Способ исследования жизнедеятельности @ -клеток

 

СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ li. -КЛЕТОК путем культивирования U -клеток, маркирования их лизосом внеклеточным веществом с последующим электронным микроскопированием , отличающийся тем, что, с целью внедрения внеклеточных .веществ при сохранении жизнеспособности клеток, в качестве внеклеточного вещества используют суспензию твердых частиц магнита с диаметром 8-10 нм, 0,02-0,04 мл суспензии в концентрации частиц/мл добавляют в питательную среду, далее культуру клеток подвергают воздействию ч I неоднородного магнитного поля с индукцией 1,5-3,0 Тл,s

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СООИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) 3(5)) G 01 М 33/48!

) (ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ -- *, Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3381306/28-13 (22) 09.02.82 (46) 15.12.83. Бюл. )) 46 (72) И. Ю. Сабаляускас, .Р. П.. Кузма, В. A. Расюкявичюте, 3. t0. Мешкаускайте, В. Г. Бендикене, A. A. Ясайтис и Ю, Н. Скибин (71) Вильнюсский орденов Трудового

Красного Знамени и Дружбы Народов государственный университет им. В. Капсукаса (53) 616.07(088.8) (56) 1. 3. де Робертис Новинский В., Саэс Ф. Биология клетки. M., Мир, 1967. с. 88.

2, U. G. Hev and F. van Hoof

Lisosomes and Storage Жзеаде. Асбdemie Press » New-dork, 1975, р. 173 (прототип). (54)(57) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ -KHETOK путем культивирования L -клеток, маркирования их лизосом внеклеточным веществом с последующим электронным микроскопированием, отличающийся тем, что, с целью внедрения внеклеточных .веществ при сохранении жизнеспособности клеток, в качестве внеклеточного вещества используют суспензию твердых частиц магнита с диаметром

8.-10 нм, 0,02-0 04 мл суспензии в концентрацйи 10 -10 частиц/мл добав- ляют в питательную среду, далее культуру клеток подвергают воздействию неоднородного магии!гного поля с индукцией 1,5-3,0 Тл. PQ

1061050

Изобретение относится к биологии и может найти применение в цитологии и медицине;

Для исследования внутреннего строения клеток с помощью электронного микроскопа ткани Фиксируют соединениями осмия и заключают в акриловую пластмассу, а затем изготавливают тончайшие срезы, которые накладывают на очень тонкую сетку, помещаемую на пути пучка электронов -(1) . . 10 .Известен способ исследования жизнедеятельности L --клеток путем культивирования L -клеток, маркирования их лиэосом внеклеточным веществом с последующим электронным микроско- 15 пированием (2) .

Однако известный способ не позволя ет внедрять, внеклеточные вещества при сохранении жизнеспособности клеток °

Пель изобретения — внедрение внеклеточных веществ при сохранении жизнеспособности клеток.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу исследования жиз недеятельности L -клеток путем культивирования (. -клеток, маркирования их лиэосом внеклеточным веществом с последующим электронным микроскопиро ванием в качестве внеклеточного веР

30 щества используют суспенэию твердых частиц магнита с диаметром 8-10 HMt

0,02-0 04 мл суспензии в концентрации 10 -10 -частиц/мл добавляют в питательную: среду, далее культуру клеток подвергают воздействию неод- 35 нородного магнитного поля с индукцией 1,5-3,0 Тл.

Способ поясняется следующими примерами.

П р и м .е р 1. Используют клетки линии L полученной в результате трансформации нормальных фибробластов мышей 20-метилхолантреном в культуре.

