Способ кинетического измерения концентрации ферментного субстрата

 

СПОСОБ КИНЕТИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕРМЕНТНОГО СУБСТРАТА с помощью сопряженных реакitfrii , отличающийся тем, что, с цепью ускорения анализа, основную н сопряженные реакции проводят одновременно, при этом субстраты или ферменты сопряженных реакций берут в избытке. О) С

СОЮЗ СООЕТСНИХ

0 Э М Ф Ю Ю МВ

РЕСПУБЛИК амбр 6 .01 и 33/48

ГОСЮДАРСтаЕННЫй НОМИТЕТ CCC|

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (21) 2432255/28-13 (22) 24.12.76 (31) P 2558536.8 . (32) -24.12.75 (33) ФРГ (46} 15.11.83. Бюл. Ф 42 (72)Иоахим Цигенхорн, Аугуст Виль" . хельм Валефельд, Александер Хаген, Вольфганг Грубер и Ханс Ульрих

Вергмейер (ФРГ} (71) Берингер Ианнхайм ГМБХ (ФРГ) (53) 543.8{088.8) (56} 1. methods of enzymatic wa lysis ed Н.U.Bergnleyer, 1974, v. 1, рр. 131-134.

2. Патент ФРГ У 244001 l, кл. 6 01 И 33/16, l975.

„SU „„1055346 А (54)(57} СПОСОБ КИНКТНЧкСКОГО ОПРКДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ФКРИКНТНОГО

СУБСТРАТА с помощью сопряженных реак; ций, отличающийся тем, что, с целью ускорения анализа, ос. новную н сопряженные реакция про" водят одновременно, при этом субстраты или ферменты сопряженных реакций берут в избытке.

К

25 ьС

М 1055

Изобретение относится к аналити"

:ческой биохимии, а именно к способам определения концентрации субстратов ферментов, и может быть использовано в биохимии и медицине для определения субстратов.

Известен способ кинетического определения концентрации ферментного субстрата, включающий добавление к образцу соответствующего фермента, 10 проведение реакции, измерение концентрации образующегося продукта в определенный интервал времени и расчет концентрации определяемого субстрата. При этом существенно, чтобы реакция в выбранном интервале времени протекала по первому или псевдо.первому порядку. В этом случае изме-. ренное значение изменения концентрации субстрата в выбранном промежутке времени прямо пропорционально искомой начальной концентрации определяемо- . го субстрата (Ij .

Однако данный способ применим в основном для одностадийных реакций.

Известен способ кинетического. определеиия ферментного субстрата с помощью сопряженных реакций, включающий проведение основной реакции до .полного превращения определяемого субстрата в продукт и определение полученного продукта с помощью вспо-, могательной реакции кинетическим способом j2) .

Однако известный способ длителен, так как вспомогательная реакция прово-З5 дится только после окончания основной реакции.

Целью изобретения является ускоре-. ние определения концентрации фермент40 ного субстрата.

Поставленная цель достигается тем, что нрн осуществлении способа кинетического определения концентрации ферментного субстрата, c: помощью сопря-. женных реакций основную и сопряженные

45 реакции проводят одновременно, причем субстраты или ферменты сопряженных реакций берут s избытке.

Способ осуществляют следующим об- разом, 50

346 2 ферменты или субстраты вспомогательных реакций добавляют в избытке. В этом случае основная реакция .лимитирует скорость всего процесса в целом.

Под основной реакцией цепи реакций понимают ту частичную реакцию, которая обладает самой большой специфич" костью в отношении исходного вещества, и, кроме того, благодаря соответствующему выбору параметров реакции может стать реакцией, определяющей скорость всего процесса в целом. Необходимо также, чтобы основная реакция протекала по первому или .псевдопервому порядку. Далее определяют изменение концентрации субстра- та в определенный промежуток времени.

Тогда, используя соотношение с Ьс

О 1 1., - yt где Со " исходная концентрация апре" деляемого субстрата;

- константа скорости основной реакции;

" изменение концентрации определяемого субстрата в интервале времени (t2-с4),и поддерживая величины К, й1 и

t постоянными, определяют концентрацию ферментного субстрата.

Пример. Определение глюкозы s в крови.Исследуемую пробу помещают в реакционную среду, содержащую 80-120мИ фосфатного буфера (рН 7,0); 0,8 ед/мл или более нероксидазы (КФ I. 11.1.7);

12 ед/мл более глюкоэооксидазы (Кф I.I.3.4)," 0,6-1,8 мИ 4-аминоантипирина и 3,0-13,5 мИ фенола. Определение осуществляется согласно следующим реакциям: at. -D-глюкоза P -Dглюкозо»

-глюкоза р -0-глюкоза+Н О+Π— + 02 2 оксидаза

-глюкозакислота+Н20 Н О +фенол+4пероксидаза краситель+2Н О.

В реакционную смесь, содержащую определяемый субстрат, добавляют од" новременно ферменты основной и вспомогательной реакций, а также все не- 55 обходимые субстраты вспомогательных реакций. Для определения концентраций субстрата кинетическим способом

Первая реакция является основной, а вторая и третья сопряжены с ней. Реакции проводят одновременно на центробежном анализаторе, осуществляя первое снятие показаний прибора примерно через 35 сек после смещения реактива с испытуемой про1 бой, а второе - на 1,5"1,3 мин поздо

Редактор М.Дылын Техред М.Гергель Корректор ОеБилак.Заказ 9147/61 Тираж 873 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1)3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ШТП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 1 нее. Фермент пероксидаза добавляется в настолько увеличенной дозе, что протекающая по псевдопервому порядку основная реакция лимитирует скорость всего процесса в целом. Концентрацию глюкозы определяют путем спектрального изменения концентрации хиноидного красителя. Весь анализ занимает 4-5 мин.

Определение триглнцеридов.

Триглицериды расщепляют фермента" тивно на глицерин и жирные кислоты, Глицерин определяют согласно следующим реакциям: глицерокиназа глицерин+АТФ глицерин"3"фосфат +АДФ пируваткинаэа

АЦФ+фоофоеиолпируват —-«АТФ+пируват

+ лактатдегидрогеназа пируват+НАЦН+Н вЂ” лактат+НАД+, Способ осуществляют кинетически с помощью следующих реактивов.

Реактив 1: 45-55 мИ фосфатного . буфера (рН 7,0); 4,6-3,1 мИ сульфата магния; 300-.400 мИ додецилсульфата натрия„ 2,3-3,5 мИ АТФ; 280-420ьй

055346 4 фосфоенолпнрувата; 120-230 мИ НАД;

7,7 10 ед/л нли более линазы;

5,8 10 едал или более эстераэы;

9,6 10 " ед/л или более пируватклиозы (КФ 2.7.1.40); 5,3 10 ед/л или более лактатдегидрогеназы (КФ 1..1.1.27).

Реактив 2: 2,9 10 У ед/л или бо" лее глицерокиназы (КФ 2.7.1.30), О концентрации глицерина судят, измеряя образование ИАДН на центро0 бежном анализаторе при 340 нм и 25 С.

За счет повышения концентрации ВТФ и добавления ферментов вспомогатЕльных реакций основная реакция определяет скорость всего процесса в целом.

Для,осуществления способа смешивают 10 мкл исследуемой пробы сыворотки с 30-50 мкл физиологического раствора хлористого натрия и 500600 |кл реактива 1 и инкубируют в те-, чение 10 мин. Затем добавляют реактив 2 и через 50 сек снимают первое, а спустя 150-200 сек второе показание прибора.

Предложенный способ позволяет значительно ускорить проведение анализа (в 3-10 раэ по сравнению с известным).