Способ получения -аминокислот

 

И - ИЕ <>ызввг

ИЗОБРЕТЕН Ия

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено29.12,73 (21) 1980998/04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (51) М. 1;

С 07С 101/02

Государственный комитет

Совета Министров СССР оо делам иэобретений и открытий (43) ОпУбликовано 05.08.76.Б|оллетень № 29 (53) УДК 547.466,07 (088.8) (45) Дата опубликования описания 28.10 76

А, К. Арен, В, Э. Калис, Д. Я, Лауциниеце, 3. В. Микелсоне, Д, Я. Кукуран, В. A. Фелднере, Д. Я. Спэлиге, О. М. Полгорак и F., С. Чухрай (72) Авторы изобретения

Латвийский фи..<иал Ордена Трудового Красного Зпамени всесоюзного (71) Заявитель научно-исследовать ского института химическихреактивэв и особо чистых химических веществ (54) СПОСОБ 11ОЛУ

i y

Изобретение относится к усооернгопсгвсванному способу получения L -амннэкпслог, YRKHx> как метионип, аспарагинэваи кислота, серин, лейцин и других, пу гем гн дролиза рацемических N -ацилпминокнслэг. 5

Известен способ получения Ь вЂ” аминокислот путем гидролиза рапемических ацетиламинокисло г с помощью иммобилн;эованной ацилазы, получаемой адсорбцией ацилазы на ДЕАЕ-сефадексе.

Недостатком этого способа яв Ьется необходимость сильного сгущения реакционнэях смесей при выделении продуктов реакции, 15 связанная с те4, что гидролиз осуществляется в разбавленных растворах ациламинокислот (растворами, концентрация которых превышает 0,2М; ацилаза быстро вымываетса из ДЕАЕ-сефадекса).

1 Кроме того, необходимый для приготов.ления иммобилизованной ацилазы ДЕЛЕ-се фадекс является малодоступным импортным органическим носителем, химические и физппеские свойства которого могут меняться

I при эксплуатации.

С целью и тенсификации процесса по пред л:.>г;>емому способу непрерывный или многократный псснметрический гидролиз рацемии..:скнх апилпмипокислог при рН 7-8 и 1540 С эсушесгвляюг, используя в качестве э кат >ли;-.- гора легко получаемые препарагы аннлпзьr, сорбированнэй на отечественных неорганических сорбентах с повышенной удельной поверхностью (таких, как силикагель или снлохром). Сорбцию ацилазы на указанных сорбенгах осуществляют при гемперагу ро err 0 до 25оС, причем силикагель предварительно приготавливают кипячением с кис лэгой. Поскольку получаемые в реакции 4

-аминокислоты ицгибируют ацилазную активность, го препараты иммобилизованной на силикаголе или силохроме ацилазы при перерывах в работе огмываюг и хранлт в буфере рН 7 при 2-6оС. Сорбировавший ацилазу силохром после потери каталитической

QKTHBHocTH в результате использования регенерируют прокаливанием при 200-700оС

3 и снОва использ уют дл рбции новой гор- .без снижения ее каталитической активности

Я со б ции ацилазы, rfp0((ecc получения -аминокислоты м ожПреимуществами предлагаемого способа но вести непрерывно (не менее 20 дней) является: возможность непрерывного или При осуществлении процесса в массе в сомногократного асимет ическог р ского гидролиза g суд с препаратом иммобилизованной ациларацемических ациламинскис лот при повышен- зы наливают раствор рацемической ацилных концентрациях последних (до 0,5 Я); аминокислоты и. ->(держивают при темпераолее высокая скорость асиметрического ги- туре о 40ОС

