Способ определения активности полинуклеотидкиназы

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

3(5П 6 0 1 Н 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ;:

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОНИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И (ЛНРЫТИЙ (21) 3432731/28-13 (22) 27.04.82 (46) 30.11.83. Бюл. М 44 (72) И.О.Петрусева, В.И.Ямковой и Н.Н.Филатова (71) Новосибирский государственный университет им, Ленинского комсомола (53) 616.07(088.8) (56) 1 ° NickoCs В.P., DlndeC4 F.D., StefCwagen E DonneCson T.Å. А rapid purification of t4 poC1nucCeot1йе kinase using btuedextran sephrose

chromatography.. — "Biochem.Biophys.

Acta", 1978, 526, р.410-417.

2. Richardson С.С. Potynucfeotide

kinase from ЕввЬег1сЫо coCi infected, with bacteriophage t4. — Proc.NucC.

Ас.Res,1972, 2, р.815-828.

„„SU„„1057867 A

\ (54) (.57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПОЛИНУКЛЕОТИДКИНАЗЫ, включающий взаимодействие дефосфорилированного олигонуклеотида с аденозин-5 трифосфатом в .присутствии испытуемой пробы-с последующим измерением количества образующегося 5 -Фосфорилированного олигонуклеотида, о т л и— ч а ю щ и й.с я тем, что, с..целью обеспечения, ускорения и упрощения способа, аденозин-5 -трифосфат подвергают взаимодействию с 5-6-звенным олигонуклеотидом, полученный фосфорилированный олигонуклеотид выделяют хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе, уравновешенной буферным раствором хлористого натрия при рН 7,5+0,1, содержащим мочевину, а количество продукта реакции измеряют спектрофотометрически.

1057867

Изобретение относится к энзимологии и может быть использовано для определения активности полинуклеотидкинаэы.

Известен способ определения активности полинуклеотидкиназы, заключающийся в измерении количества адсбрбиронанного на стеклянном фильтре радиоактивного кислотонерастноримого продукта, образующегося путем взаимодействия -32 P МАТФ с фраг- 10 ментированной ДНК тимуса теленка (со средней длиной цепи 150 нуклеотитов) в присутствии полинуклеотидкиназы 1 .3.

Недостатком этого метода явля- )5 ется высокий уровень фоновой радиоактивности, обусловленный неспецифической сорбцией на фильтрах избытка (-- 2Р МАТФ.

Наиболее. близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения активности полинуклеотидкиназы, заключающийся в измерении количества адсорбированного на стеклянном фильтре радиоактивного кислотонерастворимого продукта, образующегося путем взаимодействия н при сутствии полинуклеотидкиназы

33 РЗАТФ с ДНК молока лосося, выполняющей роль акцептора ортофосфата. При этом с целью уменьшения неспецифической сорбции (- >2P)ATQ> на стеклянных фильтрах образовавшийся в киназной реакции радиоактивный продукт подвергают последовательно 35 кислотному осаждению-центрифугирона-. нию, переосаждению (BHoBb кислотой), фильтрованию и отмывке кислотонерастворимого радиоактивного продукта от избытка у†- 2Р 7 АТФ на стеклянных 40 фильтрах (2 ).

Этот способ определения активности полинуклеотидкиназы достаточно надежен, но имеет существенный недоста. ток — он многостадиен и потому тру- 45 доемок. Кроме того, способ осуществляется на основе использования радиоактивного препарата j g- 32Р ) АТФ, усложняющего обеспечение безопасности работы н процессе его выполнения.

Цель изобретения — обеспечение безопасности, ускорение и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности полинуклеотидкиназы, включающему взаимодействие дефосфорилированного олигонуклеотида с аденоэин-5 -трифосфатом в присутствии испытуемой пробы с последующим измерением количества образующегося 5 — 60

I фосфорилированного алигонуклеотида, аденозин-5 -трифосфат подвергают

I взаимодействию с 5-б-звенным олигонуклеотидом, полученный фосфорили. — . рованный олигонуклеотид выделяют б5 хроматографией на диэтиламинозтилцеллюлозе, уравновешенной буферным раствором хлористого натрия при

РН 7,5+0,1, содержащим мочевину, а количество. продукта- реакции измеряют спектрофбтометрически.

