Способ количественного определения гаптенов

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскии

Социалистически к

Республик 960627 (6I ) Дополнительное к авт. свнд-ву(22) Заявлено 16,02. 80 (21) 3247668/28-13 (51)М. Кл.

G 01 и 33/48 с присоединением заявки №

3Ъаударстоеииый комитет

СССР (23) Приоритет

Опубликовано 23.09.82. Бюллетень №35

Дата опубликования описания 23.09. 82 ао долом изобретеиий и открытий (53) УДК616-оУ

"(084.8) РГС/) Н)ЗФФ% (72) Авторы изобретения

Институт биологической физики АН СССР (7I) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ГАПТЕНОВ

2 ного раствора содержащего гаптены, а также. использованием дорогостоящего оборудования для регистрации радиоактивности и меченых радиоактивной меткой препаратов. В целом на процедуру определения затрачивается

24-48 ч.

Наиболее близким к предлагаемому является способ количественного определения гаптенов путем торможения

1О гаптеном реакции антигена с антигаптеновым антителом, согласно которому используют конъюгированный на поверхности корпускулярной частицы эритроциты, частицы латекса или полимера антиген 2).

Недостатками известного способа являются длительность процесса (1520 ч), обусловленная низкой скороzo стью оседания эритроцитов после их смешивания с сывороткой, и сложность способа определения, обусловленная необходимостью приготовления конъюгированного антигена на поверхно1

Изобретение относится к иммунологии и может найти применение в медицине.

Известен радиоиммунный способ оп-. ределения гаптенов, согласно которому к,известному количеству антител добавляют известное количество меченого радиоактивной меткой (4С, Н, .1) соответствующего гаптена и неизвестное количество немеченого гаптена. Смесь инкубируют, затем выделяют из реакционной среды фракцию антител, связавших гаптены, и регистрируют радиоактивность зтой выделенной фракции или оставшейся реакционной среды, по которой определяют неизвестное количество гаптена (1).

Недостатками этого способа являются сложность и длительность процесса определения. Сложность обусловлена необходимостью выполнения мер техники безопасности при работе с радиоактивными препаратами, выполнения процедуры разделения антител и маточА.П.Сарвазян, Г.B.Øèëüíèêoâ, О.Ю.Полевая и . Ковалев " 1Я

ТХ11ИЧЯ "" "

3 96062 сти корпускулярной чвстицы и некоторой субъективностью учета реакции из-за индивидуальных особенностей восприятия форма осадка.

Цель изобретения - ускорение и упрощение способа определения концентрации гаптенов.

Цель достигается тем, что при осуществлении способа количественного определения гаптенов путем тормо- to жения гаптеном реакции антигена с антигаптеновым антителом, в качестве антигена используют конъюгирова 1ный свободный антиген белок-гаптен, все операции определения гаптенов 15 проводят в ультразвуковом поле и количество гаптена определяют по изменению скорости ультразвука в реакционной среде.

8се операции проводят в ультразву- ковом поле. К раствору ) -глобулиновой фракции (1- 10 мг/мл белка). гаптеновой антисыворотки в физиологиI ческом растворе, приготовленном на фосфатном буфере рН 7,4, добавляют известное количество гаптена, смесь перемешивают и инкубируют в течение 3 мин при 25 С. Затем к смеси о добавляют раст вор конъюгиро ванного антигена гаптен-белок в концентрации

10 -10 мг/мл. Раствор перемешивают, термостатируют в течение 1,5 мин и определяют скорость ультразвука в ревкционной среде. Через 1-5 мин вновь регистрируют скорость ультразвука и рассчитывают разность этих скоростей. Операции повторяют при использовании разных концентраций гаптена от 10 до 10 моль/л и строят калибровочную кривую зависимости скорости ультразвука от концентрации добавленного гаптена.

Для анализа неизвестной концентрации гаптена проводят все указанные операции, но вместо известной концентрации гаптена вносят в peaKционную смесь анализируемую жидкость и рассчитывают изменение скорости ультразвука. По калибровочной кривой определяют количество гаптена в анализируемой жидкости ° 50

На фиг. 1 изображена калибровочная кривая зависимости изменения скорости ультразвука в реакционной среде Ь0=0 -le> (мм/с) от количества гаптена в области концентраций 5-10 - 55

-5 10 моль/л.

На фиг. 2 изображена калибровочная кривая зависимости скорости уль7 ф тразвука в реакционной среде Ь0=

=05-0 5(мм/с) от количества гвптена в области концентраций 5 -10 -5.10 молЬ/nJ

Пример l. Для,определения концентрации фенобарбитала .(ФБ) в интервале 5 ° 10 -5.10 моль/л в растворе используют антифенобарбиталовую сыворотку, полученную по известному способу, из которой выделяют 1-глобулиновую фракцию, содержащую антитела к фенобарбиталу, с использованием сульфата аммония 40 -ного насыщения по известному способу. В качестве конъюгированного антигена используют конъюгат ФБ-яичный альбумин, полученный реакцией диазониевой соли аминофенобазобитала с яичным альбумином по известному способу, Затем строят калибровочную кривую для определения неизвестной концентрации гаптена в интервале концентрации 5 ° 10- 5.10 моль/л ФБ-яичный альбумин в концентрации 8,0 ° 10 мг/мл, приготовленный в физиологи ческом растворе с фосфатным 0,01 И буферомpH 7,4.

