Питательная среда для культивирования высших базидиальных грибов-продуцентов комплекса ферментов, осуществляющих деструкцию лигноцеллюлозного сырья
Использование: биотехнологические процессы гидролиза растительного сырья, очистка фенолсодержащих стоков промышленных предприятий и количественное определение фенолов в аналитических целях. Сущность изобретения: комплекс ферментов получают путем культивирования высших базидиальных грибов на питательной среде следующего состава, г/л: NH/jH2P04 1,3-1,9; КНаР04 0,3-0,4, К2НР04 0,2-0,3; MgS04 0,3-0,6; 30-50 об. %- ный водный раствор коричневого безбелкового сока люцерны - остальное. Использование 30-50 об.%-ного водного раствора безбелкового коричневого сока, полученного после измельчения и отжима зеленой массы люцерны, в качестве органического источника углерода и водной основы обеспечивает снижение себестоимости целевого продукта 2 табл. сл С
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК ((9) (! !) (5!)5 С 12 N 1/14, С 12 R 1;645) /14, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ V
,4) .Ql (л) (л
jQQ (21) 4820751/13 (22) 28.04.90 (46} 23.05.92. Бюл. N. 19 (71) Институт ботаники им. Н,Г. Хододного (72) Н.И.Даниляк, M.M.Êîãàíîâ, С.B.Ðåøåòников, И,А.Трутнева и В,Ф.Карзов (53) 577,15(088.8) (56) Авторское свиде.ельство СССР
¹ 1218673, кл. С 12 N 1/16, 1985.
Авторское свидетельство СССР
¹ 11332255007711,, кK)л), С 12 N 1/14, 1985, (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВЫСШИХ БАЗИДИАЛЬНЫХ
ГРИБО — ПРОДУЦЕНТОВ КОМПЛЕКСА
ФЕРМЕНТОВ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ ДЕСТРУКЦИЮ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО
СЫРЬЯ
Изобретение относится к процессам биотехнологии получения окислительных и гидролитических ферментных систем высших базидиальных грибов и может быть использовано в производстве ферментов, применяемых в пищевой, медицинской, деревообрабаты ва ю щей, целл юлозо-бумажной отраслях промышленности, а также в сельском хозяйстве.
Известны способы получения комплекса гликозидаз и оксидаэ, предусматривающие выращивание в качестве продуцентов культур высших базидиомицетов на питательной среде, содержащей воду, минеральные соли и источники углерода с последующим отделен ием кул ьтуральной (57) Использование: биотехнологические процессы гидролиза растительного сырья, очистка фенолсодержащих стоков промышленных предприятий и количественное определение фенолов в аналитических целях.
Сущность изобретения: комплекс ферментов получают путем культивирования высших базидиальных грибов на питательной среде следующего состава, г/л: NH4H2P04 1,3-1,9; КН2Р04 0,3-0,4;
К2НРО4 0,2-0,3; MgSO4 0,3-0,6; 30-50 об,,4ный водный раствор коричневого безбелкового сока люцерны — остальное.
Использование 30-50 об.7;-ного водного раствора безбелкового коричневого сока, полученного после измельчения и отжима зеленой массы люцерны, в качестве органического источника углерода и водной основы обеспечивает снижение себестоимости целевого продукта, 2 табл. жидкости от мицелия и остатков твердого субстрата.
