3794087) и LINGO1 (rs9652490), а также в меньшей мере полиморфизма rs11856808 в гене LINGO1 с эссенциальным тремором (Kuhlenbaumer G., Hopflner F. et al. Genetics of essential tremor // Neurology 2014; 18: 1000-1007). В целом ряде работ по изучению ассоциации полиморфизма rs9652490 в гене LINGO1 с эссенциальным тремором в различных европейских популяциях было показано статистически значимое увеличение риска развития заболевания связанное с наличием этого поиморфизма (Thier S, Lorenz D, Nothnagel M, et al. LINGO1 polymorphisms are associated with essential tremor in Europeans. Mov Disord 2010; 25: 709-715; Vilarino-Guell C, Ross OA, Wider C, et al. LINGO1 rs9652490 is associated with essential tremor and Parkinson disease. Parkinsonism Relat Disord2010; 16: 109-111; Clark LN, Park N, Kisselev S, Rios E, Lee JH, Louis ED. Replication of the LINGO1 gene association with essential tremor in a North American population. Eur J Hum Genet 2010; 18: 838-843). Надо отметить, что в китайской популяции не было вывлено достоверной ассоциации полиморфизма rs9652490 в гене LINGO1 с эссенциальным тремором (Zuo X, Jiang Н, Guo JF, et al. Screening for two SNPs of LINGO1 gene in patients with essential tremor or sporadic Parkinson's disease in Chinese population. Neurosci Lett 2010; 481: 69-72), что подтверждает гипотезу существования популяционно-специфичных различий и усиливает значимость расширенных популяционных исследований.

Мультицентровое исследование популяций Северной Америки помимо ассоциации выше перечисленных полиморфизмов с риском развития эссенциального тремора, выявило еще ряд полиморфизмов в гене LINGO2, влияющих в той или иной степени на развитие заболевания (Vilarino-Guell С, Wider С, Ross OA, et al. LINGO1 and LINGO2 variants are associated with essential tremor and Parkinson disease. Neurogenetics 2010; 11: 401-408).

Анализ результатов полногеномных исследований и собственные исследования, позволили отобрать семь однонуклеотидных полиморфизмов: rs9652490, rs11856808 в гене LINGO1 (15q24); rs1412229, rs10968280, rs10812774, rs7033345 в гене LINGO2 (9p21) и rs3794087 в гене SLC1A2 (11p13) (см. таблицу 1), проявивших наибольшую генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором и разработать набор реагентов для выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2 (гены-кандидаты), который в дальнейшем позволит провести мутационный скрининг эссенциального тремора, а так же ляжет в основу ДНК-диагностики этого заболевания.

Наиболее экономичным, быстрым и доступным методом анализа полиморфизмов (SNP) в настоящее время является ПЦР в «режиме реального времени», однако в обычном формате, на современных амплификаторах (термоциклерах) можно проанализировать в мультиплексе только два полиморфизма, так как имеется только четыре оптических канала детекции флуоресцентного сигнала и следовательно можно использовать только четыре флуоресцентно-меченных зонда, соответственно два для дикого аллеля и два для мутантного (для двух полиморфизмов). Примененная нами модификация позволяет анализировать до восьми полиморфизмов в мультиплексном формате, за счет разных температур плавления ампликонов с зондами, меченными одной и той же флуоресцентной меткой, а именно на одном оптическом канале, без потери специфичности и чувствительности можно детектировать сразу четыре ампликона. В разработанном нами наборе анализируется семь полиморфизмов.

Технический результат заявленного изобретения заключается в высокой специфичности набора и способа выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2 за счет использования оригинальных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, а также оригинальных условий и протокола проведения полимеразной цепной реакции и последующего плавления продуктов реакции с флуоресцентно-меченными зондами. И в ускорении и удешевлении идентификации олигонуклеотидных полиморфизмов за счет возможности в мультиплексном формате в одной постановке сразу оценивать до восьми однонуклеотидных полиморфных маркеров (SNP).

