Способ диагностики вирусного гепатита

 

СПОаЭБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНО ГО ГЕПАТИТДпутем исследования сенсибилизированных лимфоцитов, о т л ич a ю-щ и и-с я т&л, что, с целью ускоЕ ения и снижения травматичности способа, кровь для исследования берут из пальца, ставят реакцию тбрможения миграции лейкоцитов с фетальной сывороткой, псжешают пробу в капил,дяры, центрифугируют и по изменению расстояния миграции лeйкoцитов по сравнению с контролем диагносцируют вирусный гепатит. (Л с | со

аа (и) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

gag . A 61 В 10/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,, . Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3340466/28-13 (22) 14.09.81 (46) 23.12.83. Бюл. М 47 (72) Т.В. Чередниченко (71) Ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт педиатрии

AMH СССР (53) Ь616 ° 07 (088.8) (56) 1. Методические рекомендации к обнаружению австралийского (SH-НВ) антигена с помощю реакции преципитации в агаровом геле. Сборник науя ных работ Института вирусологки им. Д.И. Ивановского ANH СССР. М., 1972.

2. Ворожбиева Т.Е., Будницкая П.3

Любашевская E.Е.. Ананьев В.А. Использование метода иммуноауторадко- графин для индикации австралийского SH-антигена. — Сборник трудов Австралийский (SH-HB) антиген при вирусном гепатите . М., 1973, 48-52 °

3. Глан П.В., Алексеева Л.П.

Микрометод РБТ малых лимфоцитов и его применение в клинике. - В кн.:

Иммунологкческке аспекты трансплантации. М,, 1971, 57-62 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТй путем исследования сенси.билизированных лиыЬоцитов, о т л ич а ю.ц к и с я тем, что, с целью ускорения к снижения травматнчности способа, кровь для исследования берут иэ пальца, ставят реакцию торможения миграции лейкоцитов с фетальной сывороткой, помещают пробу в .капилляры, центрифугируют и по изме- . нению расстояния миграции лейкоци-. тов по сравнению с контролем диагносцируют вирусный гепатит.

1061799

Изобретение относится к медици не, в частности к диагностике вирусного геггатита.

Известен способ диагностики вирусного гепатита путем выявления вирусных антигенов в сыворотке кро-. ви с помощью реакции преципитации в геле, который заключается в том, что в агаре, приготовленном на буферном растворе, делают лунки центральную и периферические. В централь-!О ную лунку помещают специфическую антисыворотку к HBSAg, а в периферические лунки вносят исследуемые сыворотки больных и стандартны1с антиген. После заполнения лунок плас- 15 тинки с гелем инкубируют во влажной камере при комнатной температуре в течение 7 дн. Результаты учитываются по мере появления линий преципитации в первые три дня, оДнако более слабые линии могут быть вы даны только по завершении семидневной инкубации (lj .

Недостатками этого метода являются длительное время инкубации, а также обязательное наличие высокоспецифической тест-системы.

Известен также иммуноауторадиографический метод диагностики вирусного гепатита, который заключается в выявлении невидимого преципитата, образованного 5Н-антигеном и кроличьими антителами с помощью меченой (5 или б ", ) радиоактивной антисыворотки к кроличьему -глобулину.

Основные этапы иммунорадиографии ° 35 (HP) состоят в следующем. На предметное стекло наливают агар Дифко на буфере Prince. В остывшем агаре делают центральные и периферические лунки. В центральные лунки вносят 4Q сыворотку, содержащую антитела к 5H— антигену„ а в периферические лунки. закапывают сыворотки больных-и различные разведения 5Н-антигена из тест-системы. Затем стекла инкубируют45 во влажной камере 48-72 ч и отмывают в течение суток. После отмывания агаровые пластинки, снятые со стекол, погружают на 1 ч в радиоактивные. антитела и оставляют на ночь во влажной камере. После отмывания в течение суток пластинки вновь переносят на стекла, фиксируют и высушивают.

На высушенный агар накладывают флуорографическую пленку, заворачивают в темную бумагу и хранят в темной комнате 1 — 7 сут. Невидимый радиоактивный преципитат дает изображение на пленке (2) ;

Недостатками этого способа явля- 60 ются черезвычайно долгая продолжительность реакции 10 — 14 сут, ее многозтапность, а также необходимость применения специального оборудования и помещения для работы и хранения радиоактивных меченных сывороток.

