Способ анализа соматических мутаций в генах braf, nras и kit с использованием lna-блокирующей мультиплексной пцр и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом)



Способ анализа соматических мутаций в генах braf, nras и kit с использованием lna-блокирующей мультиплексной пцр и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом)
Способ анализа соматических мутаций в генах braf, nras и kit с использованием lna-блокирующей мультиплексной пцр и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом)
Способ анализа соматических мутаций в генах braf, nras и kit с использованием lna-блокирующей мультиплексной пцр и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом)
Способ анализа соматических мутаций в генах braf, nras и kit с использованием lna-блокирующей мультиплексной пцр и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом)
Способ анализа соматических мутаций в генах braf, nras и kit с использованием lna-блокирующей мультиплексной пцр и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом)
G01N2035/00158 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2674338:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) (RU)

Изобретение относится к области генетики, молекулярной биологии и медицины. Предложен способ выявления соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT. Проводят амплификацию фрагментов генов BRAF, NRAS и KIT с помощью LNA-блокирующей мультиплексной «гнездовой» ПЦР. Используют биочип для идентификации соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT и гибридизацию меченого ПЦР-продукта на биочипе. Регистрируют результаты гибридизации. Изобретение обеспечивает создание способа определения соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT, влияющих на чувствительность меланомы к таргетной терапии. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области генетики, молекулярной биологии и медицины и касается способа определения чувствительности меланомы к таргетной терапии посредством анализа клинически значимых соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT с помощью технологии LNA-блокирующей мультиплексной ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом).

Уровень техники

Известно большое количество способов определения соматических мутаций, в которых используются различные инструменты для анализа уникальной нуклеотидной последовательности ДНК человека. Условно среди них можно выделить шесть групп:

- Ферментативные методы:

анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP);

анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP);

расщепление клевазой (CFLP);

расщепление резольвазой (EMD);

анализ, основанный на лигазной реакции (LDR, LCR);

ПЦР, обогащенная мутантной последовательностью;

PNA-блокирующая ПЦР в реальном времени (PNA-clamp PCR);

LNA-блокирующая ПЦР в реальном времени (LNA-clamp PCR);

ПЦР с прямой терминацией синтеза (DT-PCR);

аллель-специфическая ПЦР (AS-PCR, PCR-SSP);

SMart-амплификация;

амплификация рефрактерной мутационной системы (ARMS/Scorpion real-time PCR);

PNA-LNA-блокирующая ПЦР в реальном времени (PNA-LNA-clamp PCR);

Цифровая капельная ПЦР (droplet digital PCR, ddPCR);

секвенирование по Сенгеру;

высокопроизводительное секвенирование (NGS).

- Химические методы: химическое расщепление гетеродуплексов;

химическое лигирование.

- Методы, основанные на различной электрофоретической подвижности полиморфных участков ДНК:

анализ конформации одноцепочечных фрагментов (SSCP);

гетеродуплексный анализ (НА);

разделение продуктов амплификации посредством капиллярного электрофореза.

- Детекция на твердой фазе:

гибридизация на олигонуклеотидных матрицах;

оптико-волоконный ДНК-гибридизационный анализ;

элонгация иммобилизованных праймеров (минисеквенирование);

пиросеквенирование.

- Хроматографические методы:

высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC).

- Физические методы:

масс-спектрометрия;

резонансное тушение флуоресценции (FRET);

люминесценция, зависящая от локального окружения;

анализ кривых плавления высокого разрешения.

Наиболее распространенными из представленных методов являются:

1. Секвенирование по Сенгеру

Comparative evaluation of the new FDA approved TH×ID™-BRAF test with high resolution melting and Sanger sequencing / J. Marchant, A. Mange, M. Larrieux, V. Costes, J. Solassol // BMC Cancer. - 2014. - Vol. 14. - 519. doi: 10.1186/1471-2407-14-519

Gynecologic melanomas: A clinicopathologic and molecular analysis / A.M. Udager, N.K. Frisch, L.J. Hong, M. Stasenko, C.M. Johnston, J.R. Liu, M.P. Chan, P.W. Harms, D.R. Fullen, A. Orsini, D.G. Thomas, L. Lowe, R.M. Patel // Gynecol Oncol. - 2017. - S. 0090-8258(17). - P. 31262-31263. doi: 10.1016/j.ygyno.2017.08.023.

2. Анализ конформации одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP) Mutational analysis of the BRAF gene in human congenital and dysplastic melanocyte naevi / Т. Papp, H. Schipper, K. Kumar, D. Schiffmann, R. Zimmermann // Melanoma Res. - 2005. - Vol. 15(5). - P. 401-407.

3. Аллель-специфичная ПЦР (AS-PCR)

Sensitive allele-specific real-time PCR test for mutations in BRAF codon V600 in skin melanoma / E. Pisareva, N. Gutkina, S. Kovalenko, S. Kuehnapfel, A. Hartmann, L. Heinzerling, R. Schneider-Stock, L. Lyubchenko, V.A. Shamanin // Melanoma Res. - 2014. - Vol. 24(4). - P. 322-331. doi: 10.1097/CMR.0000000000000090.

Comparative analysis of BRAF, NRAS and c-KIT mutation status between tumor tissues and autologous tumor cell-lines of stage III/IV melanoma // A.C. Knol, M.C. Pandolfino, F. Nguyen, V. Leila, A. Khammari, M. Denis, A.L. Puaux, B. // Exp Dermatol. - 2015 - Vol. 24(1). - P. 70-73. doi: 10.1111/exd.12584.

4. Сравнительная геномная гибридизация

Somatic activation of KIT in distinct subtypes of melanoma / J.A. Curtin, K. Busam, D. Pinkel, B.C. Bastion // J Clin Oncol. - 2006. - Vol. 24(26). - P. 4340-4346.

5. PNA-блокирующая ПЦР в реальном времени

Detection of BRAF V600E mutation with thyroid tissue using pyrosequencing: comparison with PNA-clamping and real-time PCR / S.H. Kang, J.Y. Pyo, S.W. Yang, S.W. Hong // Am J Clin Pathol. - 2013. - Vol. 139(6). - P. 759-764. doi: 10.1309/AJCPN3ULH6YWBHPH.

6. LNA-блокирующая ПЦР в реальном времени

Allele specific locked nucleic acid quantitative PCR (ASLNAqPCR): an accurate and cost effectiveassay to diagnose and quantify KRAS and BRAF mutation / L. Morandi, D. de Biase, M. Visani, V. Cesari, G. De Maglio, S. Pizzolitto, A. Pession, G. Tallini // PLoS One. - 2012. - P. 7(4). - e 36084. doi: 10.1371/journal.pone.0036084.

7. Капиллярный электрофорез

Routine multiplex mutational profiling of melanomas enables enrollment in genotype-driven therapeutic trials / C.M. Lovly, K.B. Dahlman, L.E. Fohn, Z. Su, D. Dias-Santagata, D.J. Hicks, D. Hucks, E. Berry, С. Terry, M. Duke, Y. Su, T. Sobolik-Delmaire, A. Richmond, M.C. Kelley, C.L. Vnencak-Jones, A.J. Iafrate, J. Sosman, W. Pao // PLoS One. - 2012. - Vol. 7(4). - e35309. doi: 10.1371/journal.pone.0035309.

8. Анализ кривых плавления высокого разрешения

Mutation scanning of BRAF, NRAS, KIT, and GNAQ/GNA11 in oral mucosal melanoma: a study of 57 cases / J. Lyu, Y. Wu, С. Li, R. Wang, H. Song, G. Ren, W. Guo // J Oral Pathol Med. - 2016. - Vol. 45(4). - P. 295-301. doi: 10.1111/jop.12358.

