Цистеинсодержащие пептиды для синтеза пептидных гормонов окситоцина и вазопрессина

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свнд-ву -. (22) Заявлено 06.08. 74 (21) 2051647/04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.07.76.Бюллетень №,28. Кл.

07 С 103/52

Государственный комнтет

Совета Мнннстрав СССР оо делам нзаоретений н открытий

ДК 547.964.4. .07 (088.8) (45) Дата опубликования описания 05.05.77 (72) Авторы изобретения

С, Я. Микста, О. С. Папсуевич и М. B. Фридермане

Латвийский филиал Всесоюзного ордена Трудового Красного

Знамени научно-исследовательского института химических реактивов и особочистых вешес",в (71) Заявитель (54) ЦИСТЕИНСОДЕРЖАШИЕ ПЕПТИДЫ ДЛЯ СИНТЕЗА

ПЕПТИДНЫХ ГОРМОНОВ OKCHTOUHHA

И ВАЗОПРЕССИНА -comes,-ä )

Изобретение относится к новым химичес, ким соединениям - к защищенным цистеинсодержашим пептидам общей формулы сярнсо ., сн,)унсо-(1 (pp ) QQ-яСу -Ту.-к- 1п-Лап-СФ -У (т) где R - Не или Phe

Ю

g-0CH wm ОН, (СНа) С-0-СО (ВОС) оторые могут быть.йспользованы; в качестЬе промежуточных продуктов в синтезе пеп тидных гормонов окситоиина и вазопрессина, нашедших применение в медицине.

Известны цистеинсодержащие пептиды, защищенные бутилкарбинольной и бензильной go группами, используемые в синтезе пептидных ц гормонов, - например, окситоцина.

Использование подобным образом заши- шенных цистеинсодержаших пептидов пс зво1 тяет получать целевой продукт с выходом. Ь9%, тогда как применение предложенных ,соединений увеличивает выход целевсго про дукта до 70%.

Преимуществом новых соединений являетс." также их хорошая кристаллиэуемость, вьк ькие выходы, устой п:вость к воэдейст.-нто различных реагентов, применяемых в синтезе пептидов (кислоты, едкие щелочи, тризтпЛамин и другие органические основан я).

11истеинсодержашне пептиды обшей форМулы(Х) получают конденсацией соответствуто ших аминокислот или пептидов известными Методами, например, методом смешанных ангидридов.

Пример l. Этиловый эфир ВОС- 6-бензамидометил-цистеинил-тироэина (Х) . о

К охлажденному до -15 С раствору 7,08г (20 ммоль) BOC- 8 -бенэамидометил-цистеина в 25 мл диметилформамида прибавляют при перемешивании 2,2 мл (20 ммоль) ! М -метилморфолина и затем 2,4 мл (2С ммоль). изобутиловогo эфира. хлоругольной кислоты, Яереэ 15 мин добавляют охлажденную д -10 С смесь 4,91 г (20 м,"лопь) r»a523083

4 ва, т. пл, 173-175 С, с(-1 = 39,2O (-1,0, диметилформамид) .

Найдено,%: С 52,14; Н 6,36; М 11,58.

21 30

Вы-ыслено, %; С 52,27; Н 6,27; Ц 11,61.

Пример 4. Метиловый эфир BOC-глутаминил-аспарагинил- 6 -бензамидометил-цистеина (I V)

4,83 (10 ммоль) метилового эфира BOC- аспарагинил- 6 -бензамидометил-цистеина обрабатывают раствором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (1:1) в течение

50 мин. Затем раствор упаривают в вакууме при комнатной температуре и к остатку прибавляки абсолютный эфир. Полученный осадок фильтруют и высушивают в вакуум-эксикаторе над едким кали. Получают 4,57 г (92%) трифторацетата метилового эфира аспарагинил- 5 -бензамидометил-цистеина. о

К охлажденному до О С раствору полученного трифторацетата в 45 мл диметилформамида прибавляют 1 мл (9,2 ммоль) и -метилморфолина, 3,4 r (9,2 ммоль) и-нитрофенилового эфира BOC-глутамина и перемешивают при комнатной температуре 48 час.

Затем продукт осаждают эфиром, осадок фильтруют и промывают последовательно

0,05 н. раствором серной кислоты, водой, 0,5 н. раствором бикарбоната натрия, во— дой.

Продукт перекристаллизовывают из смеси диметилформамида и эфира. Выход 4,4г (80%), Т, пл. 1 75-1 76 С, (.) > = -27,1 (с-0,2, диметилформамид) .

Найдено,%: С 50,98; Н 6,32; и 13,66.