Наиболее близким к изобретению является способ диагностики вирусного гепатита путем выявления сенсибилиэированных лимфоцитов с помощью реакции бласттрансформации лимфоцитов периферической крови (3), Недостатками известного метода являются большое количество крови (8 мл), необходимое для реакции и забираемое из вены, большая продолжительность (4 сут) и многоэтапность методики необходимость использования дефицитных реактивов, а также проведение работы только высококвалифицированным врачом-лаборантом.

Целью изобретения является ускорение и снижение травматичности способа.

Поставленная цель достигается . тем, что согласно способу диагностики вирусного гепатита путем исследования сенсибилиэированных лимфоцитов, кровь для исследсеания берут из пальца, ставят реакцию торможения.миграции лейкоцитов с фетальной сывороткой, помещают пробу в капилляры,. центрифугируют и по изменению расСтояния миграции лейкоцитов, по сравнению с контролем диагносцируют вирусный гепатит, Способ осуществляют следующим образом.

У пациента берут кровь иэ пальца, ставят реакцию торможения миграции лейкоцитов с фетальной сывороткой на двух предметных стеклах, опытном и контрольном. В контрольную пробу вносят 0,04 мл среды 199, в опытную пробу вносят 0,02 мл среды 199 и

0,02 мм поверхностного антигена гепатита В (HBeAg) с конечным титром

1:4. Смесь и контрольной и опытной проб набирают раздельно в пятиканальные капилляры, нижний конец .капилляра заливают цементом фосфат и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин.

Затем запаивают открытые концы капилляров и инкубируют в течение 1824 ч при 18 — 22 С. Расстояние миграции определяют под микроскопом, учи-, тывая пять значений по числу каналов капилляра. Вычисляют индекс миграции путем деления средней величины миграции в опыте на среднюю величину миграции в контроле. По величине индекса миграции диагностируют вирусный гепатит.

Проведено исследование на 30 больных. Установлено, что индекс миграции соответствующий вирусному гепатиту равен 0,8-. 0,2.

Способ поясняется следующими примерами.

П. р н и е р. Больной.Б-н Евгений, 8 лет, .принят в состоянии средней тяжести на пятый день болезни, на

10б1799

4 шестой день .болезни была взята кровь на реакцию торможения миграции лейкоцитов с митогеном HBSAg . Для .этого из пальца берут 0,2 мл крови в силн« конированную пробирку с гепарином.

Гепарин добавляют в пробирку из расчета 2 ед. на 0,1 мл.крови. Из взя.той крови отбирают по 0,06 мл на каждое из двух предметных стекол: опытное и контрольное. В обе пробы добавляют по 0,015 мл феталной теля- t0 чьей сыворотки. В контрольную пробу вносят также 0,04 мл среды 199. В опытную пробу вносят 0 02 мп среды

199 и 0,02 мл поверхноСтного антигена гепатита B(HBSAg) с конечным . 15 титром 1:4 ° Смесь из контрольной и опытной проб набирают раздельно в пятиканальные капилляры с плоскопараллельными стенками длиной 4,5 см, оставляя незаполненным на 0,5 см верхний конец копилляра. Нижний конец .капилляра запаивают цементом

, фосфат . Для затвердения цемента фосфат капилляры оставляют в возвышенном положении под углом 10

О открйтым концом кверху на 15 мин;

Затем капилляры завертывают в марлю (отдельно контрольный и опытный) и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин.

После центрифугирования открытый . конец капилляра также закрывают цементом фосфат . Капилляры помещают в чашку Петри бывшим -открытым концом вверх под углом 10, накрывают крышкой, выдерживают при 20

22аС от 18 — 24 ч. Учитывают мигра- "35 цию лейкоцитов в опытной и контрольной пробах с помощью микроскопа, используя окуляр,х 7, 5 с делениями и объектив х 8, Среднюю величину миграции вычисляют,из пяти значений 4() соответственно числу каналов капилляра. У данного больного значения миграции иэ канала опытного капилляра следующие: 1,0; 1,0; 0:5; 0,5;

0,5 делений окуляра, среднее значе- 45 ние их равно 0,7. Значения миграции из каналов контрольного капилляра следующие 2 0; 2 0; 2 0 1 5; 1 5 со средним значением 1,8 делений окуляра, Следовательно индекс миграции (ИМ) равен 2 = 0,38 ед. Учитывая, 1,Ь что показатели ИМ 0,8 — 0,2 ед свидетельствуют о торможении миграции лейкоцитов, наличие у данного больного ИМ, равного 0,38 ед, означает резкое торможение миграции лейкоцитов под влиянием HBGAd, свидетелЬствующее о наличии у больного вирусного гепатита.