Comparative evaluation of the new FDA approved TH×ID™-BRAF test with high resolution melting and Sanger sequencing / J. Marchant, A. Mange, M. Larrieux, V. Costes, J. Solassol // BMC Cancer. - 2014. - Vol. 14. - 519. doi: 10.1186/1471-2407-14-519

9. Амплификация рефрактерной мутационной системы (ARMS/Scorpion realtime PCR)

Comparative evaluation of the new FDA approved TH×ID™-BRAF test with high resolution melting and sanger sequencing / J. Marchant, A. Mange, M. Larrieux, V. Costes, J. Solassol // BMC Cancer. - 2014. - Vol. 14. - 519. doi: 10.1186/1471-2407-14-519

10. Масс-спектрометрический анализ

Detection of KRAS, NRAS and BRAF by mass spectrometry - a sensitive, reliable, fast and cost-effective technique / M. Kriegsmann, N. Arens, V. Endris, W. Weichert, J. Kriegsmann // Diagn Pathol. - 2015. - Vol. 10: 132. doi: 10.1186/s13000-015-0364-3

11. Цифровая капельная ПЦР (droplet digital PCR, ddPCR)

Quantitative Cell-Free Circulating BRAFV600E Mutation Analysis by Use of Droplet Digital PCR in the Follow-up of Patients with Melanoma Being Treated with BRAF Inhibitors / M.F. Sanmamed, S. Fernandez-Landazuri, С. Rodriguez, R. Zarate, 3 M.D. Lozano, L. Zubiri, J.L. Perez-Gracia, S. Martin-Algarra, A. Gonzalez // Clinical Chemistry. - 2015. - Vol. 61(1). - P. 297-304.

The BRAF and NRAS mutation prevalence in dermoscopic subtypes of acquired naevi reveals constitutive МАРК pathway activation / J.M. Tan, L.N. Tom, K. Jagirdar, D. Lambie, H. Schaider, R.A. Sturm, H.P. Soyer, M.S. Stark // Br J Dermatol. - 2017. doi: 10.1111/bjd.15809.

12. Высокопроизводительное секвенирование (next generation sequencing, NGS)

Beyond BRAF(V600): clinical mutation panel testing by next-generation sequencing in advanced melanoma / A.E. Siroy, G.M. Boland, D.R. Milton, J. Roszik, S. Frankian, J. Malke, L. Haydu, V.G. Prieto, M. Tetzlaff, D. Ivan, W.L. Wang, С. Torres-Cabala, J. Curry, S. Roy-Chowdhuri, R. Broaddus, A. Rashid, J. Stewart, J.E. Gershenwald, R.N. Amaria, S.P. Patel, N.E. Papadopoulos, A. Bedikian, W.J. Hwu, P. Hwu, A. Diab, S.E. Woodman, K.D. Aldape, R. Luthra, K.P. Patel, K.R. Shaw, G.B. Mills, J. Mendelsohn, F. Meric-Bernstam, K.B. Kim, M.J. Routbort, A.J. Lazar, M.A. Davies // J Invest Dermatol. - 2015. - Vol. 135(2). - P. 508-515. doi: 10.1038/jid.2014.366.

Метод 1 широко распространен и является достаточно информативным. Он предоставляет полную информацию о последовательности ДНК в исследуемом локусе и позволяет определять мутации de novo. Однако он не обладает достаточной чувствительностью для использования в клинической практике при анализе соматических мутаций (для данного метода образец должен содержать не менее 25% мутантной ДНК), отличается низкой производительностью.

Метод 2 сложен в исполнении и трактовке результатов, дает лишь косвенную информацию о нуклеотидной последовательности и не подлежит автоматизации.

Метод 3 распространен достаточно широко, однако требует постановки независимых параллельных ПЦР-реакций, соответствующих количеству анализируемых однонуклеотидных замен, что снижает его ценность для широкомасштабного генотипирования.

Метод 4 может быть использован в научных целях, но требует высокой квалификации персонала и дорогостоящего оборудования, что препятствует его внедрению в рутинную лабораторную диагностику.

Методы 5-6 также требуют постановки нескольких независимых реакций для каждого пациента при параллельном анализе нескольких мутаций. Эти методы позволяют выявить только факт наличия/отсутствия мутации в образце, но не дает информации о нуклеотидной последовательности анализируемых локусов.

Метод 7 позволяет с достаточной аналитической чувствительностью выявлять соматические мутации, однако для анализа требуется дорогостоящее оборудование и высококвалифицированный персонал, что снижает его удобство для рутинного использования в клинической практике.

Метод 8 обладает достаточно высокой чувствительностью, однако его использование ограничено для сильно поврежденных образцов, фиксированных в парафиновых блоках. Кроме того, он также требует постановки нескольких параллельных реакций для каждого пациента по числу анализируемых локусов.

Метод 9 с успехом используется для анализа соматических мутаций, однако его применение удобно для одновременного анализа небольшого количества однонуклеотидных замен.

Метод 10 требует дорогостоящего оборудования и высокой квалификации персонала.

Метод 11 в настоящее время активно используется для анализа соматических мутаций, в основном, в циркулирующей опухолевой ДНК. Для анализа соматических мутаций в опухолевой ткани его использование ограничено, прежде всего, за счет высокой стоимости расходных материалов и оборудования.

Метод 12 является наиболее перспективным для проведения одновременного генотипирования большого количество генетических локусов с высокой аналитической чувствительностью. Однако из-за высокой стоимости оборудования, расходных материалов и необходимости высокой квалификации персонала его применение в рутинной лабораторной диагностике ограничено.

Таким образом, в настоящий момент существует острая потребность в разработке способа диагностики значительного числа мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT, который бы выгодно отличался от известных решений простотой проведения анализа и низкой стоимостью.

В настоящее время существуют патенты на методы анализа мутаций в генах в генах BRAF, NRAS и KIT ассоциированных с чувствительностью опухоли к таргетной терапии. Как правило, патенты описывают методы анализа мутаций в одном из этих генов, а не охватывают их все.

В российском патенте RU 2631824 (С1) исследуемый фрагмент гена BRAF амплифицируется с помощью асимметричной ПЦР в реальном времени с двумя зондами TaqMan: смысловым и антисмысловым и парой праймеров. Стадия отжига праймеров и зондов составляет 2 с при 57°С, число циклов амплификации составляет 80-100. Затем проводят плавление дуплекса одноцепочечная ДНК/зонд и построение пиков плавления. Мутации идентифицируются асимметрией пиков плавления. Метод имеет высокую чувствительность, прост в дизайне, реализован в течение 2 часов в одной пробирке с одиночной записью результатов, снижает риск образцов перекрестное загрязнение.

Китайский патент CN 106801104 (А) обеспечивает набор праймеров для мультиплексной ПЦР, предназначенной для амплификации и обнаружения мутаций в генах EGFR, KRAS и/или BRAF. Патент НК 1220723 (А1) также содержит набор праймеров для мультиплексной амплификации данных генов, которые могут быть использованы в пробоподготовке для NGS. Данные наборы праймеров больше подходит для изучения рака легких, а не меланомы, так как для него характерно возникновение мутаций в данных генах.

Патент CN 105969877 (А) также описывает две пары праймеров для амплификации фрагментов 11 и 15 экзонов гена BRAF, которые могут быть использованы для поиска мутации путем прямого секвенирования. Различные праймеры и их комбинации описаны также в патенте WO 2005066346 (А1). Наборы праймеров для амплификации и последующего секвенирования также описаны в патенте CN 105861726 (А).

Изобретение CN 106148497 (А) раскрывает детектирующий набор и метод обнаружения мутаций в гене BRAF. Набор для обнаружения характеризуется тем, что он содержит две пары специфических праймеров для амплификации целевых локусов гена BRAF, эффективный блокирующий зонд для подавления амплификации последовательности дикого типа и флуоресцентный зонд TaqMan, специфичный для гена BRAF. Набор позволяет выявлять 5 мутаций с высокой аналитической чувствительностью, при содержании мутаций 0,1% и выше.