Технический результат достигается тем, что создан набор реагентов для выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках генов LINGO1 (rs9652490, rs11856808), LINGO2 (rs10968280, rs7033345, rs1412229, rs10812774) и SLC1A2 (rs3794087), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором, который включает следующие компоненты: 50 мМ KCl, 15 мМ Tris-HCl с рН 8,8, 0,5% глицерол, 0,1% Tween 20, 6,25 мМ MgCl2, 250 мкМ дезоксинуклеотиды (dNTP) и 0,2 ед/мкл термостабильной ДНК-полимеразы с вытесняющей активностью, при этом все компоненты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции за исключением ДНК-полимеразы смешаны в одном объеме вместе с 7 парами олигонуклеотидных праймеров, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции - SEQ ID №: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21 в концентрациях, обеспечивающих ассиметричное накопление цепей ДНК, и 7 олигонуклеотидными зондами, меченными флуоресцентными метками на 5'-конце и гасителями на 3'-конце: зонд SEQ ID №1 с меткой FAM и гасителем RTQ1; зонды SEQ ID №4 и 19 с меткой Су5 и гасителем BHQ2; зонд SEQ ID №7 с меткой R6G и гасителем BHQ2; зонды SEQ ID №10 и 16 с меткой ROX и гасителем BHQ2; зонд SEQ ID №13 с меткой R6G и гасителем BHQ1.

Технический результат достигается также за счет способа выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках генов LINGO1 (rs9652490, rs11856808), LINGO2 (rs10968280, rs7033345, rs1412229, rs 10812774) и SLC1A2 (rs3794087), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором, включающий выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции, путем начального плавления и ряда циклов амплификации, состоящих из денатурации ДНК, отжига и синтеза, при этом проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию с использованием 7-ми пар олигопраймеров и 7-ми олигонуклеотидных флуоресцентно-меченных зондов, охарактеризованных в п. 1, при этом концентрации прямых и обратных праймеров подобраны так, чтобы происходило ассиметричное накопление одной из цепей ДНК комплементарной соответствующему детектирующему флуоресцентно-меченному зонду, при следующих условиях: начальное плавление ДНК проводят в течение 3 минут при температуре 92°C, далее проводят 40 циклов амплификации, включающие денатурацию при 92°C в течение 15 секунд, отжиг и синтез при температуре 63°C в течение 40 секунд, причем амплификацию проводят с термостабильной полимеразой с вытесняющей активностью, затем осуществляют плавление продуктов полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными флуоресцентно-меченными зондами в температурном диапазоне от 20 до 95°C с шагом 0,5°C и временем задержки на каждом шаге в 1 секунду, при этом на каждом шаге проводят измерение флуоресцентного сигнала по каналам детекции всех меток FAM, R6G, ROX, Су5 для построения кривых плавления продукта и идентификации олигонуклеотидных полиморфизмов, основанную на изменении температуры плавления продукта ПЦР в зависимости от того какой аллельный вариант полиморфизма присутствует в образце ДНК.

При создании набора особое значение придавали выбору праймеров. Так как для создания высокоспецифичных мультиплексных систем требуется сочетание праймеров с определенными характеристиками (отсутствие внутренних вторичных структур).

Олигонуклеотидные праймеры и зонды выбраны с помощью программы «Primer3» и проверены на специфичность с помощью программы «Primer-BLAST».

При подборе праймеров, для повышения специфичности ПНР были соблюдены следующие критерии:

- размер праймера соответствовал 16-25 нуклеотидам;

- температура отжига всех праймеров была одинакова (58-62°C)

- разница в температуре плавления праймеров составляла не более 2 градусов;

- область отжига праймеров находилась вне зон полиморфизмов;

- суммарное количество GC-оснований соответствовало 50-60%;

- для улучшения качества отжига последние несколько нуклеотидов 3'-конца

праймера содержали GC-основания;

- отсутствовала внутренняя вторичная структура (праймеры не должны быть само- и взаимнокомплиментарными);

- отсутствовали комплементарности между 3'-концами (чтобы не образовывались праймер-димеры).

Для идентификации каждого однонуклеотидного полиморфизма были выбраны два праймера (прямой и обратный) и один флуоресцентно-меченный зонд (см. таблица 2).

Кроме того набор содержал следующие реагенты: 50 мМ КСl, 15 мМ Tris-HCl с рН 8,8, 0,5% глицерол, 0,1% Tween 20, 6,25 мМ MgCl2, 250 мкМ дезоксинуклеотиды (dNTP) и 0,2 ед/мкл термостабильной ДНК-полимеразы с вытесняющей активностью.

