Способ определения активности анти-биотика лактоцида при спиртовом бро-жении
Союз Советских
Социалистических
Реснубпик
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
"Ъ -С (61) Дополнительное к ввт. свид-ау (22) Заявлено 240979 (21) 2828659/28-13 (51) М. Кл. G 01 N 33/14 С 12 G 1/00 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий Опубликовано 230681,Бюллетень № 23 Дата опубликования описания 2 30681 (53) УДК 663.52 (088 ° 8) (72) Авторы изобретения A.Ï. Рухлядева и С.П. Дементьева Всесоюзный научно-исследовательский институт продуктов брожения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКА ЛАКТОЦИДА ПРИ СПИРТОВОМ БРОЖЕНИИ Изобретение относится к спирто- 1 вой промышленности, в частности к способам определения активности антибиотика лактоцида,, используемого в качестве антисептика при спиртовом брожении. Лактоцид является специфическим антибиотиком молочно-кислых бактерий. Эти кислотообразующие бактерии могут развиваться при спиртовом брожении, угнетать развитие дрожжей и оказывать ингибирующее действие на ферменты. Поэтому применение лактоцида, подавляющего жиэнедеятель- 1з ность кислообразующих бактерий, имеет большое значение в спиртовой промышленности. Повышается эффективность производства эа счет снижения потерь углеводов, которые эатрачива- 20 ются на развитие кислотообразующих бактерий,и уменьшения количества несброженных углеводов в бражках. Известны способы определения активности.лактоцида, заключающиеся в, том, 25 что культивируют молочнокислую бактерию в присутствии разного количества лактоцида и его отсутствии и определяют, при каком количестве взятого антибиотика подавляется им жизнедеятель-30 ность бактерий по прозрачности среды визуальным способом P1) . Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения активности антибиотика лактоцида при спиртовом брожении, предусматривающий культивирование молочнокислых бактерий в присутствии и отсутствии лактоцида и определение в опытной и контрольной пробах степени подавления лактоцидом жизнедеятельности молочнокислых бактерий по количеству продуцируемой бактериями молочной кислоты, титруемой раствором гидроксида в присутствии фенолфталеина с последующим расчетом активности лактоцида..В качестве молочнокислых бактерий используют 3 hermobacterium сеrea1е Zafàr штамм УП, культивирование осуществляют »а солодовой питательной среде в течение 4 .. при 32 С Г27. Недостатком данного способа является сложность приготовления питательной среды — солодовой, используе мой для культивирования, образование недостаточного количества молочной кислоты, продуцируемой бактериями Jhermobacterium cereale 2afar, т 84073б требует применение разбавленных сантинормальных растворов гидроксида, так как применение более концентрированных — децинормальных, снижает точность анализа, вследствие малого расхода титранта на определение. Цель изобретения — повышение точности определения,. упрощение и ускорение процесса. Цель достигается тем, что соглас,но способу определения активности антибиотика лактоцида при спиртовом брожении, предусматривающему культивирование молочнокислых бактерий в присутствии и отсутствии лактоцида и определение в опытной и контрольной пробах степени подавления лактоцидом жизнедеятельности молочнокислых бактерий по количеству продуцируемой бактериями молочной кислоты, титруемой раствором гидроксида в присутствии фенолфталеина с последующим расчетом активности лактоцида, иэ молочнокислых бактерий используют Lactobactei ium bulgaricum, культивирование их осуществляют на обезжиренном молоке при температуре 38-40 С, а определение количества продуцируемой бактериями молочной кислоты ведут путем титрования всего количества культуральной жидкости опытной и оконтрольной проб, содержащих молочную кислоту, децинормальным раствором гидроксида в присутствии фенолфталеина. Способ осуществляют следующим об- . разом. Готовят питательную среду. Для этого отвешивают 90 r сухого обезжиренного молока и растворяют его в 1 л воды. Вначале 100-150 мл водопроводной воды нагревают до 65 С и заливают ею осадок молока, приливая к нему воду маленькими порциями, тщательно перемешивая воду с сухим молоком так, чтобы не образовалось комков. Затем суспензию фильтруют через 4 слоя марли на большой воронке. Остальной порцией водопроницаемой воды (900-850 мл) количественно омывают емкость, где растворялось молоко (ступка, стакан или другая посуда), эти сливы фильтруют через тот we фильтр, одновременно растворяя ос-ъ тавшиеся на фильтре комочки молока. Получают 1 л обезжиренной молочной среды. Эту среду по 100 мл разливают в колбы 250 мл и по 20 мл — в пробирки емкостью 50 мл. Затем пробирки и колбы закрывают ватномарлевыми пробками и стерлизуют в течение 20 мин при давлении 1 МПа (1 атм) . В качестве тест-организма молочнокислых бактерий используют Lactobacterium bulgaricum. Посевную молочнокислую бактерию готовят следующим образом. 