Методы и наборы для анализа соматических мутаций в гене BRAF, в которых используются блокирующие зонды для подавления амплификации последовательности дикого типа распространены очень широко. Например, в патенте CN 103571948 (А) используюется PNA-содержащий блокирующий зонд, после амплификации нуклеотидная последовательность устанавливается с помощью секвенирования. В патенте CN 104774962 (А) используются LNA-содержащие блокирующие зонды. Для визуализации результатов амплификации предлагается использовать ПЦР в реальном времени.

В патентах WO 2011104694 (А2) и CN 104846106 (А) описывается способ проведения аллель-специфической ПЦР для выявления мутации V600E в гене BRAF.

В патенте US 20160108479 (А1) описан набор аллель-специфических праймеров для выявления 16 вариантов мутаций в генах NRAS и/или BRAF. Также существует несколько патентов, описывающих различные наборы для детекции мутаций гена NRAS с помощью ПЦР в реальном времени. В основном они основаны на использовании аллель-специфичных праймеров или на использовании праймеров в совокупности с флуоресцентными зондами, с помощью которого детектируется наличие ПЦР-продукта (US 20170198355 (А1)).

Патент CN 105779587 (А) описывает зонды, праймеры и набор для обнаружения семи вариантов мутаций гена NRAS. В патенте описывается подход с использованием блокирующего зонда для предотвращения амплификации последовательности дикого типа и ARMS-праймеров для специфичной амплификации и детекции мутантных вариантов последовательности гена NRAS.

Патент CN 105087793 (А) описывает метод быстрого выявления нескольких точковых мутаций гена NRAS в одной пробирке. Он также основан на использовании прямых ARMS-праймеров в сочетании с обычными обратными праймерами, универсальным флуоресцентным зондом и пробой-тушителем, соответствующей ARMS-праймерам. Вывод о наличии/отсутствии мутации делается за счет изменения уровня флуоресценции в реакции амплификации.

Изобретение KR 20160012949 (А) относится к применению способа детектирования мутантной последовательности ДНК с помощью метода PNA-LNA-блокирующей ПЦР, в том числе и для обнаружения мутаций в гене NRAS.

Изобретение CN 1043725103 (А) описывает набор для количественного выявления 17 различных соматических мутаций в гене NRAS. Набор включает прямой и обратный праймеры и модифицированную пробу Taqman MGB. Метод прост и обладает высокой чувствительностью, однако требует постановки 6 параллельных реакций, что не очень удобно для исследователя.

Патент CN 102994619 (А) описывает жидкий чип для выявления 13 соматических мутаций в гене NRAS (G12S, G12C, G12D, G12A, G13R, G13D, G13A, G13V, А18Т, Q61K, Q61L, Q61P, Q61R). Жидкий чип содержит: ASPE-праймеры (allee specific primer extension), состоящие из последовательности с 5'-концевой меткой и имеющие вариабельный нуклеотид на 3'-конце, соответствующий мутантному варианту последовательности; микросферу, покрытую anti-TAG; амплимер. В патенте CN 101984070 (А) описан аналогичный жидкий чип, но уже для анализа соматических мутаций в гене KIT (AY502-503dup, V560G, T670I, D816H/V).

В целом, патентов, описывающих способы выявления соматических мутаций в гене KIT существенно меньше.

В российском патенте RU 2016100347 (А) описывается способ выявления соматической мутации L576P в гене KIT с помощью аллель-специфичной ПЦР в реальном времени.

Изобретение CN 106048023 (А) предлагает набор для обнаружения мутации в 13 экзоне гена KIT. Набор содержит пары праймеров и зонд, он способен определять мутации K642E, V654A и N655K гена экзона 13 человека KIT и предоставлять руководство по медикаментам для пациентов GIST, и имеет благоприятную клиническую перспективу применения. Этими же авторами с использованием аналогичного подхода написан патент CN 106011254 (А), но уже для анализа мутаций D816V, D820H, N8221 и N822K гена KIT.

В патенте CN 105349682 (А) описан набор для выявления только мутации D816V в гене KIT. Набор основан на технологии ARMS-PCR. В патенте CN 104846108 (А) также описан набор для выявления мутации D816V, но он основан на использовании аллель-специфичных праймеров в ПЦР в реальном времени. В патенте CN 105002283 (А) описан еще один набор для выявления этой мутации, но уже с использованием флуоресцентных аллель-специфичных зондов в ПЦР в реальном времени.

Как видно выше, в настоящее время существует много патентов, описывающих возможность анализа соматических мутаций в каком-либо из генов BRAF, NRAS или KIT, но нет патентов, описывающих простой и надежный способ одновременного анализа всех клинически-значимых мутаций в этих генах. Поскольку все имеющиеся в настоящее время методы определения соматических мутаций в генах BRAF, NRAS или KIT обладают теми или иными недостатками, существует реальная потребность в создании простого, недорогого и специфичного метода для выявления соматических мутаций, ассоциированных с чувствительностью меланомы к таргетной терапии, с целью дальнейшего внедрения в любую стандартную клиническую лабораторию.

Такой способ обеспечивается настоящим изобретением.

Раскрытие изобретения

Сущность изобретения заключается в обеспечении способа определения соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT, влияющих на чувствительность меланомы к таргетной терапии. Данный способ позволяет проводить детекцию соматических мутаций V600E (с. 1799Т>А), V600E (c. 1799_1800delTGinsAA), V600K (c. 1798_1799delGTinsAA), V600R (c. 1798_1799delGTinsAG), V600M (c. 1798G>A), V600G (c. 1799T>G), V600D (c. 1799_1800delTGinsAT) в гене BRAF; G12C (c. 34G>T), G12S (c. 34G>A), G12D (c. 35G>A), G13R (c. 37G>C), G13D (c. 38G>A), G13V (c. 38G>T), Q61P (с. 182А>С), Q61R (c. 182A>G), Q61H (с. 183А>С), Q61H (с. 183А>Т), Q61K (c. 181C>A), Q61L (с. 182А>Т) в гене NRAS; W557R (c. 1669T>A), W557R (c. 1669T>C), V559A (c. 1676T>C), V559D (c. 1676T>A), L576P (c. 1727T>C), K642E (c. 1924A>G), D816H (c. 2446G>C), D816Y (c. 2446G>T), D816V (с. 2447A>T) в гене KIT

Меланома - наиболее агрессивная форма рака кожи, количество заболевших данным заболеванием увеличивается с каждым годом [1]. Несмотря на то, что хирургическое лечение на ранних стадиях заболевания приводит к 90%-ной степени излечения, неоперабельная прогрессирующая меланома известна своей резистентностью к химиотерапии, агрессивному клиническому поведению и склонности к быстрому метастазированию. Пятилетняя выживаемость пациентов с отдаленными метастазами остается ниже 20% [2]. Поэтому, несмотря на разнообразие подходов, используемых для лечения меланомы, необходимо совершенствование методов существующей терапии. В последнее десятилетие для лечения меланомы широко применялись таргетные ингибиторы, эффективность которых зависит от наличия драйверных мутаций в опухоли.

Пациенты с меланомой часто несут соматические мутации в определенных генах. К ним относятся ген BRAF, который кодирует серин-треонин протеинкиназу [3], NRAS, кодирующий малую сигнальную ГТФазу и KIT, кодирующий рецепторную тирозинкиназу [4]. Активирующие мутации в этих генах приводят к конститутивной активации внутриклеточных сигнальных путей RAS/RAF/MEK/ERK (MAPK) и PI3K/PTEN/AKT (AKT), регулирующий рост и деление клеток [5-10]. В целом, мутации в этих генах могут быть обнаружены примерно в 70% меланом в зависимости от локализации первичного очага [10].