Причем все реагенты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции за исключением ДНК-полимеразы были смешаны в одном объеме вместе с 7-ю парами олигонуклеотидных праймеров - SEQ ID №: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21 в концентрациях, обеспечивающих ассиметричное накопление цепей ДНК, и 7-ю олигонуклеотидными зондами, меченными флуоресцентными метками на 5'-конце и гасителями на 3'-конце: зонд SEQ ID №1 с меткой FAM и гасителем RTQ1; зонды SEQ ID №4 и 19 с меткой Су5 и гасителем BHQ2; зонд SEQ ID №7 с меткой R6G и гасителем BHQ2; зонды SEQ ID №10 и 16 с меткой ROX и гасителем BHQ2; зонд SEQ ID №13 с меткой R6G и гасителем BHQ1.

Способ выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2, определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором состоит из 4 этапов и осуществляется следующим образом.

Этап I. Выделение ДНК по стандартному протоколу.

Этап II. Проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции с использованием 7-ми пар олигонуклеотидных праймеров и 7-ю олигонуклеотидными флуоресцентно-меченными зондами в 25 мкл смеси для ПЦР (см. таблица 3).

Концентрации олигонуклеотидных праймеров (см. таблица 2) подобраны так, чтобы происходило ассиметричное накопление одной из цепей ДНК (комплементарной детектирующим флуоресцентно-меченным зондам). При этом начальную денатурацию (плавление) ДНК проводят в течение 3 минут при температуре 92°C. Далее проводят 40 циклов амплификации, включающие денатурацию при 92°C в течение 15 секунд, отжиг и синтез при температуре 63°C в течение 40 секунд. Для этапа амплификации используется термостабильная полимераза с вытесняющей активностью, что позволяет избежать разрушения олигонуклеотидных зондов.

Этап III. Плавление продукта полимеразной цепной реакции, полученного на этапе II, с олигонуклеотидными зондами, которые мечены флуорофорами и гасителями флуоресценции. Проводится плавление в температурном диапазоне от 20 до 95°C с шагом 0,5°C и временем задержки на каждом шаге 1 секунда. При этом на каждом шаге проводят измерение флуоресцентного сигнала по каналам детекции красителей FAM, R6G, ROX, Су5 для построения кривых плавления продукта. Этапы II и III могут быть совмещены в одной программе (см. таблица 4).

Этап VI. Анализ полученных кривых плавления по заданному протоколу (см. фиг. 1-7).

Идентификация полиморфизма для каждого SNP основана на изменении температуры плавления продукта ПЦР в зависимости от того какой аллельный вариант полиморфизма присутствует в образце ДНК. При анализе кривых плавления нужно руководствоваться величинами температур плавления трех положительных контролей (ПКО): ПКО1 - гомозигота дикого аллеля; ПКО2 - гетерозигота; ПКО3-гомозигота минорного аллеля, для каждого полиморфизма, на соответствующем из четырех каналов (FAM, HEX, ROX, Су5):

Канал FAM: rs9652490 (LINGO1) (см. фиг. 1)

(FAM)-cttcctcccCgcctagcttcactct-(RTQ 1)

Канал HEX: rs10968280 (LINGO2) (см. фиг. 2)

(R6G)-aaaagtgatggaattgTatttgata-(BHQ2)

Канал ROX: rs7033345 (LINGO2) (см. фиг. 3)

(ROX)-agcaaaCgtacacag-(BHQ2)

Канал Су5: rs11856808 (LINGO1) (см. фиг. 4)

(Cy5)-ttgttagaacaCgttt-(BHQ2)

Канал Су5: rs3794087 (SLC1A2) (см. фиг. 5)

(Cy5)-taggttgaCagttggctttggttcc-(BHQ2)

Канал ROX: rs10812774 (LINGO2) (см. фиг. 6)

(ROX)-ataatTtactgactgagttccgttt-(BHQ2)

Канал HEX: rs1412229 (LINGO2) (см. фиг. 7)

(R6G)-tgcaAatattttagt-(BHQ1)

В результате проведенного исследования установлено, что выбранные праймеры и зонды для выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках генов LINGO1 (rs9652490, rs11856808), LINGO2 (rs10968280, rs7033345, rs1412229, rs10812774) и SLC1A2 (rs3794087), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов обладают высокой специфичностью и обеспечивают ускорение и удешевление идентификации олигонуклеотидных полиморфизмов за счет возможности в мультиплексном формате в одной постановке сразу оценивать до восьми однонуклеотидных полиморфных маркеров (SNP).