В качестве источников углерода используют отходы фильтровальной бумаги, гидрол, экстракт из свекловичного жома. отходы производства капролактама;
Описаны технологические приемы использования растительных экстрактов в качестве интенсификаторов процессов бис)синтеза ряда физиологически активных соединений бактериальной культурой из рода Brevibacterium. Положительный эффект достигается при использовании соков травяных смесей клевера, люцерны и сахарной свеклы в качестве компонентов питательных сред при выращивании таких бактериальных культур как Lactobacterium
1735358 р!амагнв, Propionobacterium schermanii u
Streptococcus lactis. Растительные экстракты способствуют накоплению биомассы сахаромицетов Trichosporon cutaneum u
kansenula anomala, а также являются благоприятным субстратом для выращивания культур плесневых грибов. Растительные экстракты обеспечивают условия развития продуцентов амилаз бактериального и грибного (дейтеромицеты) происхождения, являясь полноценным заменителем кукурузного экстракта, Широко описаны и внедрены в международную практику технологические процессы производства протеиновых концентратов из зеленой массы с последующим использованием продуктов фракционирования в различных направлениях кормоп роизводства. Технологическая сущность таких процессов фракционирования зеленой массы растений сводится к тому, что зеленую массу в стадии максимального содержания протеина после двухстадийного измельчения пропускают через механические или шнековые прессы для отделения сока. Выжимки (или иначе травяной жом) направляют на сушильные агрегаты с последующим производством травяной муки или на силосование. Сок, полученный в результате прессования, нагревают для выделения протеинового концентрата в теплообменниках или инжекцией паром, Скоагулированную при этом белковую фракцию отделяют на центрифугах, декантаторах или фильтрах-прессах. Полученную таким образом протеиновую пасту высушивают в конвекционных или распылительных сушилках. Безбелковая фракция сока (т,н. безбелковый коричневый сок) является отходом производства протеинового концентрата и может быть. использована для полива полей в качестве удобрения или (после упаривания) в виде добавки к травяной муке, В настоящее время разрабатываются способы более эффективного использования коричневого сока. Так, аммонийные соли органических кислот, образующиеся в результате обработки коричневого сока аммиаком, предлагается использовать в качестве заменителя сырого протеина, Известны также способы использования ферментированного коричневого сока в качестве консерванта зерна, соломы, силоса и других сельскохозяйственных продуктов. Сохранность этих продуктов обеспечивается на уровне действия традиционных консервантов — пропионовой и муравьиной кислот, Приводятся результаты производственных испытаний использования коричневого сока в качестве добавки к силосу из соломы, что приводит к повышению кормовой ценности силоса в 2-3 раза. При этом указывается, что в силосе значительно повышается
5 содержание растворимой и легкогидролизуемой фракции целлюлозы и гемицеллюлозы за счет химической трансформации соломы.
Однако перечисленные способы применения коричневого сока не позволяют созда10 вать безотходное производство биотехнологической переработки растительного сырья, а также эффективно использовать биохимические свойства и структур н ые особе н ности коричневого сока, 15 Наиболее близким по технической сущности к достигаемому эффекту является биотехнологический процесс выращивания базидиальных грибов с целью получения комплексного ферментного препарата лиг20 ноцеллюлозного действия, причем в качестве источника углерода в жидкой питательной среде используют лиофилизированный белковый сок зеленой массы растений (2), 25 Сущность изобретения-прототипа заключается в том, что питательная среда, содержащая минеральные соли и воду, содержит в качестве источника углерода ли30 офилизированный белковый сок зеленой массы люцерны в количестве 1-2 мас, /,, Несмотря на то, что реализация биологического процесса по упомянутому изобретению позволяет повысить активность монофенол35 монооксигеназ при достаточно высокой активности целлюлаз, она все же сопряжена с большими затратами, поскольку себестоимость зеленого белкового сока составляет
9,69 руб/т, В свою очередь, себестоимость
40 безбелкового коричневого сока в 12,92 дешевле и составляет 0,75 руб/т.
Целью изобретения является снижение себестоимости целевого продукта, для чего в качестве источника углерода и биологиче45 ски активных соединений используют т.н. коричневый сок, содержащий минеральные вещества и аминокислоты, получаемый в качестве отхода при производстве протеиновых концентратов из зеленой массы
50 растений люцерны методом термической коагуляции.
Состав коричневого сока, получаемого при производстве протеинового концентрата из люцерны, дан в табл, 1, 55 Применение коричневого сока по новому назначению позволяет сохранить уровни активности оксигеназ и целлюлаз, как и в случае использования лиофилизированного белкового сока зеленой массы люцерны, 60 при значительном снижении себестоимости ферментных препаратов, а также разреша1735358
0,3-0,4
55 ет вопрос о создании безотходного биотехнологического процесса утилизации вторичных растительных ресурсов при переработке люцерны, Для осуществления поставленной цели по культивированию высших базидиальных грибов в глубинных условиях на жидких питательных средах предлагается питательная среда следующего состава, г/л: однозамещенный фосфат аммония 1,3-1,9; однозамещенный фосфат калия 0,3-0,4; двузамещенный фосфат калия 0,2-0,3; сульфат магния 0,3-0,6; коричневый безбелковый сок, разбавленный водой 30-50 об."-,ь.