Мутационный статус опухоли связан с чувствительностью меланомы к определенным таргетным препататам. Мутации BRAF V600 связаны с повышенной чувствительностью к ингибиторам BRAF (вемурафениб и дабрафениб) и МЕК (траметиниб и кобиметиниб) [11-13].

Опухоли, несущие мутации в гене KIT (W557R, V559D, K642E, L576P, V559A) чувствительны к ингибитору KIT иматинибу [4, 14-17]. Опухоли, несущие мутации V559A и L576P чувствительны к мульти-тирозинкиназному ингибитору сунитинибу [18]. Опухоли, несущие мутацию KIT L576P также чувствительны к ингибиторам тирозинкиназ дазатинибу [19] и нилотинибу [14]. Наличие мутаций в 816 кодоне гена KIT напротив, вызывает резистентность опухоли к таргетным ингибиторам тирозинкиназ [20-22].

Опухоли с мутациями NRAS могут реагировать на более мощные ингибиторы MEK (GSK 1120212) или могут потребовать блокаду путей, опосредованных как MEK, так и PI3K, или других стратегий, направленных на рецептор или лиганд МЕТ [10].

Выявление соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT у больных меланомой имеет важное значение при назначении таргетной терапии. Это позволит выбрать наиболее перспективный протокол лечения индивидуально, основываясь на молекулярно-генетическом профиле опухоли больного.

Список литературы

1. Epidemiology of invasive cutaneous melanoma / R.M. MacKie, A. Hauschild, A.M. Eggermont // Ann Oncol. - 2009. - Vol. 20. - vi1-7. doi: 10.1093/annonc/mdp252.

2. Cancer statistics, 2016 / R.L. Siegel, K.D. Miller, A. Jemal // CA Cancer J Clin. - 2016. - Vol. 66. - P. 7-30. doi: 10.3322/caac.21332.

3. Mutations of the BRAF gene in human cancer / H. Davies, G.R. Bignell, C. Cox, P. Stephens, S. Edkins, S. Clegg, J. Teague, H. Woffendin, M.J. Garnett, W. Bottomley, N. Davis, E. Dicks, R. Ewing, et al. // Nature. - 2002. - Vol. 417. - P. 949-54. doi: 10.1038/nature00766.

4. Somatic activation of KIT in distinct subtypes of melanoma / J.A. Curtin, K. Busam, D. Pinkel, B.C. Bastian // J Clin Oncol. - 2006. - Vol. 24. - P. 4340-6. doi: 10.1200/JCO.2006.06.2984.

5. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF / P.T. Wan, M.J. Garnett, S.M. Roe, S. Lee, D. Niculescu-Duvaz, V.M. Good, C.M. Jones, C.J. Marshall, C.J. Springer, D. Barford, R. Marais // Cell. - 2004. - Vol. 116. - P. 855-67.

6. Identification of the MEK1(F129L) activating mutation as a potential mechanism of acquired resistance to MEK inhibition in human cancers carrying the B-RafV600E mutation / H. Wang, S. Daouti, W-H. Li, Y. Wen, С. Rizzo, B. Higgins, K. Packman, N. Rosen, J.F. Boylan, D. Heimbrook, H. Niu // Cancer Res. - 2011. - Vol. 71. - P. 5535-45. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-10-4351.

7. Activation mutations of human c-KIT resistant to imatinib mesylate are sensitive to the tyrosine kinase inhibitor PKC412 / J.D. Growney, J.J. Clark, J. Adelsperger, R. Stone, D. Fabbro, J.D. Griffin, D.G. Gilliland // Blood. - 2005. - Vol. 106. - P. 721-4. doi: 10.1182/blood-2004-12-4617.

8. Structure and activation of the human N-ras gene / E. Taparowsky, K. Shimizu, M. Goldfarb, M. Wigler // Cell. - 1983. - Vol. 34. - P. 581-6.

9. GTPase inhibiting mutations activate the alpha chain of Gs and stimulate adenylyl cyclase in human pituitary tumours. C.A. Landis, S.B. Masters, A. Spada, A.M. Pace, H.R. Bourne, L. Vallar Nature. - 1989. - Vol. 340. - P. 692-6. doi: 10.1038/340692a0.

10. Routine multiplex mutational profiling of melanomas enables enrollment in genotype-driven therapeutic trials / С.М. Lovly, K.B. Dahlman, L.E. Fohn, Z. Su, D. Dias-Santagata, D.J. Hicks, D. Hucks, E. Berry, C. Terry, M. Duke, Y. Su, T. Sobolik-Delmaire, A. Richmond, et al. // PLoS One. - 2012. - Vol. 7. - e35309. doi: 10.1371/journal.pone.0035309.

11. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation / P.B. Chapman, A. Hauschild, C. Robert, J.B. Haanen, P. Ascierto, J. Larkin, R. Dummer, C. Garbe, A. Testori, M. Maio, D. Hogg, P. Lorigan, C. Lebbe, et al. // N Engl J Med. - 2011. - Vol. 364. P. 2507-16. doi: 10.1056/NEJMoal103782.

12. Combined BRAF and MEK inhibition in melanoma with BRAF V600 mutations / K.T. Flaherty, J.R. Infante, A. Daud, R. Gonzalez, R.F. Kefford, J. Sosman, O. Hamid, L. Schuchter, J. Cebon, N. Ibrahim, R. Kudchadkar, H.A. Burris, G. Falchook, et al. // N Engl J Med. - 2012. - Vol 367. - P. 1694-703. doi: 10.1056/NEJMoa1210093.

13. Dabrafenib in BRAF-mutated metastatic melanoma: a multicentre, open-label, phase 3 randomised controlled trial / A. Hauschild, J-J. Grob, L.V. Demidov, T. Jouary, R. Gutzmer, M. Millward, P. Rutkowski, C.U. Blank, W.H. Miller, E. Kaempgen, S. Martin-Algarra, B. Karaszewska, C. Mauch, et al. // Lancet. - 2012. - Vol. 380. - P. 358-65. doi: 10.1016/S0140-6736(12)60868-X.

14. L576P KIT mutation in anal melanomas correlates with KIT protein expression and is sensitive to specific kinase inhibition / C.R. Antonescu, K.J. Busam, T.D. Francone, G.C. Wong, T. Guo, N.P. Agaram, P. Besmer, A. Jungbluth, M. Gimbel, C-T. Chen, D. Veach, B.D. Clarkson, P.B. Paty, et al. // Int J cancer. - 2007. - Vol. 121. - P. 257-64. doi: 10.1002/ijc.22681.

15. KIT as a therapeutic target in metastatic melanoma / R.D. Carvajal, C.R. Antonescu, J.D. Wolchok, P.B. Chapman, R.A. Rmaon, J. Teitcher, K.S. Panageas, K.J. Busam, B. Chmielowski, J. Lutzky, A.C. Pavlick, A. Fusco, L. Cane, et al. // JAMA. - 2011. Vol. 305. - P. 2327-34. doi: 10.1001/jama.2011.746.

16. Dose-dependent, complete response to imatinib of a metastatic mucosal melanoma with a K642E KIT mutation / J. Lutzky, J. Bauer, B.C. Bastian // Pigment Cell Melanoma Res. - 2008. - Vol. 21. - P. 492-3. doi: 10.111 1/j.l755-148X.2008.00475.x.

17. Response to imatinib mesylate depends on the presence of the V559A-mutated KIT oncogene / P. Terheyden, R. Houben, P. Pajouh, C. Thorns, D. Zillikens, J.C. Becker // J Invest Dermatol. - 2010. - Vol. 130. - P. 314-6. doi: 10.1038/jid.2009.197.