100 мл приготовленной молочнокислой среды стерильно заливают культурой молочнокислых бактерий и инкубируют в течение 4 ч при 40 С. Для поддержания культуры бактерии в актив5 (О ЗО 65 ном состоянии ее пересеивают на све>кую среду через каждые 10-15 дней. Для пересеивания берут 10 мл культуры бактерий и инкубируют, как было указано. Полученную культуру бактерии хранят в холодильнике. Для проведения анализов требуется свежая культура бактерии, которая должна быть пересеена на сутки до проведения опыта и инкубирования. После инкубации перед использованием бактерии хранятся в холодильнике до следующего дня. На следующий день перед использованием культуры бактерии в опыте ее из холодильника переносят в термостат с температурой 40 С, там ее разогревают в течение 1,5-2,0 ч и используют для определения активности. Приготовление 0,05%-ного раствора препарата лактоцида в воде. На аналитических весах отвешивают 100 мг препарата лактоцида и растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды в колбе вместимостью 250 мл, закрывают колбу ватномарлевой пробкой, помещают в кипящую водяную баню, где выдерживают в течение 5 мин. Затем содержимое колбы перемешивают и в горячем состоянии фильтруют через бумажный пластный фильтр. Если получился мутный фильтрат его вторично ) фильтруют через тот же фильтр до образования прозрачного фильтрата. Этот фильтрат разбавляют в два раза холодной дистиллированной водой. Полученный 0,05%-ный водный раствор лактоцида используют сразу для определения активности. Для проведения анализа активности испытуемого препарата берут две пробирки вместимостью 50 мл и наливают в каждую по 20 мл стерильной молочной среды, нагретой до 40оС. В каждую пробирку в стерильных условиях приливают по 2 мл раствора культуры бактерии Lactobacterium bulgaricum. Содержимое пробирок перемешивают, в одну добавляют 1 мл 0,05%-ного раствора препарата лактоцида и 2 мл стерильной дистиллированной воды. В другую пробирку добавляют 3 мл такой же воды, зта проба является контрольной. Пробирки закрывают ватномарлевыми пробками, энергично перемешивают и инкубируют в термостате при 40 С в течение 4 ч. По истечении этого времени пробирки с опытными и контрольными пробами вынимают из термостата и содержимое каждой пробирки переносят в две конические колбы вместимостью 200 мл.Пробирки споласкивают 50-55 мл дистиллированной воды и ополоски помещают в колбы с реакционной жидкостью. В колбы добавляют по 3-4 капли раствора фенолфталеина и образовавшаяся 840736 8,93 (Мк- Мок). К+ о,ОВ25 Д A= " " - 0 к а Формула изобретения ВНИИПИ Заказ 4752/64 Тираж 907 Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 молочная кислота в каждой колбе оттитровывается 0,1Ъ-ным раствором гидроксида натрия. Титрование ведут до слабо розового окрашивания. В результате титрования определяют количество раствора гидроксида натрия,которое пропорционально количеству молочной кислоты, образовавшейся при культивировании бактерий в присутствии лактоцида и без него. Активность лактоцида вычисляют по формуле где Ак Д вЂ” активность лактоцида; у - количество раствора гидроК ксида натрия, затраченного на титрование контрольной пробы, мл; V д — количество раствора гидроксида натрия, затраченное на титрование опытной пробы; К вЂ” поправочный коэффициент к раствору гидроксида натрия; 2S а — количество препарата лактоцида, внесенное в реакционную среду; 893 8 00925 в постоянные коэффициенты, полученные на основании изучения зависимости уменьшения количества молочной кислоты от количества лактоцида, введенного в среду. 3S Пример. На анализ берут препарат антибиотика лактоцида в количестве 100 мл на 100 мл дистиллированной воды. Антибиотик. помещенный в коническую колбу вместимостью 250 мл, кипятят, охлаждают и разбавляют холодной водой вдвое. В 1 мл разбавленного раствора содержится 0,5 мл лактоцида. В две пробирки наливают по 20 мл стерильной молочной среды, приготовленной из обезжиренного молока, 45 нагретой до 40 С. Затем в пробирки приливают по 2 мл раствора культуры бактерий Lactobacterium bulgaricum, содержимое перемешивают и в одну пробирку добавляют 1 мл 0,05Ъ раствора 50 лактоцида и 2 мл стерильной, дистиллированной воды (опытная проба), а в другую — 3 мл такой же воды (контрольная проба) . Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при 40 С в течение 4 ч. После этого пробирки вынимают из термостата, содержимое переносят в конические колбы и оттитровывают 0,1 н раствором гидрокси- да натрия, в присутствии фенолфталеина, до слабо розового окрашивания. На титрование контрольной пробы нужно 20,3 мл 0,1 н раствора гидроксида натрия и 15,8 мл опытного. Поправочный коэффициент К = 1,05. Подставляя полученные величины в формулу, определяют активность используемого препарата — лактоцида /8;93)205-45,8l 1,05+0,0825/10 О - — 4 Предлагаемый способ позволяет повы ить точность опред ления (погрешность его не превышает 5Ъ, а погрешность по известному способу — 12%), ускорить процесс определения с 6 до 4 ч и значительно упростить анализ. Способ определения активности антибиотика лактоцида при спиртовом брожении, предусматривающий культивирование молочнокислых бактерий в присутствии и отсутствии лактоцида и определение в опытной и контрольной пробах степени подавления лактоцидом жизнедеятельности молочнокислых бактерий по количеству продуцируемой бактериями молочной кислоты, титруемой раствором гидроксида в присутствии фенолфталеина с последующим расчетом активности лактоцида, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения точности определения, упрощения и ускорения процесса из молочнокислых бактерий используют Lactobacterium bulgaricum, культивирование их осуществляют на обезжиренном молоке при температуре 38-40 С, а определение количества продуцируемой бактериями молочной кислоты ведут путем титрования всего количества культуральной жидкости опытной и контрольной проб, . содержащих эту кислоту, децинормальньм раствором гидроксида в присутствии фенолфталеина. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Порошина Г.У. Выделение и свойства антибиотика, обладающего высокой антибиотической активностью в отношении молочнокислых бактерий. — "Микробиология", 1964, вып. 6, с. 25-30. 2. Авторское свидетельство СССР по заявке Р 2663426/28-13, кл. G 01 N 33/14, 1978.