R -, ис)рсдка перемешивая содердролиза рацемических ацнламинокислот на жимое

1 мл объема абот, до завери>Опия peакции получения мл объема работающей иммобцдизованной 1п L -аминокислоты (о чем судят как в ацилазы (до 3000 мкмсль I„-аланина и предыдущем случае). Затем отфильтровывают до 625 мкмоль L -метионина в 1 час) ,(). Кро- препарат иммобилизованной ацилазы от по д (мые для приготовления им- лученной реакционно ме гого, необхо (и смеси и иммо илизоб ,мобилизованнои ацилазы неорганические нц- в н ф ванный фермент промываеот 0,1М фосфатным сители (например, силнкагель или силохром) $ б фе и м ) уфером с рп около 7, после чего его можпредставпяют собой легко доступные выпус- но снова использовать для получения (..— каемые отечественной промышленностью -аминокислоты из новой порции рацемической сор епгы, 0»(.ëè÷aEoùf(oc!r химической стойко- ациламиноки от ( окислоты такое использование без стью и постоянством хорошей фильтрую(пей > снижения <()ерментативной активности препаспособности и,других физических свойств. (Щ ,к . Я рата мо»кно повторять не менее 5 раз).

Предлагаемый способ позволяет с помс - Р

Раствор получаемой реакциое(ной смеси щыо препаратов ич. »(обнлизов()ппой ацилазы„сгушаеот B в=КО

--,овак ) ме при - с7-Ос- (и образо адсорбировз (!)DE! па((рцмер i!a спликагеле вавшуюся -аминокислоту выделяеот доили силохроме„получать белковые н другие б,! л ).>..

-!влеп)(((м спирта к сгущс)Иному остатку;

С),;,И(1<0>1<1><.!(O;> Ы (<(ТО У(Т(),(С)>) )(01)O (П)Л = ° „- ° - -, ° ИЛ(, ЧС>! (((м

« ; ) Г 1, ) у-,й ацит(— g аминОкислОту из сзспцнене(ых фильЧСо(3ания t- -аминокисlilt!! >l „L «" П>) !Р i i i 1 t >»<".,. .. - < ii 1. (.ЛО l t»l» .- -СЕ> . О ГЬ ВЬ(ДС«ЛЯ(ОТ f1 Pl(ПОМОЩИ КОЛОНКИ С Ка ТН<3 (>1 (i i Н t ti! (! (, питом КРС-4 в водородной форме. (f< >71 „ 1(>ПИ ((!) (if)".t(ajttl! Н(>Р(1<с(!»i)P(t>tt>EI ПЦИ П ) и м р и м е р 1. 10 r (f(v) Онового портила ь(,(.И(я )> (1„1, < (<»)О>(.:

>-» -,))СР ка свиных почек суспендпруют в 50 мл ох.—

)» ) », », > ( л<3?кде>!Пo((дистиллирОВапной BВиь! и Bb!((ep :() >)(> !,;! t. ) )<>1,(! . )) (7 (tttt(!(ре!. >at((< и ($( о . ,(. . : - ". живсп)т при 2-4 С, периодически не емешиКОЛИ>!"..1 !)С! Р((Ц()Н!И f<=(HO(i 1(((И)((3<»((П(ОК ИСДотЬ(Ba(f» 0 час. К полученной суспеFI:)ии добавГО(Р>)- f r> ll t ) .i t>:t< : т(3<Зр)» )»(f E> ОТО()ОГС> уСТ(1- Ля«)

r OZ <» - i r » П»! „" -, " .) . - >(«) ф! ЛЬтрацИО(1 Ый uopotttot: фИЛЬтрО!ЕЕрЛИт