18. Response to sunitinib in Chinese KIT-mutated metastatic mucosal melanoma / Y. Zhu, L. Si, Y. Kong, Z. Chi, X. Yuan, C. Cui, X. Sheng, J. Guo, L. Shen // J Clin Oncol. - 2009. - Vol. 27. - e20017.

19. Activity of dasatinib against L576P KIT mutant melanoma: molecular, cellular, and clinical correlates / S.E. Woodman, J.C. Trent, K. Stemke-Hale, A.J. Lazar, S. Pricl, G.M. Pavan, M. Fermeglia, Y.N. Gopal, D. Yang, D.A. Podoloff, D. Ivan, K.B. Kim, N. Papadopoulos, et al. Mol Cancer Ther. - 2009. - Vol. 8. - P. 2079-85. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-09-0459.

20. KIT kinase mutants show unique mechanisms of drug resistance to imatinib and sunitinib in gastrointestinal stromal tumor patients / K.S. Gajiwala, J.C. Wu, J. Christensen, G.D. Deshmukh, W. Diehl, J.P. DiNitto, J.M. English, M.J. Greig, Y.A. He, S.L. Jacques, E.A. Lunney, M. Mc Tigue, D. Molina, et al // Proc Natl Acad Sci USA. - 2009. Vol. 106. - P. 1542-7. doi: 10.1073/pnas.0812413106.

21. Primary and secondary kinase genotypes correlate with the biological and clinical activity of sunitinib in imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumor / M.C. Heinrich, R.G. Maki, C.L. Corless, C.R. Antonescu, A. Harlow, D. Griffith, A. Town, A. McKinley, W.B. Ou, J.A. Fletcher, C.D.M. Fletcher, X. Huang, D.P. Cohen, et al. // J Clin Oncol. - 2008. - Vol. 26. - P. 5352-9. doi: 10.1200/JCO.2007.15.7461.

22. Flumatinib, a selective inhibitor of BCR-ABL/PDGFR/KIT, effectively overcomes drug resistance of certain KIT mutants / J. Zhao, H. Quan, Y. Xu, X. Kong, L. Jin, L. Lou // Cancer Sci. - 2014. - Vol. 105. - P. 117-25. doi: 10.1111/cas.12320.

Основными признаками данного изобретения являются LNA-блокирующая мультиплексная «гнездовая» ПЦР и биочип, содержащий набор иммобилизованных дифференцирующих олигонуклеотидов.

Первым важным признаком изобретения являются праймеры для амплификации целевых локусов генов BRAF, NRAS и KIT, набор которых используется для получения изучаемых флуоресцентно меченых фрагментов ДНК в требуемом количестве. Последовательности праймеров приведены в Перечне последовательностей 1 (SEQ ID NO:1-22).

Вторым важным признаком изобретения являются LNA-олигонуклеотиды, обеспечивающие преимущественную амплификацию ДНК-локусов, содержащих соматические мутации. Преимущественная амплификация мутантных ДНК-локусов происходит в результате способности LNA-олигонуклеотидов узнавать и специфически связываться с фрагментами ДНК «дикого типа», препятствуя их амплификации. Последовательности LNA-олигонуклеотидов приведены в Перечне последовательностей 2 (SEQ ID NO: 23-29).

Третьим важным признаком изобретения является биочип, содержащий набор иммобилизованных дифференцирующих олигонуклеотидов, последовательности которых приведены в Перечне последовательностей 3 (SEQ ID NO: 30-64). Дифференцирующие олигонуклеотиды иммобилизуются в ячейках гидогелевого микрочипа, как описано в патенте [Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Панъков С.В., Перов А.Н., Чупеева В.В. (2003) Композиция для иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях, способ приготовления композиции, биочип, способ проведения ПЦР на биочипе. Патент RU 2206575 С2] в концентрации 200-400 мкМ. Схема расположения ячеек биочипа для анализа соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT приведена на Фиг. 1.

Набор праймеров и LNA-олигонуклеотидов используется на стадии предварительной амплификации ДНК-локусов посредством проведения трех параллельных мультиплексных LNA-блокирующих «гнездовых» ПЦР для подготовки ДНК-мишени к гибридизации на биочипе. На первом этапе, благодаря использованию LNA-блокирующей мультиплексной ПЦР проходит преимущественная амплификация ДНК-локусов, содержащих соматические мутации (если образец их содержит). На втором этапе с амплифицированных фрагментов нарабатывается одноцепочечная ДНК с одновременным введением флуоресцентной метки. Далее проводится гибридизация полученных флуоресцентно меченых одноцепочечных фрагментов ДНК с иммобилизованными в ячейках геля олигонуклеотидами, расположенными на пластиковой подложке. После проведения гибридизации и отмывки биочипа проводится анализ полученной флуоресцентной картины, на основании которого делается вывод о генотипе в исследуемом образце. Пример гибридизационной картины приведен на Фиг. 2. Перечни последовательностей

Перечень последовательностей 1. Последовательности праймеров I и II этапа для проведения мультиплексной ПЦР с последующим анализом методом гибридизации на биочипе для определения чувствительности меланомы к таргетной терапии.

Перечень последовательностей 2. Нуклеотидные последовательности LNA-олигонуклеотидов. Условные обозначения: строчные буквы - LNA-нуклеотиды, заглавные буквы - ДНК-нуклеотиды.

Перечень последовательностей 3. Последовательности олигонуклеотидных зондов, используемых для иммобилизации в ячейках биочипа. Условные обозначения: строчные буквы - LNA-нуклеотиды, заглавные буквы - ДНК-нуклеотиды.

Перечень фигур

Фигура 1. Схема биочипа для анализа соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT. В угловых позициях нанесены ячейки (М), содержащие флуоресцентный краситель Су5, светящийся перманентно, для ориентировки и контроля интенсивности свечения.

Фигура 2. Гибридизационная картина, полученная с помощью биочипа для анализа соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT у испытуемого №ХХХ. Образец содержит мутацию V600E в гене BRAF.

Осуществление изобретения

Задача настоящего изобретения состоит в создании способа экспресс-анализа, позволяющего выявлять соматические мутации в генах BRAF, NRAS и KIT.

Для обеспечения оптимального состава и структуры праймеров, используемых в протоколе мультиплексной ПЦР, необходимы такие праймеры, которые не образуют между собой высокоэнергетических структур (шпильки и дуплексы), обеспечивают специфичную амплификацию и при этом подобраны таким образом, чтобы их отжиг на мишени происходил при одинаковой температуре. Для обеспечения сбалансированной эффективной амплификации исследуемых образцов также должны быть оптимизированы такие параметры как концентрация MgCl2 и праймеров в ПЦР-смеси, соотношение прямых и обратных праймеров, количество циклов амплификации на обоих этапах, время элонгации, денатурации и отжига праймеров на каждом этапе. В результате проведенной работы подобраны праймеры 1 и 2 этапа, которые позволяют осуществлять эффективную наработку выбранных фрагментов генов генов BRAF, NRAS и KIT.

Для обеспечения оптимального состава и структуры LNA-олигонуклеотидов, используемых в протоколе LNA-блокирующей мультиплексной ПЦР, необходимы такие LNA-олигонуклеотиды, которые не образуют между собой и с праймерами высокоэнергетических вторичных структур (шпильки и димеры), обеспечивают специфичное связывание с целевой последовательностью ДНК дикого типа и препятствуют ее амплификации. В результате проведенной работы подобраны LNA-олигонуклеотиды, позволяющие осуществлять преимущественную наработку выбранных фрагментов генов BRAF, NRAS и KIT, несущих соматические мутации.

Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе подбираются таким образом, чтобы идентифицировать все выбранные для анализа соматические мутации в генах BRAF, NRAS и KIT.

Олигонуклеотиды должны соответствовать следующим критериям:

1) Дискриминирующий зонд должен обладать высокой специфичностью к выбранному для анализа мутантному локусу, который представляет собой участок гена, амплифицированный с помощью ПЦР, с включенной флуоресцентной меткой.