Пересеваемую кУльтУрУ мышиных 45

L -клеток выращивать при 37 С на покровных стеклах в среде Т-199, дополненной 10% бычьей сыворотки, добавляют 0,3 мл суспенэии твердых частиц высокодисперсного магнитита в воде с концентрацией 10» частиц/мл, полученного химическим осаждением солей

° УеСХ, FeS04 аммиаком.и выдерживают в течение 1,5 мин. После адгеэии кле. ток к субстрату препараты префиксируют в течение 45-50 мин 2,5%-ным раствором глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4, промывают 30 мин 0,1 М фосфатным буфером рН 7,4, постфиксируют в течение 1 ч 1%-ным раствором Os 04 60 в 0,1 М веронал-ацетатном буфере рН 7,2. Обезвоживание осуществляют в серии спиртов возрастающей концент. рации бт 50 до 100%. После выдержи- . вания в смеси абсолютного спирта 65 с ацетоном (1:1) объекты переносят в абсолютный ацетон, а затем - в смесь абсолютного ацетона с аралдитом (1:3), в смесь абсолютного ацетона с аралдитом (3:1). После полимеризации смолы монослой U -клеток отделяют дт стекла в жидком азоте и на ультрамикротоме приготавливают срезы для электронной микроскопии, контрастируют их 33-ным раствором уранилацетата в этиловом спирте и просматривают под электронным микроскопом ЭВМ-100 Л.

Твердые ферромагнитные частицы, содержащиеся в высокодисперсной магнитбчувствительнбй жидкости, являются однодоменными со средним магнитным моментом m = --3,4 10 Гс сА и электроннооптически плотными. Совокупность этих свойств позволяет ускорить их в магнитном поле и наблюдать места их сосредоточения в живой материи.

Электронная микрофотография показывает, что после взаимодействия твердых частиц, находящихся в магниточувствительной жидкости с монослоем L-клеток магнититы находятся только на наружной поверхности клеточных мембран и внутриклеточно не обнаруживавтся.

Пример 2. Монослой L -клеток с ферромагнитными частицами, полученный согласно примера 1 до пре- фиксации, помещают в магнитное поле с .индукцией 1,5 Тл и выдерживают б с, после чего фиксацию и все последующие операции проводят соглас-. но описанию примера 2. Воздействие неоднородного магнитного поля (тип магнита ФЛ-1) на монослой (-клеток с ферромагнитными частицами позволяет внедрить их в отдельные клеточные структуры и "прострелить" в некоторых участках клеточный объем насквозь,. при этом жизнеспособность клетки сохраняется.Аналогичные результаты получены с количеством 0,02-0,04 мл суспенэии, а 10"» частиц/мл и при воздействии полем с инщукцией 2,0 Тл и 3,0 Тл.

При объеме ниже 0,02 мл и концентрации ниже 10 частиц/мл способ не осуществим из-эа недостатка количества ферромагнитных частиц. Повышение. объема и концентрации выше 0,04 мл и 10 частиц/мп делают способ неосуществимым из-эа йеренасыщения клеток ферромагнитными частицами, что.: исключает возможность наблюдать структуры клеток под электронным

t микроскопом.

При снижении индукции ниже 1,5 Тл способ не осуществим иэ-за отсутствия внедрения клеток внутриклеточно, а выше 3,0 Тл приводит к излишнему ускорению ферромагнитных частиц, иээа чего наблюдается разрушение кле1061050

Составитель Н. Хрусталева

Редактор Л. Авраменко Техред М.Тепер

Корректор М. Иароши

Заказ 10032/47 Тираж 873

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035р Москва, Ж-35 Раушская наб., д. 4/5

° ЮЮ

Филиал ППП, "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Подписное точной мембраны и потери жизнеспособности клеток, вследствие многочислен.. ных "прострелов".

Предлагаемый способ впервые разрешает вводить непосредственно внутриклеточно твердые частицы - магнититы с помощью простого и легкоосущест. вимого обьекта - магнитного поля.

В качестве внеклеточных веществ в предлагаемом способе используются . 30 твердые ферромагнитные частицы магниточувствительной жидкости, поэтому применение предлагаемого способа . в исследовании жизнедеятельности ь -клеток может сократить расходы, снизить токсичность маркеров. Кроме того, предлагаемый способ целесообразно использовать для создания высокоэффективных способов непосредственного воздействия на клеточные структуры биологически активными, например, лекарственными веществами путем их "привязывания" к ферромагнитным частицам, поскольку сохраняется жизнеспособность клеток.