Пример.

Из 56 образцов цельной крови от пациентов с диагнозом эссенциальный тремор и из 36 образцов цельной крови от пациентов с диагнозом болезнь Паркинсона (группа сравнения) была выделена геномная ДНК с помощью набора для выделения Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega USA). С помощью разработанного набора реагентов проведена ПЦР-наработка ампликонов в мультиплексном формате с последующим плавлением продукта реакции на амплификаторе CFX-96 "REAL TIME" (Bio-Rad США), с помощью объединенной программы. Анализ полученных кривых проведен с помощью программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager 3.0 и представлен на фигурах 8-14 и в таблицах 5-11.

На фигуре 8А и Б и таблице 5 представлен анализ кривых плавления для rs9652490 LINGO1 (канал FAM). На фигуре А показаны кривые плавления (по вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, по горизонтальной оси температура), на фигуре Б-дифференциальный анализ кривых плавления (по вертикальной оси - производная кривой интенсивности флуоресценции, по горизонтальной оси температура).

В таблице 5 представлены результаты анализа кривых плавления для rs9652490 LINGO1.

На фигуре 9А, Б и таблице 6 представлен анализ кривых плавления для rs10968280 LINGO2 (канал HEX). На фигуре А - показаны кривые плавления (по вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, по горизонтальной оси температура), на фигуре Б - дифференциальный анализ кривых плавления.

В таблице 6 представлены результаты анализа кривых плавления для rs10968280 LINGO2.

На фигуре 10 А, Б ив таблице 7 представлен анализ кривых плавления для rs7033345 LINGO2 (канал ROX). На фигуре А показаны кривые плавления (по вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, по горизонтальной оси температура), на фигуре Б-дифференциальный анализ кривых плавления.

В таблице 7 представлены результаты анализа кривых плавления для rs7033345 LINGO2.

На фигуре 11А, Б и таблице 8 представлен анализ кривых плавления для rs11856808 LINGO1 (канал Су5). На фигуре А показаны кривые плавления (по вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, по горизонтальной оси температура), на фигуре Б - дифференциальный анализ кривых плавления.

В таблице 8 представлены результаты анализа кривых плавления для rs1 1856808 LINGO1.

На фигуре 12А, Б и таблице 9 представлен анализ кривых плавления для rs1412229 LINGO2 (канал HEX). На фигуре А показаны кривые плавления (по вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, по горизонтальной оси температура), на фигуре Б-дифференциальный анализ кривых плавления.

В таблице 9 представлены результаты анализа кривых плавления для rs1412229 LINGO2.

На фигуре 13А, Б и в таблице 10 представлен анализ кривых плавления для rs10812774 LINGO2 (канал ROX). На фигуре А показаны кривые плавления (по вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, по горизонтальной оси температура), на фигуре Б - дифференциальный анализ кривых плавления.

В таблице 10 представлены результаты анализа кривых плавления для rs10812774 LINGO2.

На фигуре 14А, Б и в таблице 11 представлен анализ кривых плавления для rs3794087 SLC1A2 (канал Су5). На фигуре А показаны кривые плавления (по вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, по горизонтальной оси температура), на фигуре Б - дифференциальный анализ кривых плавления.

В таблице 11 представлены результаты анализа кривых плавления для rs3794087 SLC1A2.

В таблице 12 приведены суммированные результаты анализа 92 образцов ДНК по 7 полиморфизмам (белый фон - гомозиготы дикого типа; светло серый фон - гетерозиготы; темно серый фон - гомозиготы мутантного типа)