2) Вариабельный нуклеотид должен находиться в серединной области зонда, поскольку такое положение позволяет добиться большей дискриминации между совершенными и несовершенными дуплексами.

3) Выбранные олигонуклеотиды не должны содержать высокостабильных вторичных структур, наличие которых может приводить к снижению эффективности гибридизации.

На биочипе для определения соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT иммобилизовано 35 высокоспецифичных дифференцирующих олигонуклеотидных зондов (Перечень последовательностей 3 (SEQ ID NO: 30-64)), структура которых обеспечивает связывание только с полностью комплементарными ДНК-мишенями, что обуславливает яркий флуоресцентный сигнал в соответствующих им ячейках биочипа и дает наиболее четкие картины распределения гибридизационных сигналов. Неспецифическое связывание сведено к минимуму, что практически исключает ложноположительное «срабатывание» ячеек.

Так как при амплификации интересующих нас ДНК-локусов, используется LNA-блокирующая ПЦР, ячейки, содержащие зонды с последовательностью «дикого типа», может иметь низкий уровень флуоресцентного сигнала.

Приведем последовательность анализа с использованием данного метода. Наработка ПЦР-продуктов проводится в трех параллельных гнездовых реакциях. В первой пробирке происходит избирательная амплификация фрагментов генов BRAF и NRAS, во второй - фрагментов гена KIT для анализа кодонов 557, 559 и 642, в третьей пробирке происходит избирательная амплификация фрагментов гена KIT для анализа кодонов 576 и 816. В качестве матрицы используют опухолевую ДНК. LNA-олигонуклеотиды используются только на первом этапе ПЦР.

ПЦР может быть проведена с использованием любого вида термостабильной полимеразы, не имеющей 5'>3'экзонуклеазной активности (например, SNPdetect полимеразы (Евроген)). Для построения новой цепи в буфер добавляется смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) в принятых концентрациях, при этом вместо дТТФ может быть использован дУТФ. Для проведения ПЦР могут быть использованы готовые коммерчески доступные наборы, содержащие все необходимые компоненты за исключением праймеров.

На первом этапе проходит амплификация локусов генов BRAF, NRAS и KIT, с преимущественной наработкой мутантных фрагментов (если образец содержит мутацию). Продукт первого этапа ПЦР используют в качестве матрицы на втором этапе, который проводят в реакционной смеси того же состава, но не добавляют LNA-олигонуклеотиды и добавляют избыток одного из праймеров для обеспечения избытка флуоресцентно меченого одноцепочечного ПЦР-продукта. Это позволяет получать одноцепочечный ампликон, способный к гибридизации с аллель-специфичными ДНК-зондами на биочипе. Флуоресцентное мечение проводят на втором этапе ПЦР одновременно с амплификацией одноцепочечных фрагментов ДНК посредством введения флуоресцентной метки. В качестве флуоресцентной метки используется дезоксинуклеотидтрифосфат, а именно Су5-дУТФ, встраивающийся в синтезируемую ДНК-цепь. В качестве флуоресцентной метки также может быть использован любой флуорохром без ограничения (например, FITC, Texas red, Су-3 и т.д.), а также биотин.

Праймеры, LNA-олигонуклеотиды и олигонуклеотидные зонды синтезируют с использованием различных химических подходов, таких как фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д., при этом наиболее распространенным в настоящее время является фосфоамидитный метод синтеза. Синтез праймеров осуществляют, используя автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например производства фирмы «Applied Biosystems» (США).

При изготовлении биочипа могут быть использованы олигонуклеотиды, несущие по 5'-или 3'-концу активную группу, обеспечивающую иммобилизацию. Модификация олигонуклеотида для введения активной группы может быть осуществлена как в автоматическом режиме при синтезе с использованием широкого спектра коммерчески доступных модификаторов, так и постсинтетически в ручном режиме. Например, при синтезе олигонуклеотидных зондов с помощью 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500 («Glen Research)), США) на 3'-конец олигонуклеотидов вводится спейсер со свободной аминогруппой, используемый для последующей иммобилизации олигонуклеотида на биочипе.

Для проведения мультиплексной LNA-блокирующей «гнездовой» ПЦР используют праймеры SEQ ID NO: 1-22 и LNA-олигонуклеотиды SEQ ID NO: 23-29, приведенные в Перечнях последовательностей 1 и 3.

В первой реакции I этапа ПЦР используют праймеры (SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8) и LNA-олигонуклеотиды (SEQ ID NO: 23, 24, 25).

Во второй реакции I этапа ПЦР используют праймеры (SEQ ID NO: 10, 11, 16, 18) и LNA-олигонуклеотиды (SEQ ID NO: 26, 28).

В третьей реакции I этапа ПЦР используют праймеры (SEQ ID NO: 13, 15, 20, 21) и LNA-олигонуклеотиды (SEQ ID NO: 27, 29).

В первой реакции II этапа ПЦР используют праймеры (SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9).

Во второй реакции II этапа ПЦР используют праймеры (SEQ ID NO: 10, 12, 17, 19).

В третьей реакции II этапа ПЦР используют праймеры (SEQ ID NO: 14, 15, 20, 22).

Далее проводится гибридизация флуоресцентно меченых фрагментов ДНК, полученных после проведения второго этапа ПЦР, с иммобилизованными в ячейках геля олигонуклеотидами, которые представляют собой участки генов BRAF, NRAS, KIT и являются комплементарными последовательности «дикого типа» или последовательности, содержащей мутации.

Перед постановкой гибридизации ПЦР-продукт денатурируют путем инкубации готовой гибридизационной смеси при 95°С в течение 5 минут с последующим быстрым охлаждением на льду в течение 2 минут. Гибридизация может быть проведена в любом известном специалисту в данной области гибридизационном буфере, например в гуанидиновом или SSPE-буфере. Типичное время гибридизации составляет 12-14 ч. при 37°С. Анализ генотипа исследуемого образца проводится с учетом расположения олигонуклеотидных зондов на биочипе, схема которого позволяет определить, какие соматические мутации присутствуют в том или ином образце.

Анализируемые фрагменты ДНК образует совершенные гибридизационные дуплексы только с полностью комплементарными им олигонуклеотидами. Если последовательность анализируемой ДНК полностью комплементарна последовательности зонда, то образуется стабильный совершенный дуплекс (детектируется сигнал флуоресценции). В случае если искомого фрагмента нет или в нем находится некомплементарное основание, то стабильного дуплекса не образуется (сигнал флуоресценции отсутствует). Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов проводят после отмывки биочипа, сравнивая интенсивности сигналов флуоресценции соответствующих ячеек биочипа. Отмывка может быть проведена в любом известном в данной области техники буфере с добавлением соли (SSC, SSPE и т.п.) или в деионизованной воде, но за более короткое время [Sambrook J.F. & D.W. Russell (2001) «Molecular cloning: a laboratory manuah Cold Spring Harbor Laboratory Press].

Регистрация гибридизационной картины может быть произведена с помощью любой детектирующей системы, распознающей флуоресцентный сигнал (флуоресцентный микроскоп с ПЗС-камерой, лазерный сканер, портативный анализатор биочипов и т.п. коммерчески доступные флуоресцентные анализаторы, например, портативный анализатор биочипов, снабженный ПЗС-камерой и специальным программным обеспечением, производства ООО «БИОЧИП-ИМБ» (Россия).