П ример, Готовят питательную среду следующего состава, г/л: NH4H:>РО4 1,3-1,9; КН2РО4
0,3-0,4; К2НРО4 0,2-0,3; MgS04 0,3-0,6, остальное — коричневый безбелковый сок, разбавленный водой 30-50 об, . Указанную питательную среду готовят путем последовательного растворения всех компонентов при постоянном перемешивании, помещают в колбу Эрленмейера емкостью 0,5 л (по
0,1 л среды в колбу) и стерилизуют острым паром 30 мин при 0,1 МПа. Затем колбы охлаждают до комнатной температуры и засевают одной из чистых культур грибов
Pleurotus ostreatus (Jacq„Fr.) Kumm. 226, Stereum purpureus (Pers,) Fr. 102, Coriolus
hirsutus (Fr.) Quel. 136, Coriolus versicolor (Fr.) Quel. 44.
В табл, 2 приведены результаты измерений показателей ферментативной активности культуральных фильтратов.
Таким образом, приведенные примеры экспериментальной проверки предлагаемого изобретения подтверждают достижение поставленной цели, Культивирование высших базидиальных грибов на среде, содержащей коричневый безбелковый сок люцерны, получаемый при производстве протеиновых концентратов, позволяет получать комплексы внеклеточных ферментов, содер5 жащие активные окислительные и целлюлозолитические ферменты с повышенным выходом монофенол-,монооксигеназы и пероксидазы, создать замкнутый безотходн ый процесс производства и, как показывает
10 расчет экономической эффективности, значительно снизить затраты производства.
Формула изобретения
Питательная среда для культивирования высших базидиальных грибов — проду15 центов комплекса ферментов, осуществля ющих деструкцию л игноцелл юлозного сырья, содержащая органический источник углерода и биологически активных веществ, однозамещенный фосфат аммо20 ния, однозамещенный фосфат калия, двузамещенный фосфат калия, сульфат магния и водную основу, отличающаяся тем, что, с целью снижения себестоимости целевого продукта, в качестве водной основы
25 органического источника углерода и биологически активных веществ она содержит 30 — 50 об, -ный водный раствор коричневого безбелкового сока люцерны при следующем соотношении компонентов, г/л:
30 Однозамещенный фосфат аммония 1,3-1,9
Однозамещенный фосфат калия
Двузамещенный
35 фосфат калия 0,2-0,3
Сульфат магния 0,3-0,6
30-50 об.%-ный водный раствор коричневого безбелкового сока
40 люцерны Остальное.
1735358
Таблица 1
Компоненты
Мин ьн
Аминок исл ты
Сухое вещество
Протеин
NHz-азот, г/л
КН4 азот, г/л
Азот нитратов,мг/л
Сапонины, мг/л
Горчичные масла, мг/л
Восстанавливающие сахара
Калий
Хлориды
Магний
Кальций
Натрий
Фосфор
Цинк
Железо
Марганец
МеАспарагиновая кислота
Треонин
Серин
Глутаминовая кислота
Пролин
Глицин
Аланин
Цистеин
Валин
Метионин
Изолейцин
Лейцин
Тирозин
Фенилаланин
Гистидин
А гинин
Со е жание, на с х ю масс
90,1-92,6
16,7 — 20,0
0,25 — 0,40
0,12 — 0,20
150-300
0,12 — 0,20
2,0-2,4
0,8 — 1,5
7,5 — 8,1
1,1 — 1,3
0,91 — 1,03
0,42 — 0,58
0,13 — О, 186
0,91 — 0,155
0,87 — 0,106
0,081 — 0,098
0,021 — 0,044
0,004 — 0,007
1,8 — 2,1
0,3 — 0,5
0,27 — 0,5
1,3-1,6
0,4 — 0,6
0,4-0,5
0,6-0,7
0,1 — 0,2
0,4-0,5
0,1 — 0,15
0,3-0,4
0,4-0,5
0,2-0,3
0,4-0,5
0,1 — 0,2
0,2-0,3
1735358
Т-а б л и ц а 2
Показатели при концентрации безбелкового коричневого сока, 4
100 50 30,> 10
1!