l(t!>,!,;,! н <»;;><,и fT>it()rr!(>aft(>1b(i> (3otjftf>(> i а>,,(-. <7м ф(, 1 -к<« (Около Я г/, и )р<)ме!(.Нв(!ют содер)ки>,> lt ))>; ° !i i; --<"r (! )((! (!. .i! > f>.1!(ff »t )7 t((>»М(i×Ñ С мое 8 отфпльтровыв,ж)т па воронке Бк>)хнера. кОН .!и«..! ) «!t! > at<(,.Ioit bt ., 0,1-0,"-.>и) . СООтко>,!П«.i i «1!1 в с)!1;1!.трат() экстракт (с ()цилазВстс:т(:.$ l()((>с .<О Дик tf О.пи (l(H(с;и вс> t ii » < ) *,,! . ». » . l (. н :*l af>; (tl(31)o<. pE>f<3 с)Н О(10 2 О )0 мк м Оль/ч>«с л(>х ) >() . < > ! ° .>It (>и (>)с i! !3П >< ьк) (хр((п (((.(С !) (), i . 1 (, ;;,<- Äl;; гно >(бу @ () с )ас) >)>; < -.

Е <).:» П, .= - .", )ОС; " ..У- СРДЗУ ((ст((7.)ЬЗУН т ДЛЯ П()Н((.О(ОВЛС)НИЯ ПРЕю)": . < .1 о!<0,(о 7 j (1(.:пс(>1) :ун>т для»«)пол-- паратов )>((4>!(<И)ской кс. 2 г c) Г .

:с - - .:, „ . < . г силохрома (80 суспендируют с 10 мл

»(Oft(< H < r>yi > .!i>t»iOj! Пля >> itt)(< <»t(yi (it ((0601 экстракта и выдерживают, периог(ически пере(Оц(с Й воль(д tя попре))E»(D< t (01 О пp>tt>((ecc>at) или м<) f((IEBQEI 2 0 ч()с и )и 2-4 О(. . 3 ....атем силоотфи111«трое)>,tB:<юг на воронке Б(ох((ера и еще @ х )Ом )тф е . х()01! о tуt(ль тров (Ba!o (i(a Bopoftze >..>юхнера °

Вла И(Hb(tv! () !1))СЯ Т B < С)< 7 L ((((й П»» i»DO()С:ПНЯ

=...-:, Е,,)О>:,с». i р-- пр()мь(вак)т 1 Н, хлористым натрием в 0 1М

QrUEEfи,, п()0(3(>(е(l fife и!)Опе(с

» г .. ." .:. "": ., = .;... фсеф)ате(о((буфере О. 1<»<(и фосфатным буфером

j !р 1 > су(.)ес:твлеittil(не((р><)р(..>(в:.(О> о прое(ес- 1 ()<7

Г е)< 7 2 дс«0 >утс твия 60(еков в про(<(ь(виой жнем»

<=()О > 7 р>t «!(ку с п()(»г>пр(1, с>(<". Имн(обнли-)o ко

; ...„.)(1 у:, > - 7 ° ... Г... з - .сги. Кое)троль Ва содер)канием белков в

BarrHo.I 7;(ta!tao!,(, гер>постат; ровапн к> па тем-™ е .<

1 . >, " .!, °,: Г,, >. .i!

1е ат <,",<с) (((с >. Мс (<).н) уль((. . ep«fo жидкОстях Осуществл(ПОт 10/о нОй т )((хлор» стан()» >!()0((у:..)<Лют;.,- с (нор р(3((оми (вской уксусHOH кислотой,и г(О Лоури. Ацилазняя ац1гла>)l!>;,!(1 (- "toi t c ак(>ц <-.!r.„ 1")ест(«10 H Обы

;, ) ° -»)с; -.-- -,, -. -,, -.:; ...:, „..; BK(f(DHocTh (обнаруживаемая тонкослойной в - " ест -) ()1<1(>. — .„»"ем(!Т(<>z=f<.7!0(b(успе= хроматографией по гидро из л у испыт емой ц(<», - ° (м!i», кtt : ",,! >>(Озп>?1>па(» f „0>(((et( цп..: .. с .; .-:;,-....,"„„, „);: с г<омоц(ью нингидрина по концентрации воз). > < (",, - >i< - .,,"-.!i. ) < 1>: ник(инокислОгь()