Способ осуществляют следующим образом.

К раствору динатриевой соли аденозин-5 -трифосфата в буфере трисНСМ (РН 8,0+0,1), содержащем ионы Мф+ добавляют раствор олигонуклеотида с длиной цепи в 5-6 нуклеотидов. К этой смеси добавляют аликвоту из раствора, в котором необходимо измерить активность фермента . Реакцию ведут при 37 С в течение 10-15 мин о и останавливают кипячением 3-5 мин.

При разделении продукта реакции применяют хроматографическую микроколонну с ДЭАЭ-целлюлозой, которая представляет собой капилляр со следующими характеристиками:h=40<5 мм, d = 1+0,2 мм, Ураннонешинание колонки и градиентную злюцию с заданной скоростью пронодят с помощью микрошприца МШ-2,а детекцию с помощью микроспектрофотометра МСФП-1. По площади пиков на хроматограмме определяют количество образовавшегося н процессе киназной реакции фосфорилированного олигонуклеотида и используют его как меру активности. фермента. За 1 ед. активности полинуклеотидкиназы принято считать такое его количество, которое за 30 мин дает 1 нмоль фосфорилированного продукта.

Пример. Активность фермента измеряют при 37 С. Измерение производят в следующем порядке.

В коническую пробйрку вносят

10 1 мкл 51 мкм раствора динатриевой соли аденоэин-5 -трифосфата (опт.

t плотность б+1 опт. ед. ) н 50+1 мМ буфере трис-НСР, РН 8,0+0,1, содержащем 30+1 мМ MqCEg. Туда же добавляют 1051 мкл 6,3+О,2 мкм раствора гексарибоаденилата (Ар)6.А. Затем вносят аликвоту 5 мкл, отобранную из раствора, в котором необходимо измерить активность фермента. Реакционную смесь тщательно перемешивают. Пробирку с реакционной смесью помещают в водяной термостат с

t = 37 С на 10-15 мин. Реакцию остананливают выдерживанием пробирки с реакционной смесью 3-5 мин при

100 С н кипящей водяной бане. Для анализа реакционной смеси хроматографическую микроколонку с 30-40 мкл

ДЭАЭ-целлюлозы уравновешивают

0,00-0,04 М НаСР н 0,01-0,005 М трис-НС9, РН 7,5+O,l, содержащим

7i0,5 M мочевину пропусканием через колонку 712 объемов этого раствора.

На уравновешенную колонку наносят пробу иэ реакционной смеси объемом

410>5 мкл проводят хроматографию в

1057867

Составитель A.ßêîâëåâ

Редактор М.Ткач Техред Ж. Кастелевич Корректор.О.Билак

Заказ 9577/47 Тираж 873 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. ужгород, ул. Проектная, 4 градиенте БаСФ 0,00г0,04-0,26:0,30 М в буферном растворе того же состава что н раньше (при уравновешивании), Суммарный объем элюата 400 .20 мкл, скорбсть элюции 1.5+5 мкл/мин. 3а ходом хроматографии следят с помощью микроспектрофотометра, измеряющего оптическую плотность при 260 нм. On" ределяют по площади пиков на хроматограмме количество образовавшегося в процессе киназной реакции фосфорилированного гексарибоаденилата (pA)6, и это количество используют как меру активности фермента.

Активность препарата измеряется в единицах Ричардсона, наиболее широко употребительных для данного фермента (1 ед. активности фермента это:такое его количество, которое за 30 мин дает 1 нмоль фосфорилированного продукта).

Прн измерении активности препарата предлагаемым способом оказалось„ что 1 мкл препарата полинуклеотидкиназы способен катализировать образование 33 нмоль 5 -фосфорилированного гексарнбонуклеотида за

30 мин °

Таким образом, использование предлагаемого изобретения позволяет значительно упростить процесс определения активности полинуклеотидкиназы, так как исключается необходимость работы с радиоактивными препаратами. Способ позволяет снизить время определения активности фермента примерно в 3 раза.