Единицы, Максимальные
Субстрат
Фермент значения по прототипу
1 leurotus ostreatus (Jacq.:Гт.) Кч>авег, Uwd!F-1300
Бенэидин ед/л 140,0 65 0
То же То же . 126,0 64,0
КМЦ г деполиме- 22,5. 18,0 ризации
14,0
То же
КМЦ-активность
ФБ-активность
17,0
10>3
l5,0
80,0
67,3
121,0
120,0
Еunalia troqii (Rerk ) Bond: et Sing, 0146
Бензидин
То же
82,1 66,3
80,2 71,2
48,9 41,2
75,3
83,2
82,6 ед/л
То же
72,3
46,! г деполимериэации
КМЦ
50,3 мг.г глюке- 36,2 зы
23,4
37,6
38>9 22,1
То we
КМЦ-активность
Е,г З,г
6,2
7,6
Фильтроваль" То we ная буиага
ФБ-активность
5,1
Coriolus hirsutus (Fr.) Пцег,, 069
Бенэидин ед/л 14,9
16,2
13 9
15,1 10,3
Нонофенолмонооксигеназа
17.2
16,1
17,8
То же То же 18 3
18 ° 4 г3,г
9,2
12,3
Пероксидаза
Эндо-1,4- -глюканаза
2 деполи- 21,1 меризации
20,9
КНЦ
14,0 мг.ь глюко- 12,3 зы
То we
КНЦ-активность
11,2
13,2
10,1
16,2
ФБ-активность
20,9 10,6
20,1
14,2
Бензидин ед/л 14,6
13,1
10,2
13,9
Нонофенолмонооксигеназа
То we
18,!
17,8
21,6
16,2
21,9
То we
15,3
19,3
13,2
Пероксидэза
Эндо" 1,4-)3-глюканаза 4 депогимеризации
20,1
КМЦ
10,7 мг.б глюко- 9,3
4,6
3,1
10,1
9,2
6,2
То же
KMU-активность
ФБ-активность
9,9
3,2
4 5
Фильтроваль- То же ная бумага
Coriolus versocolor (Fr.) Бенэидин ед/л 16,1 18,2 10,2 15,3 15>9 Нонофенолмонооксигенаэа 18,6 12,6 То же 18,2 17.2 11,9 То же Пероксидаза Эндо-1,4-!з-глюканаза 9 3 6,3 19>1 г деполи- 11,1 мериээцич 13 1 КНЦ мг.г глюко- 19,4 зы 10,7 22,3 20,1 То we КМЦ-активность 10,1 14,3 Фильтроваль- То же ная бумага ФБ-активность 20,5 20,0 19,0 20,3 Гошев fomentarius (Fr.) Kickx., О!17 10,6 21,3 20,5 22,1 19>г Бензидин ед/л Нонофенолмонооксигеназа 14,3 33,6 30,1 Та же 31>7 22,0 То же Пероксидэза Эндо-1,4-(3-глюканаза леполиме- 0 ризации КМЦ 8,4 мг.г глюка- 7,6 эы 7,3 5,2 7,0 То we КМЦ-активность Фильтроваль- То we 2,6 ная бумага 3,2 3> 1,2 3,0 ФБ-активность П р и м е ч а н и е. В качестве контроля взяты средние значения активности ферментов по прототипу, т,е, при наличии в питательной среде для культивирования высших базндиальных грибов наряду с минеральными солями 1-22 лиофилизированного сока лоцерны или 10-20 г/л воды, как ето оговорено в формуле нэ изобретение прототипа. Монофеноп-монцоксигенаэа Пероксидаза Эндо-1,4-()-глюканаза Монофенол-монооксигеназа Пероксидеза Энде-1,4-I)-глюканаза иг.г глоко- 22,5 зы Фильтроааль- То we 99,0 ная бумага 79,0 81,5 48,5 Фильтроваль- То we 19,3 ная бунага Stereum purpureum (Pars,) Гт., 030 125,0 118,0 25,0 44,0 48,0 22,0 гг,3 33,г 10,3