26 38 9 6

Н 0 К S

Вычислено,%: С 51,14; Н 6,27; Й 13,76.

Пример 5, Метиловый эфир BOC-изопейцил-глутаминил-аспарагинил- -бензамидометил-цистеина (Y )Найдено," о. С 59,40; Ч 6,57; И 7,52.

С Н О 1Ч

27 35 7 3

Вьг а слено, %: С 59,43; Н 6,47; К 7,70.

П .. и м е р 2. BOC- -бензамидометп; -ш. стеинил-тирозин (П).

К 2,72" (5ммоль) этилового эфира ВОС— S-бензамидометил-цистеинил-тирозина прибавляют 20 мл 0,5 н. раствора едкого натра

Л и перемешивают при комнатной температуре

50 мин, Затем реакционную смесь фильтруо ют, фильтрат при охлаждении (О C) подкисляют С,5н. соляной кислотой. Выпавший оса-ЗО док отфильтровывают, промывают водой и кристаллизуют из смеси метанола и воды.

Получают 1,8г (65,2%) продукта, т. пл.

82-84 С, о г °

c J =-12 (с-0,2, этиловый спирт), содержание основного вещества 99,5%.

Найдено, %: С 54,50; Н 6,11; М 7,58.

С Н 0 N Sõ2Н О

25 31 7 3 2

Вычислено,%: С 54,24; Н 6,37; Й 7,59. 4О

Пример 3. Метиловый эфир BOC-аспарагинил- 5 -бензамидометил-цистеина (ш). о

К охлажденному до -15 C раствору 3,7г (16 ммоль) BOC аспарагина в 10 мл диме- 45 тилформамида прибавляют при перемешивании

1, 7 6 мл (1 6 ммоль) К -метилморфолина и затем 1,8 мл (15 ммоль) изобутилового эфира хлоругольной кислоты. Через 10 мин добавляк т охлажденную до -10 С смесь

3,04 r (10 ммоль) гидрохлорида метилового эфира S -бензамидометил-цистеина и 1 1мл

1 -метил.аорфолина в 30 мл диметилформалда. Смесь перемешивают 3 час при -15 С, атем реакционную смесь гидролизуют при 5

0 r насыщенным раствором бикарбоната натрия при рН 8 в течение 1 час. Продукт йьделяют прибавлением 150 мл воды, фильтруют про ьгзают водой. После перекристаллизации из ацетона получают 4 г (83%) вещест-60 рохло1. этилового эфира тирозина и 2, - мл (20 ь....;,ть) и -метилморфолина в 30 мл диметилформамида. Смесь перемешивают при о

-10 С в течение 3 час и при комнатной

-. т .;;.сратуре 1 час. Затем продукт реакции осаждают водой, экстрагируют этилацетатом, промывают последовательно 0,05 н. раствором серной кислоты, водой, 0,5 н. раство— ром бикарбоната натрия и водой. После высушивания органического слоя над безвод— ным сульфатом натрия, растворитель упаривают в вакууме. Полученное бесцветное масло кристаллизуют из смеси этилового спирта и гексана. Выход 9,3 г (85,2%) т. пл. о zo е

73-75 С, Г -3 = -21 (с-0,5, этиловый1 спирт), 6,4 г (10,5 ммоль) BOC-глутаминил-аспарагинил- S -бензамидометил-цистеина обрабатывают раствором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (1:1) по методике, описанной в примере 4. Получают 6,25г (96%) трифторацетата метилового эфира глутаминил-аспарагинил- S -бензамидометилцистеина. о

К охлажденному до -15 С раствору3,84г (16 ммоль) ВОС -изолeйцинa в 40 мл ди— метилформамида прибавляют 1,76 мл (16 ммоль) N -метилморфолина и затем 1,8 мл (1 5 ммоль) изобутилового эфира хлоругольной кислоты. Через 10 мин добавляют охо лажденную до -10 С смесь 6,25 г (10ммопь) полученного трифторацетата метилового эфира глутаминил-аспарагинил- S -бензамидометил-цистеина и 1,1 мл (10 ммоль) hl

523083

-метилморфолина в 40 мл диметилформамида и перемешивают при -15 С в течение 2 час.

Обработкой реакционной смеси аналогично примеру 3 и перекристаллизацией из смеси диметилформамида и эфира получают 5,9г 5 (81,5%) продукта, т. пл. 210-211 С О о"

Э

ГсС1 = -30 с-0,2, диметилформамид).

Найдено, %: С 53,09; Н 7,00; N 13,57, 32 49 10 7

К

Вычислено,%: С 53,10; Н 6, 82; hll3,55.