На этомже растворителе готовят растворы гаптена ФБ с концентрациями 5 х10 моль/л; 1 10 моль/л, 4 lбмоль/л;

5 10 моль/л, v(глобулин с концентрацией 1 мг/мл белка. Далее к 100 мкл прогретого 25 С в акусти ческом резонаторе раствора у-глобулина добавляют 10 мкл .7 раствора ФБ с концентрацией 5 t0 моль/л, . перемешивают и инкубируют 3 мин. 3атем к этой смеси добавляют 10 мкл раствора конъюгата ФБ на яичном альбумине, перемешивают и спустя 1,5 мин регистрируют скорость ультразвука

U, а на пятой минуте U, Разность полученных скоростей ь0 заносят в таблицу..Далее перечисленные операции пбвтоярют со всеми приготовленными концентрациями ФБ. Для контроля неспецифического взаимодействия растворитель с -глобулином (обозначается как нулевая концентрация) операции повторяют с .добавлением растворителя. Контролем на специфичность взаимодействия с ФБ служит раствор адреналина с концентрацией 5. 10

Изменение скорости ультразвука при различных концентрациях фенобарбитала Г с использованием фиксированной концентрации конъюгата ФБяичный альбумин при 25 С показано в табл. 1.

960627 6 ными концентрациями ФБ. Для контроля неспецифического взаимодействия растворителя су -глобулином (в таблице обозначается как нулевая концентрация) операции повторяют с добавлением растворителя. Контролем на специфичность взаимодействия у -глобулина с фБ служит раствор адренали6 на с концентрацией 50 -10 моль/л.

30 Изменение скорости ультразвука д0=U -U при различных концентра,$ циях фейобарбатала 1 Г) с использованием фиксированной концентрации конъюгата ФБ- яичный альбумин при 25 С..5

Таблица 1

16,1+0,5 (;6+:g,2

4,9+0,3

2 7+0,2

1,5+О «3

О «5+0 «3

0,2+О, 2

16,4+0,4

5 ° 10

2 10

3 ° 10

4 .10

5 10

Таблиц а 2

-6

Адреналин 10

12,1+0,5

8,4+О 3

6,1+0,4

4,4 0«3

3,5+0,2

3,1i0 3

2;6+0,2

12,3+0,4

5 ° 10

10 -7

2 ° 10 7

3 10

4 ° 10

-6

Адреналин 10 формула изобретения (По данным табл. 1 строят калибровочную за ви си мост ь изменения скорости ультразвука от величины кон- 2$ центрации гаптена (фиг. 1), Неизвестную концентрацию фБ определяют, проводя торможение реакции коньюгированного антигена с антителом изложенным способом и используя калиб- эв ровочную кривую.

Пример 2. Для определения концентрации фенобарбитала в интервале 5 ° 10 5-10 моль/л используют те же вещества, что в примере 1.

Для этого используют раствор коньюгата ФБ-яичньу альбумин в концентрации 8,0 ° 10 мг/мл, приготовленный в физиологическом растворе с фосфатным 0,01 М буфером рН 7,4. На этом же растворителе подготовляют растворы Гаптена ФБ с концентрациями

5 10 ", 10, 2 10, 3 10 . 4 10

5 10 и "-глобулина с концентрацией

1 мг/мп белк.а.

Далее к 100 мкл прогретого до

25 С в акустическом резонаторе раствора "-глобулина добавляют 10 мкл раствора ФБ с концентрацией 5 х

«10 моль/л, перемешивают и инкубируют 3 мин. Затем к этой смеси добавляют 10 мкл раствора конъюгата фБ на яичном альбумине, перемешивают и спустя 1,5 мин регистрируют скорость ультразвука U, а затем на третьей минуте U . Разность по" лученных скоростей gU заносят в таблицу. Далее перечисленные операции повторяют со всеми приготовленПо данным табл. 2 строят калибровочную кривую э а ви си мости изменения скорости ультразвука от величины концентрации гаптена (фиг. 2)., Неизвестную концентрацию гаптена фБ определяют, проводя торможение реакции конъюгированного антигена и антителом изложенным способом и ис- . пользуя калибровочную кривую .

Применение предлагаемого способа по сравнению с известными позволяет ускорить процесс проведения анализа в 60-80 раэ, упростить процесс проведения анализа за счет исключения операций по получению одного иэ реагентов и повысить экономичность процесса за счет сокращения числа реагентов и времени процесса °

М Способ количественного определения гаптенов путем торможения гап0627 8

Источни ки и нфор мацни, принятые во внимание при экспертизе!

1. Фрайфелдер Д. физическая у биохимия. М., "Мир", 1980, с. 257-267.

Фма 1

ВНИИПИ Заказ 7253/50

Тираж 887 Подлисное

Филиал ППП "Патент", г.ужгород,ул.Проектная,4

7 96 теном реакции антигена с антигаптеновым антителом, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, в качестве антигена используют конъюгированный свободный антиген белок-гаптен, все операции определения гаптенов проводят в ультразвуковом поле 2. V.P. Butler, 3he Immuno log i ca i и количество гаптена определяют по assay of Drugs", G. of Pharmaology изменению скорости ультразвука в ре- 1e and Experimental Therapeot ies, чо1, акционной среде. 29, N 2, 1978, р.р. 116-121.