Биочипы могут быть изготовлены посредством последовательного нанесения на поверхность стеклянной подложки матрицы из ячеек акриламидного геля, активации ячеек и ковалентной иммобилизации в ячейках модифицированных олигонуклеотидов, несущих активные группы [Kolchinsky A, Mirzabekov A. Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips. Hum Mutat. 2002 Apr; 19(4): 343-60. Review]. В качестве подложки помимо стекла может быть использован другой материал, в том числе металл, гибкие мембраны и пластик [Паньков С.В., Крейндлин Э.Я., Сомова О.Г., Моисеева О.В., Барский В.Е., Заседателев А.С. (2007) Применение немодифицированных полимерных материалов для изготовления подложки биочипов, биочип на их основе и способ его изготовления, способ иммобилизации гидрогелей на немодифицированных полимерных материалах. Патент RU 2309959]. Бочипы также могут быть изготовлены любыми другими известными специалисту в данной области способами [Seliger Н, Hinz М, Нарр Е. Arrays of immobilized oligonucleotides--contributions to nucleic acids technology. Curr Pharm Biotechnol. 2003 Dec; 4(6): 379-95].

Для изготовления биочипа в настоящем изобретении используется набор олигонуклеотидов (SEQ ID NO: 30-64), приведенных в Перечне последовательностей 3. В качестве контроля прохождения гибридизации в настоящем изобретении используют образец контрольной ДНК. Расположение конкретных олигонуклеотидных зондов на биочипе может варьироваться и определяется только удобством интерпретации результатов гибридизации.

Далее приводятся примеры, которые показывают применение способа анализа соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT, ассоциированных с чувствительностью опухоли к таргетной терапии. Следует понимать, что приводимые примеры служат исключительно для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема притязаний, выраженных в формуле изобретения. На основании настоящего описания специалист в данной области сможет легко предложить свои варианты и модификации осуществления изобретения, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, так что должно быть понятно, что такие варианты и модификации также будут входить в объем притязаний настоящего изобретения.

Пример 1. Амплификация фрагментов генов BRAF, NRAS и KIT методом «гнездовой» LNA-блокирующей ПЦР с целью получения флуоресцентно меченого ПЦР-продукта в необходимом количестве.

Из операционного материала, фиксированного в парафиновых блоках, образцы опухолевых тканей получали с помощью ручной микродиссекции под гистологическим контролем. Геномную ДНК выделяли с помощью набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Германия).

Амплификацию локусов генов BRAF, NRAS и KIT проводили в трех параллельных мультиплексных реакциях. Первая мультиплексная реакция содержала праймеры и LNA-олигонуклеотиды - SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 23, 24, 25; вторая мультиплексная реакция - SEQ ID NO: 10, 11, 16, 18, 26, 28; третья мультиплексная реакция - SEQ ID NO: 13, 15, 20, 21, 27, 29. ПЦР проводили на приборе Т100 («Bio-Rad», США). ПЦР-смесь первого этапа общим объемом 25 мкл включала в себя: 1× ПЦР-буфер (67 мМ Трис-HCl, рН 8.6, 166 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Тритон Х-100), 2.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ каждого из дНТФ («Силекс», Россия), 5 U SNPdetect-полимеразы («Евроген», Россия), по 0.2 мкМ праймеров, 0.02-0.2 мкМ LNA-олигонуклеотидов (оптимальная концентрация каждого олигонуклеотида подбирается индивидуально) и 25 нг ДНК. Амплификацию проводили по следующей схеме: денатурация при 94°С (3 мин 30 с), далее 35 циклов: 94°С (30 с), 62°С (30 с), 72°С (30 с), затем элонгация при 72°С в течение 3 мин. Смесь второго этапа ПЦР отличалась составом и концентрацией праймеров. Она содержала по 0.2 мкМ прямых праймеров (первый мультиплекс: SEQ ID NO: 1, 4, 7; второй мультиплекс: SEQ ID NO: 10, 17; третий мультиплекс: SEQ ID NO: 14, 20), и по 2 мкМ обратных праймеров (первый мультиплекс: SEQ ID NO: 3, 6, 9; второй мультиплекс: SEQ ID NO: 12, 19; третий мультиплекс: SEQ ID NO: 15, 22) и не содержала LNA-олигонуклеотидов. Для флуоресцентного мечения ПЦР-продукта второго раунда смесь содержала 0.2 нМ флуоресцентно меченого дУТФ-Су5, который встраивался в цепь в процессе амплификации. В качестве матрицы в смесь добавляли 2 мкл продукта I этапа ПЦР и проводили амплификацию по следующей схеме: денатурация при 94°С (3 мин 30 с), далее 35 циклов: 94°С (30 с), 62°С (30 с), 72°С (30 с), затем элонгация при 72°С в течение 3 мин.

Пример 2. Олигонуклеотидный биочип для определения соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT.

Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезируют на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer («Applied Biosystems», США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 5' или 3'-конец олигонуклеотидов содержит спейсер со свободной аминогруппой, который вводят в состав олигонуклеотида при синтезе путем использования 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500 («Glen Research)), США). Присоединение флуоресцентной метки к олигонуклеотидам по свободной аминогруппе осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя.

Биочип изготовляют методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее [Применение немодифицированных полимерных материалов для изготовления подложки биочипов, биочип на их основе и способ его изготовления, способ иммобилизации гидрогелей на немодифицированных полимерных материалах / С.В. Паньков, Э.Я. Крейндлин, О.Г. Сомова, и др. // Патент RU 2309959. - 2007.], [Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа / А.Д. Мирзабеков, А.Ю. Рубина, С.В. Паньков, и др. // Патент RU 2175972. - 2001.]. После изготовления биочипы проходят контроль качества нанесения, который включает в себя визуальный контроль физических размеров гелевых ячеек при помощи светового микроскопа в отраженном свете и контроль концентрации иммобилизованных олигонуклеотидов с помощью красителя Су-3 (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Москва, Россия). Биочип содержит 35 иммобилизованных олигонуклеотидных зондов (SEQ ID NO: 30-64), список которых представлен Перечне последовательностей 3. Ячейки наносят согласно схеме на Фиг. 1.

Пример 3. Гибридизация меченого продукта на биочипе

Реакционную смесь, полученную после проведения II этапа ПЦР, описанного в Примере 1, используют для гибридизации на биочипе. Гибридизационная смесь общим объемом 40 мкл содержала 10 мкл формамида ("Serva", США), 10 мкл 20×SSPE ("Promega", США) и 6.7 мкл амплификата из первой мультиплексной реакции, 6.7 мкл амплификата из второй мультиплексной реакции и 6.7 мкл амплификата из третьей мультиплексной реакции. Готовую гибридизационную смесь перед гибридизацией денатурируют при 95°С в течение 5 мин., охлаждают во льду 2 мин. и наносят на биочип в гибридизационную камеру объемом 40 мкл (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Москва, Россия). Гибридизацию проводят в течение 12-14 ч при температуре 37°С. После завершения инкубации гибридизационную камеру удаляют вместе с непрореагировавшей гибридизационной смесью и проводят отмывку в 1× SSPE буфере («Promega», США) при комнатной температуре в течение 15 мин.

Пример 4. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации

Регистрацию гибридизационной картины производят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой, производимого ООО «Биочип-ИМБ». Описание алгоритма автоматического анализа изображения с помощью программы Image Ware™* выходит за рамки настоящего изобретения.

Определим генотип по гибридизационной картине, представленной на Фиг. 2.

В ячейках биочипа, соответствующих 600 кодону гена BRAF, интенсивный флуоресцентный сигнал, наблюдается в паре ячеек, соответствующих соматической мутации V600E (с. 1799Т>А). Ячейки биочипа, соответствующие «дикому типу» данного локуса, обладают более низким уровнем флуоресценции. Для локусов, соответствующих кодонам 12, 13 и 61 гена NRAS, и кодонам 557, 559, 642 и 816 гена KIT, флуоресцентный сигнал наблюдается только у иммобилизованных олигонуклеотидов, соответствующих последовательностям «дикого типа». Следовательно, анализируемый образец содержит мутацию V600E в гене BRAF.

