АН СССР и Институт вирусологии им.Д.И.Ивановского (72) Г.А.Галегов, Г.Л,Линицкая, Ю.Г.Кройча, Т.JI.Öèëåâè÷, С.Г.Завгородний и В,Л.Флорентьев (53) 547.792.1 (088.8) (56) Sidwell R.W.Huttman J.Н, Khare G.P., L.B.Allen Prospectrum

antiviral activitu of virasol

Science, 177, 705 (1972).

Huttman J.Н. Sidwell. R.W., Khare G.P., Allen L.Â. Robbins R.Ê., Witkowsky J.Т. In vitro effect of

1-P-D-riboйuranosi1-1,2,4-triasole3-carloxamide (virasol ACN 1229)

on the ribanucleic and deaxy-ribonucleic viruses Agents and Chemotherapy. v. 3,235 (1973).

Harris S. Probins R.Ê., Ribarin. А.Broad Spectrum Antiviral

Agent. Ed. R.À.Smith Acad.Ðråss, N J. 1980.

Bauer D.J. Collins P. 9-(2-Hygioxyethoxymethyl) guanine activity ag

against viruses of the hespes group.

Nature, 272,583-585 (1978).

ÄÄSUÄÄ 1124559 А. (д) 4 С 07 D 249/14, А 61 К 31/41

Harmenberg J., Wahren В., Oberg В.

Influence of се11 virus multiplefity

on the ingibition of herpes virus

with acycloguanosine. Intervirology

14, 239 (1980).

Jones R.G., Ainsworth С.1,2,4Triasole-3 alanine J.Amer. Chem.

Soc 77, N 6, 15.38-1540 (1955).

Л.Ю.Тычинская и В.Л.Флорентьев.

Синтез 9-(P oêñè-этоксиметил ) адемина и 1-(1-оксиэтоксиметил ) цитоэина"Биоорганическая химия", 4, Р 11, 1461-1463 (1978). (54) 1 вЂ (2-ОКСИЭТОКСИМЕТИЛ) -1,2,4ТРИАЗОЛ-5-КАРВОКСАМИД, ОБЛАДАЮЩИЙ

АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ВИРУСА ГЕРПЕСА (57) 1-(2-оксиэтоксиметил)-1,2,4триаэол-5-карбоксамид формулы обладающий активностью против вируса герпеса.

124559 г N

Ы ), 0

СН20СНЕСН20Н

ÑÎ0Ñ2Í5

2, СНЗСООСН2СН ОСН2С1

Н ф

NH3 /метанол

М СООС2Н5

СН2ОСН2СН20СОСНЗ г", м соин

СН2ОСН2СН20Н

6 1

Изобретение относится к области органической химии, медицинской химии и вирусологии, конкретно изобретение касается нового соединениявЂ”

1-(2-оксиэтоксиметил)-1,2,4-триазол5-карбоксамида формулы I являющегося новым антивирусным ве" ществом, избирательно подавляющим . репродукцию вируса простого герпеса.

Изобретение может быть использовано в вирусологии для подавления репродукции вируса герпеса, Известен противовирусный препарат рибавирин (виразол, 1,1- /3 -у -рибуфуранозил 1-1,2,4-триазол-З-карбоксамид), который является структурным аналогом гуанозина.

Рибавирин обладает умеренной способностью подавлять репродукцию вируса герпеса. В целом ряде исследоваРеакцией алкчлирования полученного по известной схеме этилового эфира 1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты получают промежуточный этиловый эфир 1-(1-ацетоксиэтоксиметил)-1,2, 4-триазол-5-карбоновой кислоты, обработка которого полунасыщенньм раствором аммиака в метаноле при комнатной температуре приводит к получению целевого продукта, выделяемо"

rn известными способами, Пример 1, Синтез I-(2-окси.этоксиметил)-1,2,4-триазол-5-карбоксамида и его выделение.

К раствору 5,64 г (40 ммоль ) этилового эфира 1,2,4-триазол-3карбоновой кислоты в 160 мл абсолютного диметилформамида добавляют

2 ний предпринимались многократные попытки усилить его противовирусные свойства путем различных химических модификаций, которые, однако, не дали желаемого эффекта.

Известно также, что способностью подавлять репродукцию вируса герпеса обладает 9-(2-оксиэтоксиметил) гуанин (ацикловир).

1О Целью изобретения является расширение ассортимента веществ, обладающих улучшенным спектром противогерпетических свойств.

