Способ выявления микроорганизмов-деструкторов неионогенных поверхностно-активных веществ

 

Изобретение относится к микробиологическим методам и может быть использовано для быстрого выявления микроорганизмов, разрушающих неионогенные поверхностно-активные вещества. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в приготовлении агаризованной питательной среды, содержащей минеральные соли и неионогенное поверхностно-активное вещество в качестве единственного источника углерода и энергии, разливании ее в чашки, засеве уколом культурами испытуемых микроорганизмов, выращивании их и последующей обработке культуральной среды 3-5%-ным водным раствором фенола. О наличии активных форм деструкторов судят по зоне просветления вокруг выросших колоний на общем фоне, имеющем молочно-белую окраску.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1507794

А1 (51)4 С 12 1/04 С 12 N 1/20

Г

1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

5,80-6,00

3,00-3,20

0,50-0,55

1, 00-1, 20

15 0-20,00

На, НРО, КН, Ро, Na С1

ИН С1 Агар-агар

Неионогенное поверхностноГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4319436/30-13 (22 ) 22.10.87 (46) 15.09.89. Бюл. Ф 34 (71) Саратовский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института генетики, Саратовский государственный медицинский институт и Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов АН СССР (72) О.В.Турковская, Г.М.Шуб и А.Д.Иосипенко (53) 663. 15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Ф 707963, кл. С 12 N 1/20, 1978.

Cook К.А. А rapid method for the

detection of non-conic surfactant.degroceling microorganisms. -Journ.

Арр1.Bacteriol, 1978. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ НЕИОНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕУ(ЕСТВ

Изобретение относится к микробиологическим методам и может быть ис пользовано для быстрого выявления микроорганизмов, разрушающих неионогенные поверхностно-активные вещества.

Цель изобретения — упрощение способа.

Способ заключается в следующем.

Готовят питательную среду следующего состава, г/л воды:

2 (57) Изобретение относится к микробио логическим методам и может быть использовано для быстрого выявления микроорганизмов, разрушающих неионогенные поверхностно-активные вещества. Цель изобретения . — упрощение способа..Способ заключается в приготовлении агаризованной питательной среды, содержащей минеральные соли и неионогенное поверхностно-активное вещество в качестве единственного источника углерода и энергии, разливании ее в чашки, засеве уколом культурами испытуемых микроорганизмов, выращивании их и последующей обработке культуральной среды 3-5Х-ным водным раствором фенола. О наличии активных форм деструкторов судят по зоне просветления вокруг выросших колоний на общем фоне, молочно-белую окраску. активное вевещество 0,20-0,50 последовательным растворением в йоде всех компонентов, рН среды 7,2-7,4.

Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм и температуре 105110 С в течение 20-30 мин.

Приготовленную среду разливают в чашки Петри .по 10-15 мл и засевают пробами сточных вод, активного ила или почвы таким образом, чтобы получить изолированные колонии или бляшками в случае чистой культуры. На одну чашку можно посеять 20-50 культур микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов проводят при 28-30 С в течение 1-5 сут.

В результате обработки поверхность агаризованной среды окрашивается в

55 молочно-белый цвет со светлыми прозрачными зонами вокруг колоний микроорганизмов, разрушающих алкилфенолэтоксилат (ОП-10).

3 150779

Чашки с выросшими колониями микроорганизмов заливают 5-10 мл 3-57-ного раствора фенола и выдерживают 5-10 мин, после чего избыток фенола удаля- 5 ют, чашки промывают дистиллированной водой и подсушивают, Вокруг колоний бактерий, способных к деструкции неионогенных поверхностно-активных веществ, образуются про,зрачные зоны, в то время как остальная поверхность среды имеет молочно-белое окрашивание.

Интервал концентраций раствора фенола (3-5 ), используемого в качест-15 ве индикаторного, выбран исходя из следующих предпосылок: концентрация ниже 37 удлиняет процесс и дает менее четкие зоны просветления, а при концентрации выше 57 фенол в воде не 20 растворяется.

В качестве контроля берут микроорганизмы, не разрушающие неионогенные поверхностно-активные вещества, и высевают их на чашки бляшками рядом с 25 исследуемыми культурами. После обработки фенолом прозрачных зон деструкции контрольные штаммы не дают.

Для подтверждения деструктивной активности выявленных микроорганизмов 30 может быть использован количественный метод, Для этого, культуру-деструктор, выявленную описанным способом, засевают в колбы с 100 мл стерильной син- 35 тетической жидкой среды следующего состава, г/л среды:

Na, НРО 6,0

КН PO 3,0

NaC1 0,5 40

NH

PH среды 7,2-7,4.

Неионогенное поверхностно-активное вещество вносят в концентрации 0,2 г/л.

После инкубирования на качалке в

1 течение 1-5 дней из колбы отбирают

1-2 мл пробы в делительную воронку емкостью 100 мл, доводят объем раствора дистиллированной водой до 50 мл 10 подкисляют 1 мл соляной кислоты и экстрагируют неионогенное поверхностно-активное вещество 3 мл хлороформа (встряхивают в течение 1 мин). Хлороформную фракцию сливают в чистую делительную воронку емкостью 25 мл и проводят повторное экстрагирование

2 мл хлороформа в течение 1 мин. Хло4 4 роформный экстракт сливают в ту же воронку. Затем в нее добавляют 3 капли НС1, три капли 107.-ной фосфорномолибденовой кислоты, 0,3 мл 107.-ного раствора роданистого аммония и 3 капли 10 -ного раствора хлористого олова. Смесь встряхивают в течение 1 мин, отстаивают и окрашенный хлороформный слой сливают в градуированную пробирку через слой ваты, смоченной хлороформом. Затем вату промывают хлороформом, доводят объем пробы до 6 мл, полученный раствор переносят в кювету и измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при синем светофильтре. Результат определения находят по заранее построенной калибровочной кривой.