1. Способ выявления соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT, предусматривающий следующие стадии:

(а) амплификация фрагментов генов BRAF, NRAS и KIT с помощью LNA-блокирующей мультиплексной «гнездовой» ПЦР, в которой в качестве матрицы для амплификации используется образец опухолевой ДНК:

в первой реакции I этапа ПЦР используются праймеры SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8 и LNA-олигонуклеотиды SEQ ID NO: 23, 24, 25;

во второй реакции I этапа ПЦР используются праймеры SEQ ID NO: 10, 11, 16, 18 и LNA-олигонуклеотиды SEQ ID NO: 26, 28;

в третьей реакции I этапа ПЦР используются праймеры SEQ ID NO: 13, 15, 20, 21 и LNA-олигонуклеотиды SEQ ID NO: 27, 29;

в первой реакции II этапа ПЦР используются праймеры SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9;

во второй реакции II этапа ПЦР используются праймеры SEQ ID NO: 10, 12, 17, 19;

в третьей реакции II этапа ПЦР используются праймеры SEQ ID NO: 14, 15, 20, 22;

в результате образуется флуоресцентно меченый ПЦР-продукт;

(б) обеспечение биочипа для идентификации соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 30-64;

(в) гибридизация меченого ПЦР-продукта на биочипе;

(г) регистрация и интерпретация результатов гибридизации.

2. Способ по п. 1, в котором регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью устройства, способного регистрировать и записывать сигналы флуоресценции, оснащенного программным обеспечением, позволяющим проводить автоматическую обработку интенсивности сигналов с последующей интерпретацией результатов.

3. Способ по п. 1, в котором для идентификации соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT, амплифицированных с помощью набора праймеров и LNA-олигонуклеотидов, охарактеризованных в п. 1, используется биочип, представляющий собой подложку с набором иммобилизованных на ней олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 30-64.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к устройству для тестирования на беременность и способу выполнения тестирования на беременность. Цифровое тестирующее устройство для обнаружения беременности содержит аналитические средства для измерения количества hCG, FSH и метаболита прогестерона в образце, взятом у субъекта; устройство отображения результата анализа пользователю; компьютеризованное средство управления, запрограммированное с верхним и нижним пороговыми значениями для hCG, с по меньшей мере одним пороговым значением для FSH и/или с по меньшей мере одним пороговым значением метаболита прогестерона и с алгоритмом для интерпретации результатов анализа.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для объективной оценки степени выраженности воспалительного процесса в эндометрии и стадии клинического течения при хроническом эндометрите (ХЭ).

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полипептидному биомаркеру эффективности применения ингибитора FGFR при лечении рака мочевого пузыря и рака легких, что может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к количественному или тест-определению тетрациклина и доксициклина в молоке и молочных продуктах. Для тест-определения из образцов предварительно удаляют белок и молочный жир.

Изобретение относится к медицине, а именно к области диагностики амилоидозов при помощи окрашивания гистологических образцов, и может быть использовано в патологической анатомии, цитологии, клинической лабораторной диагностике и биологии.

Изобретение относится к экологии и может быть использовано при комплексном определении экологической безопасности и биологической эффективности почвогрунтов, создаваемых на основе осадка городских сточных вод в полевых условиях.

Группа изобретений относится к протеомике, а именно способу качественного и количественного определения протеотипического пептида AFG3-подобного белка-2 человека (идентификатор Q9Y4W6 в базе данных UniProt) в сложных биологических образцах.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ и набор для диагностики молекулярного фенотипа больных, страдающих заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, с отнесением их к подгруппам «Th2-высокая», «Th2-низкая», «Th1-высокая» или «Th1-низкая».

Изобретение относится к области анализа состава жидкостей, а именно к способам, обеспечивающим надежное, безопасное и ускоренное определение присутствия в растворах различных веществ в растворенном состоянии, и может применяться для экспресс-тестирования спиртосодержащих продуктов и питьевой бутилированной воды на наличие примесей, в том числе вредных, а также других жидких пищевых продуктов, кроме того, жидких фармакологических, косметических средств, жидкого топлива, масел.

Изобретение относится к медицине и касается микрофлюидного устройства для исследования влияния химических веществ на клетки млекопитающих, представляющего собой чип с размещенной в нем микрофлюидной системой.

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин, а именно к способу определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для производства вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ и разработанной регрессионной моделью зависимости титра инфекционной активности вируса ящура от величины порогового цикла амплификации.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ и набор для диагностики молекулярного фенотипа больных, страдающих заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, с отнесением их к подгруппам «Th2-высокая», «Th2-низкая», «Th1-высокая» или «Th1-низкая».

Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии. Предложен способ центильной оценки микроценоза слизистой влагалища у девочек путем отбора биоматериала со слизистой боковой стенки влагалища за физиологическим отверстием девственной плевы соскобом одноразовым урогенитальным зондом.
Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя бактериального вагинита Lactobacillus spp.
Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК энтеробактерий семейства Enterobacteriaceae, включая Е.
Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя бактериального вагиноза Gardnerella vaginalis в слизистой оболочке влагалища методом полимеразной цепной реакции, включающий праймеры и зонды с флуоресцентной меткой.
Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя бактериального вагиноза Atopobium vaginae в слизистой оболочке влагалища методом полимеразной цепной реакции, включающий праймеры и зонды с флуоресцентной меткой.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, медицины и онкологии. Предложена аналитическая тест-система для определения чувствительности злокачественной опухоли конкретного пациента к онколитической биотерапии на основе мультиплексной ПЦР в режиме реального времени, включающая в себя список генов-маркеров CD74, CFI, CSF3, DNAJC24, FGF5, HCFC2, ИСК, IL15, IL1RAPL2, IL8, ITGA7, LEPR, MAP3K13, MAPKAPK3, MDK, PDGFRA, PDIK1L, PIK3CA, S100PBP, SCARB2, STK4, ТМЕМ54, TNFAIP6, TNFRSF1B, TRAF4 и тканеспецифичных референсных генов-хаускиперов GAPDH, АСТВ, RPN1, GUSB, инструкцию, планшеты для проведения ПЦР и смесь для амплификации.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, медицины и онкологии. Предложена аналитическая тест-система для определения чувствительности злокачественной опухоли конкретного пациента к онколитической биотерапии на основе мультиплексной ПЦР в режиме реального времени, включающая в себя список генов-маркеров CD74, CFI, CSF3, DNAJC24, FGF5, HCFC2, ИСК, IL15, IL1RAPL2, IL8, ITGA7, LEPR, MAP3K13, MAPKAPK3, MDK, PDGFRA, PDIK1L, PIK3CA, S100PBP, SCARB2, STK4, ТМЕМ54, TNFAIP6, TNFRSF1B, TRAF4 и тканеспецифичных референсных генов-хаускиперов GAPDH, АСТВ, RPN1, GUSB, инструкцию, планшеты для проведения ПЦР и смесь для амплификации.

Изобретение относится к области медицины, в частности к трансплантологии, и предназначено для анализа гемопоэтического химеризма при исследовании однонуклеотидных полиморфизмов генов фолатного цикла.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для выявления предраковых изменений в молочной железе. В супернатанте пробы клеток крови пациента, инкубированных с раково-эмбриональным антигеном (РЭА) и без РЭА, определяют концентрацию IL-1β.

Изобретение относится к области генетики, молекулярной биологии и медицины. Предложен способ выявления соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT. Проводят амплификацию фрагментов генов BRAF, NRAS и KIT с помощью LNA-блокирующей мультиплексной «гнездовой» ПЦР. Используют биочип для идентификации соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT и гибридизацию меченого ПЦР-продукта на биочипе. Регистрируют результаты гибридизации. Изобретение обеспечивает создание способа определения соматических мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT, влияющих на чувствительность меланомы к таргетной терапии. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 пр.

Наверх