1. Набор реагентов для выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках: rs9652490 в гене LINGO1 (A>G), rs11856808 в гене LINGO1 (C>Т), rs10968280 в гене LINGO2 (А>Т), rs7033345 в гене LINGO2 (C>Т), rs1412229 в гене LINGO2 (А>Т), rs10812774 в гене LINGO2 (C>Т) и rs3794087 в гене SLC1A2 (А>С), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором, включающий компоненты: 50 мМ KCl, 15 мМ Tris-HCl с рН 8,8, 0,5% глицерол, 0,1% Tween 20, 6,25 мМ MgCl2, 250 мкМ дезоксинуклеотиды (dNTP) и 0,2 ед/мкл термостабильную ДНК-полимеразу с вытесняющей активностью, при этом все компоненты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции за исключением ДНК-полимеразы смешаны в одном объеме вместе с 7 парами олигонуклеотидных праймеров, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции - SEQ ID №: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21 в концентрациях, обеспечивающих ассиметричное накопление цепей ДНК, и 7 олигонуклеотидными зондами, меченными флуоресцентными метками на 5'-конце и гасителями на 3'-конце: зонд SEQ ID №1 с меткой FAM и гасителем RTQ1; зонды SEQ ID №4 и 19 с меткой Су5 и гасителем BHQ2; зонд SEQ ID №7 с меткой R6G и гасителем BHQ2; зонды SEQ ID №10 и 16 с меткой ROX и гасителем BHQ2; зонд SEQ ID №13 с меткой R6G и гасителем BHQ1.

2. Набор по п. 1, отличающийся тем, что олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд, прямой и обратный праймеры используют на одну реакцию в следующих количественных соотношениях в pmol: зонд SEQ ID №1, прямой праймер SEQ ID №:2, обратный праймер SEQ ID №:3 - 5:5:1 соответственно, зонд SEQ ID №13, прямой праймер SEQ ID №:14, обратный праймер SEQ ID №:15 - 5:5:1 соответственно; зонд SEQ ID №4, прямой праймер SEQ ID №:5, обратный праймер SEQ ID №:6 - 5:1:5 соответственно, зонд SEQ ID №7, прямой праймер SEQ ID №:8, обратный праймер SEQ ID №:9 - 5:1:5 соответственно, зонд SEQ ID №10, прямой праймер SEQ ID №:11, обратный праймер SEQ ID №:12 - 5:1:5 соответственно, зонд SEQ ID №16, прямой праймер SEQ ID №:17, обратный праймер SEQ ID №:18 - 5:1:5 соответственно и зонд SEQ ID №19, прямой праймер SEQ ID №:20, обратный праймер SEQ ID №:21 - 5:1:5 соответственно.

3. Способ выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках: rs9652490 в гене LINGO1 (A>G), rs11856808 в гене LINGO1 (C>Т), rs10968280 в гене LINGO2 (А>Т), rs7033345 в гене LINGO2 (C>Т), rs1412229 в гене LINGO2 (А>Т), rs10812774 в гене LINGO2 (C>Т) и rs3794087 в гене SLC1A2 (А>С), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором, включающий выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции путем начального плавления и ряда циклов амплификации, состоящих из денатурации ДНК, отжига и синтеза, отличающийся тем, что проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию с использованием набора реагентов по п. 1, при этом концентрации прямых и обратных праймеров подобраны так, чтобы происходило ассиметричное накопление одной из цепей ДНК комплементарной соответствующему детектирующему флуоресцентно-меченному зонду, при следующих условиях: начальное плавление ДНК проводят в течение 3 минут при температуре 92°С, далее проводят 40 циклов амплификации, включающих денатурацию при 92°С в течение 15 секунд, отжиг и синтез при температуре 63°С в течение 40 секунд, причем амплификацию проводят с термостабильной полимеразой с вытесняющей активностью, затем осуществляют плавление продуктов полимеразной цепной реакции, с соответствующими олигонуклеотидными флуоресцентно-меченными зондами, в температурном диапазоне от 20 до 95°С с шагом 0,5°С и временем задержки на каждом шаге в 1 секунду, при этом на каждом шаге проводят измерение флуоресцентного сигнала по каналам детекции всех меток FAM, R6G, ROX, Су5 для построения кривых плавления продукта и идентификации олигонуклеотидных полиморфизмов, основанную на изменении температуры плавления продукта ПЦР в зависимости от того, какой аллельный вариант полиморфизма присутствует в образце ДНК, а именно для полиморфизма rs9652490 в гене LINGO1: АА, AG или CG; для полиморфизма rs11856808 в гене LINGO1: СС, СТ или ТТ; для полиморфизма rs10968280 в гене LINGO2: ТТ, ТА или АА, для полиморфизма rs7033345 в гене LINGO2: ТТ, ТС или СС; для полиморфизма rs1412229 в гене LINGO2: АА, ТА или ТТ, для полиморфизма rs10812774 в гене LINGO2: ТТ, ТС или СС, для полиморфизма rs3794087 в гене SLC1A2: СС, АС или АА, где в случае выявления аллеля G rs9652490 в гене LINGO1 (A>G), A rs10968280 в гене LINGO2 (А>Т), С rs7033345 в гене LINGO2 (C>Т), Т rs11856808 в гене LINGO1 (C>Т), А rs3794087 в гене SLC1A2 (А>С), С rs10812774 в гене LINGO2 (C>Т) и Т rs1412229 в гене LINGO2 (А>Т) определяют генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.

