Способ получения производных 21-окси-20-метилпрегнана

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскик

Социалистическик

Реслублик

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту(22) Заявлеио0412,78 (21) 2691554/23-04 ()+

3 (23) Приоритет (32) 19.1277 (33) Р 27571568 (33) ФРГ

С 07 3 5/00 (A 61 К 31/57

Государственный комитет

СССР по делам изобретений н открытий

Опубликовано 0709.81,Бюллетень М 33 (53) УДК 547.689. .6.07 (088. 8) Дата опубликования описания 0709,81

Иностранцы

Апьфред Вебер, Марио Кеннеке и Рудольф М (ФРГ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Шеринг Al" (ФРГ) (73) Заявитель (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ 21-ОКСИ-20-МЕТИЛПРЕГНАНА

И 0Н

Изобретение относится к усовершенствов анному способу получения производных 21-окси-20-метнлпрегнана общей формулы (Х )

ОФ где пунктирная линия означает воэмо,".— ную двойную связь, обладающих фарма-, кологической активностью.

Известен способ получения производных 21-окси-20-метилпрегнана общей формулы(1), заключающийся в том, что ситостерин или h4 -холестен-3-он подвергают ферментации с помощью культуры МусоЬассег!ов spec. NRRL

9-3583 или В-3805 или ее вариантов или мутантов (1) . Выход целевого продукта не превыаает 1%.

Недостатком этого способа является низкий выход целевого продукта.

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта., Поставленная цель достигается опи-, сываемым способом полу ения производ-, ных 21-окси-20-метилпрегнана общей формулы (I), заключающимся в том, что ситостерин нли ь4 -холестен-3-он подвергают ферментации с помощью культуры МусоЬассег!шв врес. NRRL

В-3583 или В-3805 или ее вариантов или мутантов при рН 6-8 в присутствии тетрабората или трифенилбората, или метабората натрия, или метабората кальция в расчете 1-5 r на 1 Л культуры.

Пригодными растворителями для субстрата являются, например, метанол, этанол, гликольмонометиловый эфир, диметилформамид или диметилсульфоксид. Эмульгирование субстрата осуществляют .расплавлением его в микронизированной форме или растворенным в смезжвающемся с водой растворителе (метанол, этанол, ацетон, гликольмонометиловый эфир, диметил= формамид или диметилсульфоксид), предпочтительно в умягченной воде, которая содержит обычные эмульгаторы.

Пригодными эмульгаторами являются неиногениые эмульгаторы, например адцукты этиленоксида или сложные эфиры жирных .кислот с многоатомными спиртами.

Hycobacterfum spec. NRRL В-3805 це. лесообраэно после обработки мутаге862830 нами наносить на кровяные агаровые I пластинки. Таким образом получают отдельные колонки различного морфологического вида. Эти колонии выделяют и испытывают на способность к образованию производных 21-окси-20-метилпрегиана общей формулы(1) .

Среди селекционных штаммов, которые образуют круглые колонии, получают штаммы, которые образуют производныв 21-окси-20-метилпрвгнана с выходом в 1,5-3 раза больше, чем неселекционированные штаммы.

Пример 1. а. В колбу Эрленмейера емкостью 2 л с 500 мл стерильной питательной среды, содержаще@

1% дрожжевого экстракта, 0,45% вто- 15 ричного фосфата натрия, 0,34% первичного фосфата калия, 0,2% ТагатнР 02 и в которой установлено рН 6,7, производят посев путем отмучивания (промывки.декантацией) сухой культу- 20 ры Mycobacte rtця Spec, NRRL В-.3805 и встряхивают в течение 3 дней при ЗОЧ= со скоростью 190,об/мин. б. 22 r ситостерина эмульгируют с 4,4 r Тегина® и 430 мл воры при

95оС с помощью Ul tra-TurraxUY в течение 25 мин и затем доливают до 513 r водой. Стерилизуют эмульсию в течение 20 .мин при 120оС. в. В колбу Эрленмейвра емкостью

500 мл с 65 мл стерильной питательной среды, содержащей 2 r Cornsteep

Iiqu0r, 0,3 r вторичного фосфата аммония, 0,25 r ТагатаР 02. и в которой установлено рН 6,5, производят посев 5 мп выращиваемой культуры Mycobacterium spec °

Затем добавляют 28 мл приготовленной в примере 1б суспензии (соответствует 1,2 r ситостерина) и спустя

24 ч — 4 мп 43-ного водного раствора 40 тетрабората натрия и ферментируют в течение 120 ч при 30 С с встряхиванием.

После ферментации .бульон культуры экстрагируют 2 раза по 100 мл хлорис- 45 тым этиленом. Объединенные этиленхларидные экстракты затем смешивают с 11 г активного угля и фильтруют через складчатый фильтр. Фильтрат концентрируют при 40 С на роторном испарителе и хроматографируют на окиси алюминия. После хроматографирова:ния получают 135 мг 21-окси-20-метил-4-прегнен-3-она с т.пл. 140141 С (из этилацетата) .