Поставленная цель достигается

15 свойствами нового соединения формулы

1, обладающего активностью против вируса гермеса„ Данное соединение содержит в качестве гетероцикла азотистое основание рибавирина, а в

20 качестве аналога пентозного остаткаалкильный заместитель ацикловира.

Вещества такого рода на антивирусную активность ранее не исследовались.

25 Способ получения данного соединения основан на известной реакции и осуществляется по следующей схеме

1, 1 6 г (48 ммоль ) гидрида натрия, перемешивают 30 мин при комнатной температуре (до прекращения .выделения пузырьков водорода) и добавляют

45 9,16 г (60 ммоль) Р-ацетоксиэтоксиметилхлорида. Реакционную смесь перемешивают 24 ч при комнатной температуре, упаривают на роторном испарителе, добавляют к остатку 100 мл

50 воды и экстрагируют водный раствор хлороформом. Хлоройормный раствор сушат над На 804, раствор фильтруют и упаривают, К полученному остатку добавляют 200 мл разбавленного вдвое

55 насыщенного при 0 С раствора сухого аммиака в абсолютном метаноле, выдерживают 48 ч при комнатной температуре и упаривают. Выделение и

1124559 очистку препарата осуществляют двумя способами.

Способ А.Остаток растворяют в

50 мл этанола, добавляют 40 см силиз кагеля Л 40/100 мкм (Chemapol,×åхословакия), (взятого по объему) и упаривают досуха. Обработанный таким образом силикагель наносят на колонку (4х15 см ) с силикагелем той же степени дисперсности (суммарный объем силикагеля не более 220 см ).

Элюцию проводят смесью хлороформэтанол (линейный градиент от 0 до

ЗОХ этанола, общий объем 2 л ). Фракции, содержащие соединение I (элюирующая концентрация этанола 10X), упаривают.досуха. Вещество I перекристаллизовывают из этанола выход

3,35 г, 45 %.

Способ Б. Остаток растворяют при нагревании в этаноле, оставляют на ночь при комнатной температуре, осадок отделяют, маточный спиртовый раствор упаривают досуха, остаток перекристаллизовывают из этанола.

Выход вещества 1 3,19 г, 43Х.

Оба способа выделения дают возможность количественного отделения от побочных продуктов.

Физико-химические характеристики о соединения 1: т:пл.111-112 С (6): 205 (8600), 215,5 (8600) (Cary 118, С1ЧА); ПМР-спектр в

Э20 (3, м,д.): Н(3) 8,18 с (1Н), СНр(1 ), 6,01с(2Н),СН (3 ) и СН (4 )

3,75с (4Н) (спектрометр Xl. -100-15, США);

Таблица

Изучение влияния препаратов на морфологию клеток С Va

Цитотоксическое действие (ЦТД) мкг/мл

24 ч 48ч 72ч

96 ч

250

Рибавирин

125

250

Соединение 1 125

Препарат Концентрация

Найдено,7: С 38,61; Н 5,48, Cr. Н„Р„О .

Вычислено,X: С 38,70, Н 5,42.

ТСХ. Q . 0,58 (,система А); 0,66

5 (система Б); .0,57 (система В).

Системы для ТСХ: н.бутанол вЂ” вода уксусная кислота (5:3:2) (А); изопропанол вЂ” аммиак вЂ” вода (8:1:1) (Б); хлороформ вЂ” спирт (7:3)(В).

Пример 2. Определение цитотаксического действия и противовирусной активности 1-(2-оксиэтоксиметил)-1, 2,4-триазол-5-карбоксамида.

Учитывая, что заявляемое вещество содержит в качестве гетероцикла азотистое основание рибавирина, биоло" гическую активность нового вещества изучали.в сравнении с рибавирином (НТСНИ СЩА)

20 Изучение цитотоксического действия проводили на перевиваемой линии клеток CU (клетки почек африканских зеленых мартышек). В качестве среды поддержки использовали питательную среду У .199, содержащую 10Х эмбрио" нальной телячьей сыворотки ("ОхЬсо", Scofland) .

Показано, что соединение f обла. дает значительно меньшим цитотоксическим действием, чем рибавирин. Так, в концентрации 250 мкг/мл он практи" чески не изменяет морфологии клеток в течение 96 ч контакта, в то время как рибавирин в аналогичной концентрации вызывает 50Х токсический эффект.

Данные о влиянии заявленного препарата на морфологию клеток представ тены в табл.l.