Настоящее изобретение касается способа предварительной оценки, будет ли терапевтическое средство, выбранное из группы полипептид, антитело или иммуноадгезин, иметь необходимую скорость выведения у яванского макака, человека.

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин и предназначено для определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в сырье.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения риска развития артериальной гипертензии. Осуществляют забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени и определение инсерции/делеции (I- и D-аллели) Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики острого лимфобластного лейкоза у пациента, включающий выявление признаков лейкоза, тестирование клеток крови на лейкоз, инкубирование клеток крови фактором, идуцирующим лейкоз, с тем, чтобы индуцировать экспрессию клеточных поверхностных маркеров, которые являются признаком лейкоза, где фактор, индуцирующий лейкоз - это супернатант Aspergillus flavus, EBV-инфицированный CCL87 супернатант, очищенная EBV культура или их комбинации.

Изобретение относится к биологи и медицине, а именно к иммуноанализу, в частности к электрохимическим способам определения содержания вирусов/антигенов вирусов кори.

Изобретение относится к медицине и описывает способ идентификации модуляторов активности фермента катехол-O-метилтрансферазы (СОМТ), включающий а) получение 4-нитрокатехола, ковалентно связанного с Alexa Fluor® 488, б) приведение в контакт молекулы из этапа а) с ферментом катехол-O-метилтрансферазой (COMT), S-аденозилметионином (SAM) и соединением-кандидатом и в) измерение показателей флуоресценции смеси из этапа б), в котором измененные показатели флуоресценции в присутствии соединения-кандидата по сравнению с контролем являются признаком наличия модулятора фермента катехол-O-метилтрансферазы (COMT).

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины и предназначено для обнаружения модифицированных нуклеотидов в составе РНК. Осуществляют подбор подходящей для исследуемой области РНК пары олигонуклеотидных зондов, подбор пары донора и тушителя флуоресценции с подходящими оптическими свойствами.

Изобретение относится к способам определения эффективности лиганда ионного канала. Ex vivo способ определения эффективности лиганда ионного канала in vivo в зависимости от присутствия плазмы, включает стадии: a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с i) плазмой животного и ii) лигандом ионного канала и b) определение эффекта лиганда ионного канала на клетку, или a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с i) плазмой животного и ii) соединением, которое определяют как лиганд ионного канала, и b) определение эффекта соединения на клетку, или a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с плазмой животного, которому был введен лиганд ионного канала, и b) определение эффекта лиганда ионного канала на клетку.

Изобретение относится к способу маркировки парных спиральных филаментов (PHF), включающему взаимодействие PHF с соединением и детектирование присутствия указанного соединения, где соединение имеет формулу , в которой -R- означает , -Q- выбран из: -NHC(O)-, -N=N-, -CH=CH-; -P выбран из: ; -T выбран из: ; X представляет собой N или CH; -W1-6, -G1-4, -Р1-5 являются такими, как указано в формуле изобретения.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая композицию для реакции обратной транскрипции с горячим стартом, способ подготовки вышеуказанной композиции, композицию для ПЦР с обратной транскрипцией и горячим стартом, способ подготовки вышеуказанной композиции, набор для реакции обратной транскрипции с горячим стартом, который включает в себя композицию для реакции обратной транскрипции с горячим стартом и реакционную пробирку, набор для ПЦР с обратной транскрипцией и горячим стартом, способ обратной транскрипции РНК-матрицы, способ амплификации нуклеиновой кислоты, композицию ПЦР с обратной транскрипцией для диагностики злокачественного новообразования.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения зиготности гена fad-3c в растении канолы. Также раскрыт набор для осуществления указанного способа.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метелирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР и способ идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метилирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к способу диагностики заболеваний, сопровождающихся повышенной гибелью клеток, и набору для его осуществления.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии, и предназначено для ранней диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН).