Пример 6. Метиловый эфир ВОС-фенилаланил-глутаминил-аспарагинил- S -бензамидометил-цистеина (VT ) ..

6,4r (10,5 ммоль) BOC-глутаминил-acl5 парагинил- 5 --бензамидометил-цистеина обрабатывают раствором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (1:1) по методике, описанной в примере 4. Получают 6„25 г (96%) трифторацетата метилового эфира

2« глутаминил«аспарагинил- Ь бензамидометил-цистеина. о

К охлажденному до -15 С раствору 4,3r (16 ммоль) ВОС-фенилаланина в 40 мл диметилформамида прибавляют 1,76 мл (16 ммоль) и -метилморфолина и затем 1,8 мл (1 5 ммоль) изобутилового эфира хлоругольной кислоты. Через 10 мин добавляют охлажденную до -10 С смесь 6,25 r (10 ммоль) полученного трифторацетата метил«оBoro эфира глутаминил-аспарагинил- S -бензамидометил-цистеина с 1,1 мл (10 ммоль)

N -метилморфолина в 40 мл диметилформамида и перемешивают при -15 С в течение

2 час. ./5

Обработкой реакционной смеси аналогично примеру 3 и перекристаллизацией из смеси диметилформамида и ацетона получают

6,1 г (80,4%) продукта, т. пл. 186-187 С.

zo о (d-) - = -17,5 с-0,3, диметилформамид). 4О

Найдено,%; С 55,35; Н 6,20; . Й 12,79.

35 47 10 7

Вычислено,%: С 55,47; Н 6,25;

Й 1293.

П р и е р 7. Метиловый эфир ВОС- S-бензамидометил-цистеинил-тирозил-изолейцил-глутаминил-аспарагинил- S -бензамидометил-цистеина (VII) .

2,3 г (3,2 ммоль) BOC-изолейцил-глу50 таминил-аспарагинил- Ь -бензамидометил-цистеина обрабатывают раствором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (1:l) по методике, описанной в примере 4, Получают 2,2 r (94%) трифторацетата метилового эфира изолейцил-глутаминил-аспарагинил- S -бензамидометил-цистеина. о

К охлажденному до -15 С раствору 1,65г (3 ммоль) ВОС- S - бензамидометил-цистеинил-тирозина в 15 мл диметилформамида 60 прибавляют при перемешивании 0,33 мл (3 ммоль) Я -метилморфолина и затем 0,36мл (3 ммоль) изобутилового эфира хлоругольной кислоты. Через 12 мин добавляют ох— о лажденную до -10 С смесь полученного выше трифтсрапеата 2,2 г (3 ммоль) и

0,33 мл N -метилморфолина в 25 мл диметилформамида, смесь перемешивают при -15 С о в течение 3 час и затем продукт реакци|о осаждают водой при О С, фильтруют и промывают последовательно 0,05 н. раствором серной кислоты, водой, 0,5 н. раствором бикарбоната натрия и водой.

Г

«родукт перекристаллизовывают из с,.еси диметилформамида и эфира. Выход 2,6 г (7оо), т. Пл 21 2 213 С faL32 с -0,1, диметилформамид).

Найдено,%: С 55,32; Н 6,40; Й 12,43.

N S

52 70 14 10

Вычислено,%: С 55,60; Н 6,28;

N 12,47.

Пример 8. Метиловый эфир ВОС- S-бензамидом е=.ил-цистеинил-тир озил-фенилаланил-глутаминил-.- спарагинил- 5 -бензамидометил-цистеина (Ч 1П) .

2,4 г (3,2 ммоль) БОС-фенилаланил-глутаминил«-аспарагинил- 6 -бензамидометил-цистеина обрабатывают раствором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (1:1) по методике, описанной в примере 4. Получают

2,3 r (96 c) трифторацетата метилового эфира фенилаланил-глутаминил-аспарагинил- 5 — бензамидометил-цистеина. о .

К охлажденному до -15 С раствору 1,65r (3 ммоль) ВОС- 5 -бензамидометил-цистеинил-тирозина в 1 5 мл диметилформамида прибавляют при перемешивании 0,33 мл (3 ммоль) Я -, «..—:пм орф олина и затем О, 3 6 (3 ммоль) изобутилового эфира хлоругольной кислоты, Через 15 мпн добавлякт охо лажденную до -10 С смесь выше полученнс го трифторацетата 2,3 г (3 ммоль) и 0,33мл и -метилморфолина в 25 мл диметилформао мида. Смесь перемешивают при -15 С в течение 3 час. Затем процукт реакции осаждао ют водой при 0 С, фильтруют и промывают последовательно 0,05 н. раствором серной кислоты, водой, 0,5 н, раствором бикарбоната натрия и водо«й.

