Способ количественного определения веществ, способных к ферментативному окислению в водном растворе

 

1 иа1вн r :. э .р т 4 %

Союз Советских

Соцналмст ческих

Республик (11) 542484

ИЗОБРЕТЕМ ИЯ (61) Дополнительный к цатенту—

4 (22) Заявлено 16.06.72 (21} 1797434/04 (51) М. Кл. (23) Приоритет — (32} 18.06.71 (31) P 2130308.2 {33) ФРГ (43) Опубликоваио0Б.01.77.ÁroëëåòeHü ¹ 1 (45) Дата опубликования описания 06.04.77

5-01 ff э7/48

Гасударстаеииый комитет

Совата Мииистроа СССР по делам изаоротаиий и открытий (53) УДК 543 24. . 087 (088.8) (72) Авторы

Иностранцы изобретения Александр Хаген, Ханс Ульрих. Бергмайер, Вольфганг Грубер, Клаус Бокамп и Дитер Яворек ".-"РГ) Инострытная фирма

Берингер Маннхайм ГмбХ (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕ1ЦЕСТВ, СПОСОБНЫХ К ФЕРМЕНТАТИВНОМУ ОКИСЛЕНИЮ

В ВОДНОМ РАСТВОРЕ

Изобретение относится к способу количественного определения веществ, способных к ферментативному окислению в водном растворе.

Известен способ кэличественного определения веществ, способных к ферментативному окислению в водном растворе, путем введения анализируемой пробы в водный буферный раствор, циркуляции полученного раствора через кэлонку, заполненную энзимом, связанным с носителем, с последующим анализом буферногэ раствора, например определением количества кислэрэда в нем известным образом.

Однако известный способ длителен и недостаточно чувствителен.

11ель изобретения — устранение указанных недостатков — достигается тем, что анализируемую пробу вводят в поток водного буферного раствора порциями при постоянной скорости потока и циркуляции буферного раствора с постоянной скоростью.

Пример 1. Определение Д-глюкозы в сыворотке протекает по схеме:

Д-глюкоза + АТР гексэкиназа глюко э-6-фэсфат + АДР, глюкэзэ-6-фэсфат +

+ ЯАДР + Н О глюкэзэ-6-йэсйат егнд:э— геназа--6 фэсфэглюкэнат + NA3PH - H+ (где АТР— аденэзинтэифэсфат, АДР— аденэзиндифэсфат, Ы АДР— нпкэтинамидаденин-динуклеэтидфэсфат, ИАДРН -вэсстанэвленная форма ИАДь )

Кэлэнку диаметром 1 см на высоту

1 см заполняют смесью (2:1) глюкоз. 6-фэсфатдегидрэгечазы, набухшей в воде, на носителе с удельной активностью 27ед/г и гексэкиназы на носителе с удельной активностью 80 ед/г.

Вэ всех примерах в качестве детектора применяют фэтометр Эппендорфе, .опти ескую плотность измеряют при. 336 нм и регистрируют с помощью кэмпенсационQQ ного самописца Эппендэрфа.

Методом фэтэметрии определяют содержание М АДРН в буферном растворе, прону ценном через колонку с энзимом.

В качестве буферного раствэра приме..=. от 0,3М триэтаноламинный буфер (рН 7,5), 542484

3 содержащий 4 ммоль сульфата магния, 0,44 ммоль ЙАДР и 0,59 ммоль

ATP. Пробы сыворотки, в которой определяют содержание Д-глюкозы, ввэдят с интервалом 1 мин. Пробы 1-7 содержат к

200, 100, 100, 200, 300, 50 и 50 мг глюкозы в 100 мл сыворотки соответственно.

Получена прямая пропорциональная зависимость (вплоть до концентрации 200мг/

/100 мл) между содержанием Д-глюкозы 10 в пробе и количеством образовавшегося

ЯАДРН (см. фиг. 1 и фиг. 2)

Пример 2. Определение Д-глюкозы в сыворотке проводят аналогично примеру 1, но в буферный раствор ввэдят дополнительнэ 0,12 мг/мл гексокиназы с активностью 16,5 ед/мл и 0,12 мг глюкозе-6-фосфатдегидрогеназы с активностью

17 ед/мл, и получают сходные результаты.