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.

Изобретение относится к области биомедицины и касается способа диагностирования острого повреждения почек и применения in vitro набора, содержащего праймеры, необходимые для выполнения способа.

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ профилактики африканской чумы свиней, включающий выявление животных с инфекционным заболеванием на начальной стадии развития, убой больных и дальнейшее обследование остальных животных.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая способ выявления РНК и ДНК из сухих биологических образцов и набор для выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий плода, включающий выделение внеклеточной ДНК (вкДНК) из образца крови, полученной у беременной женщины, выбор регионов генома для проведения амплификации, приготовление геномных библиотек, картирование полученных последовательностей на референсный геном или части генома человека с определением их координат, определение значения покрытия для каждого региона генома, характеризующегося открытостью хроматина между плацентой и клетками крови матери, отличающейся не менее чем на 20%, и получение регионов генома с указанной открытостью хроматина, после чего делается вывод о наличии анеуплоидий плода.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана композиция для стандартизации эффективности амплификации набора олигонуклеотидных праймеров для амплификации перестроенных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих один или более рецепторов адаптивной иммунной системы в биологическом образце, полученном из лимфоидных клеток субъекта-млекопитающего, причем каждый рецептор адаптивной иммунной системы содержит вариабельный участок и соединительный участок, причем композиция содержит: множество синтетических матричных олигонуклеотидов, причем каждый синтетический матричный олигонуклеотид имеет известную концентрацию до амплификации и олигонуклеотидную последовательность общей формулы: , причем: (а) V представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 20 и не более 1000 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей вариабельный (V) участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент, и каждый V содержит уникальную олигонуклеотидную последовательность V-участка; (b) J представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 15 и не более 600 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей соединительный (J) участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент, и каждый J содержит уникальную олигонуклеотидную последовательность J-участка; (с) U1 либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотидную последовательность, выбранную из (i) первой универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера и (ii) первой специфической для секвенирующей платформы олигонуклеотидной последовательности, которая связана с положением 5' и находится в нем относительно первой универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера; (d) U2 либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотидную последовательность, выбранную из (i) второй универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера и (ii) второй специфической для секвенирующей платформы олигонуклеотидной последовательности, которая связана с положением 5' и находится в нем относительно второй универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера; (e) присутствует по меньшей мере один из B1, В2, В3 и В4 и каждый из B1, В2, В3 и В4 содержит олигонуклеотид В, содержащий последовательность штрихкода из 3-25 последовательных нуклеотидов, которая уникальным образом идентифицирует в качестве спаренной комбинации, (i) уникальную олигонуклеотидную последовательность V-участка из (а) и (ii) уникальную олигонуклеотидную последовательность J-участка из (b); (f) R либо отсутствует, либо содержит сайт распознавания рестрикционного фермента, который содержит олигонуклеотидную последовательность, отсутствующую в (а)-(е); и причем: (g) множество синтетических матричных олигонуклеотидов содержит количество по меньшей мере а или по меньшей мере b уникальных олигонуклеотидных последовательностей в зависимости от того, какое значение больше, причем а представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего V-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта, а b представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего J-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта, и композиция содержит по меньшей мере один синтетический матричный олигонуклеотид для каждой уникальной олигонуклеотидной последовательности V-участка и по меньшей мере один синтетический матричный олигонуклеотид для каждой уникальной олигонуклеотидной последовательности J-участка. Также заявлен способ количественного определения множества перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих один или множество рецепторов адаптивной иммунной системы в биологическом образце. 2 н. и 25 з.п. ф-лы, 14 ил., 17 табл., 12 пр.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к неврологии и молекулярной биологии. Предложены способ и набор реагентов для выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках rs9652490 LINGO1, rs11856808 LINGO1, rs10968280 LINGO2, rs7033345 LINGO2, rs1412229 LINGO2, rs10812774 LINGO2 и rs3794087 SLC1A2, определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором. Предложенная группа изобретений обеспечивает высокую специфичность и сокращение сроков идентификации олигонуклеотидных полиморфизмов за счет возможности в мультиплексном формате в одной постановке оценивать семь однонуклеотидных полиморфных маркеров. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 21 ил., 19 табл., 1 пр.

Наверх