Продукт перекристаллизовывают из смеси диметилформамида и эфира. Выход 2,8г (80,7%), т. пл. 220-222 С, Г -1 =-21 и 0,2, диметилформамид).

Найдено,%: С 56,92; Н 6,02; Й 12,14.

55 68 14 10 2

Вычислено,%: С 57,10; Н 5,92; N12,10.

Пример 9. ВОС- S-бензамидометил-пистеинил-тир озил-из опейцил -глутаминил523683

-аспарагинил- Ь-бензамидометил-цистеин (ix).

К 2,2 г (2 ммоль) метилового эфира

ВОС- -бензамидометил-цистеинил-тироэил изолейш л-глутаминил-аспарагиний- 6 -бено замидометил-цистеина прибавляют 2,64 мл

1,5 н. раствора едкого натра и 5,3 мл диоК- сана и перемешивают при комнатной темпе- ратуре 1 час. Затем реакционную смесь филь о труют, и фильтрат при 0 С подкисляют 0,5н. 10 серной кислотой. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой и перекристаллиэовывают из метилового спирта. Выход

1,5 r (65%), т. пл. 198-200 С, (1

-16 (с-0,1, диметилформамид), содержание .5 основного вещества 99,5% (потенциометрическим титрованием) .

Найдено,%: С 52,63; Н 6,58; N 12,24. и ".ЗН 0

51 68 14 10 2 2

Вычислено,%: С 52,54; Н 6,41;

Ю

М12,04.

Вещества I-Y, VII, IX используют в синтезе окситоцина. Реакция проходит по следующей схеме:

?Ъдролиэом Т получают Ц, ступенчатой конденсацией из Ш получают IV, потом из

TV -V, конденсацией 31 с V получают(У11, из которого последующим гидролизом получают

ТХ. Методом смешанных ангидридов с использованием изобутилового эфира хлоругольной кислоты в присутствии И -метилморфолина в качестве основания из IX получают нонапептидамид И -трет.-бутоксикарбонил-5 -бензамидометил-цистеинил-тирозил-изолейцил-глутаминил-вспарагинил- 6 -бензамидометил-цистеинил-пролйл-лейцилглицина, отшеплением от которого 5 — бензамидометильных защитных групп с одновременным эамыкани м дисульфидного цикла получают

ВОС-окситопин. После отшепления BOG-группы образуется окситоцин, Пример 10. Получение окситоцина, Стадия Т; Получение нонапептидаамида

К -трет-бутоксикарбонил- 6 -бензамидоме- 45 тил-цистеинил-тир озил-изолейцил-глутами— нил-аспарагинил- Ь -бензамидометил-цистеинил-пролил-лейцилглицина.

Конденсацией эквимолярных количеств

TX и амида пролиллейцилглицина методом смешанных ангидридов с использованием изобутилового эфира хлоругольной кислоты в присутствии К -метилморфолина в качестве о основания при темпера-уре -15 С получают нонапептидвмид II трет-бутоксикарбонил— ь -бензамидометил-цистеинил-тирозил-изолейцил-глутаминил-аспарагинил- Ь -бензамидометил-пистеинил-пролил-л йцнлглииина.

К охлажденному до -15 С раствору

0,42 г (0,3 7 ммоль) ВОС- В -бензамидо8

М етил-цистеинил-тир озил-и зол ейцил-глута м икил-аспарагинил- S -бензамидометил-цисте- . ина (TX) в 5 мл диметилформамида прибавляют 0,04 мл (0,36 ммоль) М -метилморфолина и затем 0,043 мл (0,36 ммоль) изобутилового эфира хлоругольной кислоты. Через 12 мин добавляют охлажденную смесь

0,105 r (0,36 ммоль) амида пролил-лейцилглицина и 0,04 мл (0,36 ммоль) Й -метйлморфолина в 5 мл диметилформамида, Смесь перемешивают при -15 С в течение

3 час. Затем продукт осаждают водой при о

0 С, фильтруют и промывают последовательно 0,05 н. раствором серной кислоты, водой,,0,25 н. раствором бикарбоната натрия и во дой.

Продукт перекристаш изуют из смеси диметилформамида и эфира. Выход О,4 r (72%)» т. пл. 207-209 С, СК3 W6 (c-o>1, диметилформамид} .

Найдено,%: С 50,00; Н 6,58; N 12,52

64 90 14 10 2 2

Вычислено,%; С 50,58; Н 7,00;

N 12,90, Стадия II. Получение ROC-окситоцина.