Если реакцию проводят при таких же условиях, но бвз добавки раствора тетрабората натрия, то получают

45 мг 21-окси-20-метил-4-првгнен-3-она.

Пример. 2. а. Иэ 22 г 4-холес- go тен-3-она готовят, как описано в примере 1б, 513 г эмульсии. б. В условиях примера 1в выращивают 70 мл культуры Mycobacterlum

spec. NRRL В-3805,смешивают с 28 мл эмульсии 4-холестен-3-она и спустя

24 ч - с 4 мп 4%-ного водного раствора тетрабората натрия и ферментируют в течение 120 ч при 30оС и с встряхиванием.

Обрабатывают смесь после ферментации, как описано в примере 1в, и получают 95 мг 21-окси-20-метил-4-прегнен-З-.она с т.пл. 142-144 С..

Если проводят реакцию в таких же условиях, но без добавки раствора тетрабората натрия, то получают 40мг

21-окси-20-метил-4-qpeгнен-3-она.

Пример 3 ° 28 мп приготовленной согласно примеру 1б эмульсии ситостерина ферментируют, как описано

s примере 1в, с помощью культуры

Mycobacterium spec, NRRL В-3805, причем вместо водного раствора тетрабората натрия используют добавку

6 мл 4Ъ-ной суспензии метабората кальция в воде. После обработки смеси после ферментации, как описано в примере 1в, получают 120 мг 21-окси-20-метил-4-прегнен-3-она с т.пл.141143 С.

П р и м e p 4. 28 мл приготовленной согласно примеру 1б эмульсии ситостерина ферментнруют, как описано в примере 1в, с помощью 70 мп культуры

Mycobacterium spec, NRRL В-3805, причем вместо водного раствора тетрабората натрия добавляют 5 мл 4%-ного раствора трифенилбората.

После обработки смеси после ферментации, как описано в примере 1в, получают 125 мг 21-окси-20-метил-4-прегнен-3-она с т.пл. 142-143оС.

П р и м в р 5. а. В условиях примера 1а выращивают культуру МусоЬасterium spec. NRRL В-3683. б. 65 мп описанной в примере 1в питательной среды смешивают с 5 мл выращенной культуры Mycobacterium

spec,NRRL В-3683. Затем к культуре добавляют 28 мп полученной по примеру 1б эмульсии ситостерина и спустя

24. ч — 4мл 4Ъ-ного раствора тетра- . бората натрия и ферментируют в течение 120 ч. Обрабатывают смесь после ферментации, как описано в примере

1 в, и получают 90 мг 21-окси-20-метил-1,4-прегнадиен-3-она с т.пл,180182 С(из смеси этилацетата с ацетоном) .

Пример 6. 40 мл выращенной культуры МусоЪаcterium spec, NRRL

В-3805, полученной согласно примеру 1а, центрифугируют со скоростью

4000 об/мин, полученную бактериальную массу затеи дважды промывают буферированныи до рН 6 солевым раствором, содержащим 0,5В хлористого натрия, 0,012% сульфата магния (гептагидрата) и 1,363 первичного фосфата калия, суспендируют в 40 мп этого солевого раствора и смешивают с 10 мл

0,5%-ного 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидина.

86 2830

Количество испытанных селекционных штампов

Выход 21-окси-20-метил-4-прегнен-3-она, мг беэ добавки тет- с добавкой рабората натрия тетраббрата натрия

0-200

201-400

401-600

601-800

801-1000

1550-2100

1001-1021

1900-3000

g 1021-1040

10 4 1- 1060 (150) 2900

2900

1061-1080

1081-2000 (19 5) 3450

Формула изобретения

К Ой

Составитель Т.Левашова

Техред С. Мигунова Корректор М. Коста

Редактор Н.Потапова

Заказ 6659/57 Тираж 397 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Инкубируют бактериальную сусиеНэию в течение 1 ч при ЗООC отделяют бактерии центрифугированием, проьывают их дважды вышеуказанным солевым раствором и помещают их на кровяные агаровые пластинки. Из образовавшихся

Способ получения производных 21-окси-20-метилпрегнана общей формулы. (Т) 4р

О где пунктирная линия означает возможную двойную связь, 4 56 путем ферментации ситостерина нли Ьотдельных колоний выбирают те, которые образуют круглые колонии. Из них готовят выращиваемые мультуры. по примеру 1а. Выращенные колонии служат для осуществления ферментацин по примеру 1в. Результаты приведены в таблице.!

-холестен-3-она с помощью культуры

Hycobacter ium spec, NRRL В-3583 или

В-3805 или ее вариантов или мутантоВ, о т л и ч: а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого .продукта, ферментацию проводят при ,рН 6-8 в присутствии тетрабората или трифенилбората, илн метабората натрия, или метабората кальция в расчете 1- 5 r на 1 л культуры.

Источники информации принятые so внимание при экспертизе

1 ° Harshek W.3, Hlcrobia I Degra-.

dation of Stего1s. - Арр1. И1сгоЫо 1о9у. 23, 72 (1972) (прототип) .