ДОСГТ! .> . . ПО<щи> f .;::(l(O((HЕН 7 P!)ÖHÁ ИСХОДПОЙ Около 1000 мкмоль/час освобождаемого и аЕ.BM j

ТОГО дл>(иммОбилин)ации„ 523

Составитель Л. Иоффе

Редактор 3. Бородкина Техред Г. Родак

Корректор A. Лаккда

Заказ 4897/385 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Подученный препарат сорбированной на силохроме ацилазы загружают в колбу с

300 мл 0,5М раствора рацемического Й

-ацетил-аланина, рН которого устанавливают концентрированным аммиаком на 7,2 и выдерживают в термогтате при 37оС в течение 24 час. По окончании реакции иммоби лиэованной фермент отфильтровывают и, промыв 0,1 М фосфатным буфером с рН7,2, используют вторично. Полученный в резуль- ð

I тате прошедшей реакции раствор упаривают в вакууме до сиропа при 45оС. После охлаждения до комнатной температуры добавляют 30 мл этилового спирта и оставляют на 16 час при 4оС для кристаллизации. 3а- 15 тем кристаллы А -аланина отфильтровывают, промывают спиртом и высушивают при 50оС до постоянного веса.

Выход идентифицированного гонкослойной хроматографией «а силикагеле (в системе бутанол:уксусная кислота:вода, 4:1:1 по объему) хроматографически однородного

1. -аланина 4,7 r (70ОО),(.3, - . 14,1о (с = 1,5 и. HCj ).

Фильтрат после отфильтровывания - -ала-ц нина упаривают на вакуумном роторном испарителе при 45оС до небольшого (около

50 мл) объема и рН раствора добавлением

2 н. соляной кислоты доводят до 2,5-3.

Подкисленный раствор пропускают через Ко 30 полку со слоем 0,9х30 см катизнитаКРС-4 в водородной форме, через которую затем пропускают листиллированпую воду. Далее собирают фракции и проверяют на отсутствие свободных аминокислот реакцией с нинги- 35 дрином, Объединенные кислые фракции упа1 ривают в вакууме на роторном испарителе до сиропообразлого состояния и оставляют на холоду кристаллизоваться. Перекристаллиэовыва1 >т из ацетона. Выход ацетил- >э — 40

892

-аланина 1,1 г; т.пл, 125оС;

62, 2 (с = 1, вода) .

Пример 2, Экстракт ацетонового порошка почек (с активностью 1800 мкмоль/

/час L -аланина на 1 мл) получают по примеру 1, Сорбцией ацилазы из 50 мл экстракта на 10 г силохрома С- 80, как в примере 1, получают препарат сорбирован« ной на силохроме ацилаэы с активностью

I около 900 мкмоль/час L -аланина на 1 r исходного силохрома. Этот препарат в виде суспенэии в 0,1 М фосфатном буфере с рН

7,2 загружают в снабженную рубашкой колонку (20х2 см), избегая пузырей воздуха в массе сорбента. Затем промьваэол колонку 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,2.

После этого через слой иммо(илизованной ацилазы в колонке, гермостат; .:«анной на

37оС с помощью ульгратермск:.:па, пропускают 500 мл 0,1 М раство,;л рацемического ацегилаланина с рН 7, -7,4, уста1 новив скорость протекания, обеспе ни ваюшую завершение реакш1п дезацетилпрования, эа котс

I >ой следят при помощи нингидриповой реакции.1

Йалео из раствора выделяют и характеризую" сроматографически однородный Q — алании так >ке, как в примере 1, Выход 1,8 г (80 oI; (< ) +142 (с = 25 н. НС().

Ф ормула i. зобрете ния

Способ получения L -аминокислот путем асимметрического гидролиза рацемцческих N -ациламинокислот с помощью иммобилизованной ацилазы в качестве к:.тализагора, отличающийся те...., что, с целью интенсификации процесса,;.эследний ведуг в присутствии ацилазы, иммобилиэованиой неорганическим носителем, таким, как силикагель или силохром.