Пример 3. Определение гексэкиназы в водном растворе протекает пэ схеме:

Д-глюкоза + АТР гексокиназа глюкозо-6-фосфат + АДР, глюкозо-6-фосфат... .» — . . . - -.z

+ геиаоа Б-фосфоглюконат + ЯАДРН + ук

Поскольку лромежуток времени между началом реакции и измерения.1и на детекторе постоянный, то п э к оличеству образ овавшегося ЙАДРН можно судить об ак— тивности гексокиназы. 30

Колонку заполняют глюкэзо-6 — фэсфатдегидрогеназой, набухшей в воде, на носителе с удельной активностью 27 ед/мл. Между детектором и резервуаром располагают стеклянную спираль (внутренний диаметр 35

2,5 см, длина пробега 70 см), которую нагревают до 95 С в водяной бане. На спирали прэисходит инактивация ранее измеренной гексокиназы.

В качестве буферного раствора приме- 40 няют 0,3М триэтаноламинный буфер (pH 7,5), содержащий 4 ммоль сульфата магния 0,4 ммоль КАДР, 0,59 ммоль АТР и 20% глюкозы

Пробы водного раствора гексокиназы вводят с интервалом 1 мин. Используют разбавление 1:2 и 1:4, а также неразбавленный раствор гексэкиназы (0,1 мг протеина .и 1 мл). Между концентрацией гексокиназы и показаниями самописца

50 наблюдается линейная зависимость (см. фиг. 3) .

Пример 4. Определение Д вЂ” глюкозы в сыворотке с помошью глюкэзокси55 дазы протекает по схеме:

Д-глюкоза + О + Н О глюкозоксидаза глюкэновая кислота + Н О.

Колонку заполняют глюкозоксидазой с удельной активностью 200 ед/г, набухшей в воде, на носителе.

В качестве детектора применяют продажные электроды, чувствительные к кислорэду, в сочетании с прибором для измерения количества кислорода.

Скорость обтекания электрода 7,5 см/сек, диаметр входного отверстия в проточной ячейке 1 мм.

В качестве буферного раствора применяют 0,2М раствор фосфата калия, содержаший 18 ммоль иодида калия, 7,5 ммоль пентамолибдата аммония и 800 ммоль хлорида натрия. Пробы сыворотки вводят с интервалом 1 мин. Пробы 1-7 содержат

100, 100, 100, 200, 300,400 и 500 мг глюкозы в 100 мл сыворотки соответственно.

Результаты опытов приведены на фиг.4 и фиг. 5.

Пример 5. Определение мочевой кислоты протекает по схеме: мочевая кислота + 2Н О + О уреказаалг лантоин + Н О + СОл

Колонку заполняют уреказой на носителе с удельной активностью 3 ед/мл. Диаметр колонки 1 см, высота заполнения 5см.

Скорость обтекания электрода 3,5см/сек., диаметр входного отверстия в проточной ячейке 1 мм.

В качестве буферного раствора применяют 0,2М раствор бората (рН 6,5), в котором растворено 600 ед/мл уреказы.

Пробы раствора, в котором определяют содержание мочевой кислоты, вводят с интервалом 6 мин. Пробы 1-6 содержат 5, 10, 15, 30, 4 и 60 мг мочевой кислоты в 100 мл пробы соответственно. формула изобретения

Способ количественного определения веществ, способных к ферментативному окислению в водном растворе путем введения анализируемой пробы в водный буферный раствор циркуляции полученного раствора через колонку, заполненную энзимом, связанным с носителем, с последуюшим анализом буферного раствора, например определением содержания кислорода в нем известным методом, о т л и— ч а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения точности анализа и ускорения его, анализируемую пробу вводят в поток буферного раствора порциями при постоянн и скорости потока и циркуляции буферного раотвора с постоянной скоростью.

542484

0, 150

О, 125

0, 100

0,075

0,0о0

002

О, 150

0,1гу

0100

О,O7Z

ОО50

150

10о

Риг. 2

Показания мноонт иа

0,175

/7окалмия самописца

0175

5 фцг у Номер уота г00 Zr0

Концентрация, иг!1оо ил

Ю08 og

069 т ,10

70 тою

8омаииия сагтол д с а

/чаи жю

L а о иС а

И q

542484 т д Ре/8. с7

1 Pmdddne—

Ю 7

Hump лрасЪ

5424"4

"1 ! 1

0 100 200 00 Ф00 500 ЮО концентраций, Р1/8. <5 пг//оогы

Составитель С. Хованская

Редактор Т. Шарганова Техред A. Демьянова Корректор B. ЗоРина

Заказ 601 1/39 Тираж 1010 Подписное

ЫНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открь-,тий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 1