Таблица 2

Синтез ДНК в культуре клеток СЧ1 в присутствии препаратов

Время после введения препаратов, ч

Вариант нмоль на Х подав

5xl0 клето ления нмоль на % подав5xl 0 кле- ления .

5 ток !

6,14+0,3

4,7+0,3 х

Контроль

59Х 0,87+0,3 86

Рибавирин

lх10 М(250 мкг/мл)

Соединение

1932хх10 ЗМ (250 мкг/мл) 1,96+0,3

2,40+0,3 44% 3,17+0,3 49

П р и м е ч а н и я: вЂ” контроль-клетки, необработанные препаратом;. контакт с Н-тимидином продолжался 1 ч при 37 С.

Изучение противовирусной активнос- Зб по цитопатическому действию и выти соединения проводили в той же кле- ражали в fg ТГЩ.пр/мл. точной системе, В качестве инфекционного материала использовали вирус. Изучение влияния испытуемого простого repneca 1 типа; штамм F4 ., соединения на развитие инфекционноМножественность инфицирования 0 001 з го процесса в клетках CVj показаИД о на клетку. Препараты вводили ло, что во всех используемых концентв состав среды поддержки непосредст- рациях соединение 1 задерживает развенно после адсорбции вируса, Ин- витие вирусной инфекции. фекционный титр вируса определяли Данные представлены в табл. 3.

Т à.б л и ц а 3

Влияние соединения 1 на развитие цитопатического действия, вызываемого вирусом простого герпеса в клетках СЧ

Цитопатическое действие

Концентрация, мкг/мл

Препарат

Время после заражения, ч

48 72 96

Инфицированные клетки

250

„- Инфици ров анные клетки, обработанные соединением Г

125

S 1l

Эти данные полностью согласуются.с результатами по изучению влияния препарата на синтез клеточной

ДНК. Определение синтеза ДНК прово- дили по включению Н-тнмидина (СССР, 5

Ленинград, уд.активность 22 кюри/

/ммоль) в кислотонерастворимую фракцию.

Введение соединения 1 в концентрации 250 мкг/мл вызывало лишь частич24559

Ь ное угнетение синтеза клеточной ДНК (44 и 49%. ) через 24 и 48 ч инкубации соответственно; в аналогичных условиях рибавирин ингибировал этот процесс на 86% (табл.2); концентрация

125 мкг/мл соединения 1 вызывала недостоверное снижение синтеза клеточной ДНК, не превыйающее

15Х.

1124559 Таблица 4

Влияние препаратов на репродукцию вируса герпеса в культуре клеток С 1

Концентрация, Титр вируса, Подавление титра мкг/ми tpцдм/ вируса, t уцц /

Препарат

Инфицированные клетки

6,0

2,5

3,5

Инфицир ов ан ные клетки, обработанные рибавирином

125

1,5

4,5

4,0

2,0

125

Инфицированные клетки, обработанные соединением 1

3,5

2,5

3,0

2,0

4,0

1,5

4,5

7,5

П р и м е ч а н и е: Множественность инфицирования 0,001 ИДд на клетку.

Соединения вводили в среду поддержки непосредственно после адсорбции вируса.

Т а б л и ц а 5

Изучение. вирулицидного действия соединения I

Исходный вирус

Вирус (4 ч, 37 С) 6,5

Вирус, обработанный соединением 1 (4 ч, 37 С) 125

6 5

Вирус, обработанный соединением 1 (4 ч, 37 С) 62,5

6,5

Изучение влияния соединения I на накопление инфекционного вируса представлено в табл.4. Очевидно, что испытуемое соединение обладает значительно большей антигерпетической

Обработка вируса герпеса соединением 1 в рабочих концентрациях практически не снижает его инфекционнос-. активностью, чем рибавирин; концент. рация 125 мкг/мл снижает титр вируса на 4 Fg ДЦДзв/ „,д и даже концентрация 7,5мкг/млвызывает достоверное подавление инфекционноготитра вируса. ти (табл.5); таким образом, испытуемое соединение не обладает вирулицидным действием.

1124559

Редактор П.Горькова 1ехред M.Иоргентал Корректор М.Демчик

Заказ 3725/! = Тираж 379 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул. Проектная, 4

Таким образом, проведенные испытания показывают, что новое соединение обладает выраженной противо1О вирусной активностью и избирательно подавляет репродукцию вируса простого герпеса.