Отшеплением В -бензамидометильных защитных групп от нонапептидаамида Й

-трет.-бутоксикарбонил- 5 -бензамидометил-цистеинил-тирозил-изолейцил-глутаминил- аспарагинил- S -бензамидометил-цистеинил-пролил-лейцилглицина с одновременным замыканием дисульфидного цикла йодом в смеси метанола и диметилформамида получают ВОС окситоцин.

К раствору 0,36 г (1,5 ммоль) йода в

40 мл диметилформамида и 40 мл метанола о прикапывают при" температуре 25 C в течение 2 час раствор 0,44 r (0,3 ммоль) нонапептидаамида И -треп-бутоксикарбонил«

- -бензамидометил-цистеинил тирозил. изолейцил-глутаминил-аспарагинил- 5 -бензамидом етил-цистеинил-пролил-лейцилглицина в 40 мл диметилформамида и 16 мл метанола. Затем реакционную смесь перемешиваюто еще 4 час. После охлаждения смеси до

0 С осторожно прибавляют 0,1 н. раствор тиосернокислого натрия до слабо -желтой окраски, упаривают в вакууме при температуо ре 30 С до маслянистого остатка, Остаток кристаллизуют добавлением эфира, фильтруют и высушивают в вакуум-эксикаторе над едким кали, После перекристаллизации из изопропилового спирта и -эфира получают 0,25r (70%) ВОС-окситоцина, т. пл. 168-172 С, А1 = -60 (С-0,5, этиловый спирт).

Найдено,%: С 47,92; Н 6,72; Й 13,85

48 74 12 14 2

Вычислено,%; С 47,43; H 7,13;

Й 13,54.

523083

СОХНСН -(3zm) Составитель B. Волкова

Редактор Н, Спиридонова Техред М Левицкая Корректор T. Кравченко

Заказ 5035/59 7 Тираж 575 Подписное ЫНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Г1роектная, 4

Стадия 1Ц. Получение окситоцина.

Йля получения биологически активного эптида-окситопина, действием 90 /-ной рифторуксусной кислоты от ВОС --окситоциа отщепляют ВОС-группу.

24 мл (0,02 ммоль) BOG-окситоцина обьбатывают 4 мл 90 -ной трифторуксусной аслоты при комнатной температуре в течете 40 мин. Фильтруют, к полученному раст зру прибавляют 80 мл воды и упаривают о вакууме при 30 С. Затем прибавляют еше

0 мл воды и лиофилизуют. Получают 14,7мг

70 ) окситоцина. Г 3y = -22 (с-0,1, го „о

М уксусная кислота).

Описанным способом без предварительной 15 жестки получен биологически активный пре рат окситоцина с активностью 20 М. Е,/мг.

По литературным данным лиофилизованный

>епарат окситоцина обладает следуюшей ак вностью: каталогфирмы" Я тра" США, 971 — 15 М.Е./мг, каталог фирмы "$е ча

РГ. 1972 — 1 О M. Е. / мг, каталог фирмы

:йЬ осh,em,, США, 1972 — 10 M. Е. /мг.

Вещества I-I Y, YI u Ч111 используют в нтезе вазопрессина. Реакции проходят по 25 тедующей схеме, Гидролизом I получают II, ступенчатой нденсацией из Ш получают IY, потом из

V-YI, конденсацией II c YI получают Ш которого последующим гидролизом полу- 30 ют BOG 8 -бензамидометил-цистеинил..ирози и-фенипапанип-глутаминип-аспарагинипS -бензамидометил-цистеин.

Пример 1 . Получение вазопрессина.

Конденсацией эквимолярных количеств 35

ЗС- 6 -бензамидометил-цистеинил-тирозил10 фенилалачил-глутаминил-аспарагинил- S -бензамидометил-цистеина и амида пролиларгинилглицина методом смешанных ангидридов с использованием изобутилового эфира хлор угольной кислоты в присутствии N -метилморфолина в качестве основания при темпео

-ратуре -15 С можно получить нонапептидамид ВОС- Ь -бензамидометил-цистеинилтирозил-фенилаланил-глутаминил-аспарагинил- 5 -бензамидометил-пистеинил-пролиларгинилглицина.

Одновременным отщеплением -бензамидометильных защитных групп и замыканием дисульфидного цикла получают BOC-вазопрессин, из которого отшеплением ВОС-группы 90 /-ной трифторуксусной кислотой получают вазопрессин.

Ф ормула изобретения

Цистеинсодержащие пептиды общей формугде 1 Не или Рйе

- 0 Н или OH, (H3)> С-0-CO (ВОС), в качестве промежуточных продуктов для синтеза пептидных гормонов окситоцина и вазопрессина.