В связи с симптомами выраженной 60 интоксикации, сохранявшимися в течение двух недель больному проводи.лась дезинтоксикационная терапия, в том числе вливания гемодеза, 10Ъной глюкозы, препаРаты АТФ, кокар-, 65 боксилаэа, усиленная спаэмолитическая и желчегонная терапия.

Обратная динамика болезни отмечалась на 24 день болезни, Значительно улучшилось самочувствие, начала уменьшаться желтуха, исчез- ли петехиальные элементы. Домой выписан в .удовлетворительном состоянии на 42 день болезни по настоянию родителей, При выписке сохранялась легкая иктеричность кожи и склер,печень пальпировалась на 1,5 см, ниже реберной дуги. В биохимическом анализе крови билирубин общий 3 мг Ъ, билирубин свободный 2,25 мг Ъ, билирубйн связанный 0,75 мг Ъ, активность фруктозомонофосфат-альдолазы снизилаеь до 4,ед., а.аланинаминотрансферазы до 18 ед.

Таким образом, у ребенка с типичной клиникой вирусного. гепатита В, протекавшего в среднетяжелой форме, не бйл обнаружен. в крови НВ8Ад, однако на седьмой .день болезни была выявлена специфическая сенсибилизация к HBGAf что позволило точно диагностировать вирусный гепатит в. ранние .сроки заболевания, обеспечить госпитализацию в палатУ по профилю (гепатит B) и назначить более энергичную дезинтоксикационную терапию.

Пример 2. Больной К-в Станислав, 4 лет. В клинику поступил на шестой день болезни и второй день желтухи, в состоянии средней тяжести.

Иктеричность была отчетливо выражена, печень чувствительная,при па1 ь-. пации, выступала на 2 см из подреберья, В биохимическом анализе крови на седьмой день болезни: билирубин. общий 3,24 мг Ъ, билирубин свободный 1,37 мг Ъ, билирубин связанный

1,87 мг Ъ, активность фруктоэомонофосфат-альдолаэы была 10 ед., аланинаминотрансферазы 32 ед., тимоловая проба 30 ед. При повторных определениях доступными методами HBGAg в крови не найден. На седьмой день болезни была проведена реакция торможения миграции лейкоцитов с H85Ag в качестве антигена, Миграция в каналах контрольного капиЛляра составила 5,0; 5,0; 5,0 ° 4,5; 4,0 со средним значением 4,7 делений окуляра. Миграция в опыте равнялась

1,0; 1,0; 1,0; 1,0; 1,0; 1,0 со сред-. ней величиной миграции 1,0 делений окуляра. Следовательно, ИМ оказался равным о 0,21 ед. Этот показатель

4,7

ИМ свидетельствовал о высокой степени сенсибилизации организма больного к поверхностному антигену (HBGAg) гепатита В. Таким образом, у ребенка при отсутствии в крови (раннее исчезновение) HB5Ag была выявлена сенсибилизация к данному антигену, что позволило уточнить вид гепатита

l061799

Составитель Н. Хрусталева

Редактор О, Черниченко Техред Л.Микеш Корректор A Повх Д =k.

Заказ 10093/5 Тираж 713 Подписное

М ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретениЯ и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

<и поставить окончательный диагноз: вирусный гепатит В.. Ребенок был госпитализирован в палату по профилю 1гепатит В). Ребенок был выписан домой в удовлетворительном состоянии

На 29 день заболевания.. При выписке 5 сохранялась субиктеричность склер, печень оставалась еще уплотненной и выступала из подреберья на 0,5 см.

Положительный зффект предлагаемо- 10

ro способа диагностики вирусного гепатита заключается в ускоренйи диагностики вирусного гепатита, в возможности проведения дифференциальной диагностики вирусного гепатита

В и гепатита А и, следовательно, в уменьшении риска перекрестного инфирирования вследствие ранней закладки больных в палаты по профилю (гепатит А и гепатит В) на основе ранней диагностики и дифференциальной диагностики двух видов вирусного гепатита, в связи с чем более раннем назначении адекватной терапии, в-осуществлении этиологической диагностики хронического гепатита в доступности и простоте методики.