Во всех экспериментах наблюдают снижение количества неионогенного поверхностно-активного вещества, Таким образом, выявленные фенольным способом микроорганизмы действительно являются деструкторами неионогенных поверхностно-активных веществ.

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава, г/л воды:

2 НРО4 6,0

КН РО 3,0

NaC1 0,5

NH4C1 1,0

Агар-агар 15

Алкилфенолэтоксилат (ОП-10) 0,2 последовательным растворением всех компонентов в воде.

Питательную среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм и температу- ре 105 С в течение 30 мин и разливают в чашки Петри по 15 мл.

Питательную среду в чашках засевают пробами сточных вод.

Засеянные чашки инкубируют при

30 С в течение 3 сут. Затем их залива; ° ют 10 MlI З .-ного водного раствора фенола.

Через 10 мин избыток фенола сливают, чашки промывают дистиллированной водой.

1О

5 15077

Пример 2, Готовят питательную среду следующего состава, г/л воды:

Na HPO, 6,0

КН РО 3,0

NaC1 0,5

NH C1 1,0

Агар-агар 15

Стеарилэтоксилат (стеарокс-6) 0,2 последовательным растворением всех . компонентов в воде.

Далее, способ осуществляют по методике, описанной в примере 1, заливая чашки с выросшими колониями микроорганизмов 10 мл 5 -ного водного раствора фенола.

В результате обработки поверхность агаризованной среды окрашивается в 20 молочно-белый цвет со светлыми прозрачными зонами вокруг колоний микроорганизмов, разрушающих стеарокс-6.

Пример 3. Готовят питательную среду следующего состава, г/л воды:

Na HPO, 6,0

КН2 РО+ 3;0

NaC1 0,5

ИН,С1 1,0

Агар-агар 15

Алкогольэтоксилат (синтанол ДС-10) 0,2 последовательным растворением всех компонентов в воде.

Далее способ осуществляют по методике, описанной в примере 1, зали1 вая чашки с выросшими колониями микроорганизмов 10 мл 4Х-ного водного. раствора фенола.

В.результате обработки поверхность

40 агаризованной среды окрашивается в молочно-белый цвет со светлыми прозрачными зонами вокруг колоний микроорганизмов, разрушающих синтанол

ДС-10.

Пример 4. Готовят питательную среду следующего состава, г/л воды: . Na, HPO - 6,0

КН,РО 3,0

NaC1 .0,5

ИН„С1 1,0

Хгар-агар 15

Синтанол ДС-10 0-,2 . последовательным растворением всех компонентов в воде.

Далее способ осуществляют по методике, описанной в примере 1, зали94 6 вая чашки с выросшими колониями микроорганизмов 10 мл 2 .-ного водного раствора феноЛа.

Поверхность агаризованной среды окрашивается в молочно-белый цвет лишь через 30 мин и прозрачные светлые зоны вокруг колоний микроорганизмов, разрушающих поверхностноактивное вещество, не имеют четких очертаний, что затрудняет выявление деструкторов поверхностно-активиых веществ.

Предлагаемый способ выявления микроорганизмов, разрушающих неионогенные поверхностно-активные вещества, позволяет выделять штаммы бактерий, обладающих деструктивной активностью по отношению к этим соединениям, являющимся основой производства многих синтетических моющих средств и синтетических патексов, и вследствие этого создать микробиологическую базу для охраны окружающей среды от их сброса.

С помощью предлагаемого способа можно значительно сократить время, необходимое для выявления микроорганизмов., разрушающих неионогенные поверхностно-активные вещества. .Кроме того, применение предлагаемого способа позволяет существенно расширить спектр его приложения, так как обнаружена способность 3-5 -ного водного раствора фенола давать молочно-белое окрашивание неионогенных поверхностно-активных веществ различных типов: стеарокс-6, ОЖК-моноалканоэтоксилаты; ОП-4, ОП-7, ОП-10, тритон Х-100, тритон Х-305 — алкилфенолэтоксилаты; твины 40,60,80 — полиэтиленгликолевые эфиры сложных эфиров жирных кислот и многоатомных спиртов;

Brij 35, синтанол ДС-10, Brij 58 алкогольэтоксилаты. формула изобретения

Способ выявления микроорганизмовдеструкторов неионогенных поверхностно-активных веществ, предусматривающий приготовление агаризованной питательной среды, содержащей калий фосфорнокислый однозамещенный, аммоний хлористый, другие дополнительные минеральные соли и неионогенное поверхностно-активное вещество, засев ее культурами испутыемых микроорганизмов, их выращивание, последующий анализ путем обработки культуральной среды

1507794 ношении солей в питательной среде, г/л среды:

Натрий фосфорнокислый двузамещенный индикаторным раствором и установлением активных форм штаммов-деструкторов по зоне просветления вокруг вы" росших колоний, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве индикаторного раствора используют 3-57.-ный водный раствор фенола, а в качестве дополннтельных минеральных солей используют10 натрий форсфорнокислый дв замещенный и натрий хлористый при следующем соот5,8-6,0

Калий фосфорнокислый однозамещенный

3,0-3,2

0,50-0,55

1, 0-1,2

Натрий хлористый

Аммоний хлористый

Составитель Л. Минеева

Техред М.Моргентал Корректор О.Ципле.

Тираж 501 Подписное

Редактор М. Петрова

Заказ 5516/29

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðoä, ул. Гагарина, 101