Способ получения оксикобаламина

Настоящее изобретение относится к органической химии и касается способа получения оксикобаламина - катализатора для каталитической терапии злокачественных новообразований - путем электрохимического восстановления Со³⁺ цианокобаламина до Co²⁺ цианокобаламина в мембранном электролизере на титановом катоде в гальваностатическом режиме при плотности тока 5,0-15,0 А/дм² в водном растворе соляной кислоты и температуре 28-40°С с последующим окислением последнего кислородом воздуха с образованием оксикобаламина и выделением готового продукта осаждением из водно-ацетоновой смеси при охлаждении. Способ обеспечивает выход целевого продукта по веществу 80,0-90,0%. 2 табл.

 

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно - к катализаторам для темновой (каталитической) терапии злокачественных новообразований и ряда других патологических состояний.

В последнее десятилетие ведется большая исследовательская работа по созданию каталитических бинарных и многокомпонентных систем препаратов с терапевтическим противоопухолевым эффектом, одним из компонентов которых является «оксикобаламин-лио» (Сыркин А.Б., Жукова О.С., Кикотъ Б.С. и др. // Рос. хим. ж. 1998. Т.42. Вып.5. С.140). Последний представляет собой сухую инъекционную форму оксикобаламина (витамина B_12a, химическое название Co^α-(5,6-диметилбензимидазолил)-Со^β-гидроксикобамид гидрохлорид,

С₆₂Н₈₉СоN₁₃О₁₅Р∙НСl, М=1382.8) - производного витамина B₁₂, цианокобаламина (α-(5,6-диметилбензимидазолил)цианокобамида).

Медико-биологические исследования in vitro и in vivo показали, что бинарная каталитическая система «оксикобаламин-лио - аскорбиновая кислота» имеет широкий спектр противоопухолевого действия и обладает выраженным синергизмом с известными противоопухолевыми препаратами (Патент РФ 2.114.623).

Существовавшее ранее в России опытно-промышленное производство оксикобаламина (акционерное общество «Синтез», Курган) осуществлялось по технологии, представляющей собой фотолиз цианокобаламина в присутствии кислорода воздуха ультрафиолетовым светом в спектральном диапазоне от 274 до 354 нм с последующей хроматографической очисткой образовавшегося оксикобаламина и CN (цианокобаламин) выделением готового продукта кристаллизацией из водно-ацетонового раствора. В настоящее время промышленное производство оксикобаламина в стране отсутствует, вследствие чего для продолжения дальнейших исследований и клинических испытаний возникла острая необходимость в выпуске отечественного оксикобаламина. Однако организация производства по приведенной выше технологии требует больших капитальных вложений.

В литературе, главным образом патентной, приводится ряд способов получения оксикобаламина из цианокобаламина, заключающихся в основном в восстановлении Со³⁺ цианокобаламина до Со²⁺ с отрывом CN-группы и обратном окислении Со²⁺ до Со³⁺ с одновременным образованием оксикобаламина.

Используются следующие методы восстановления:

1) Фотохимические (Европейский патент 533115 (1993), Патент Франции 2309564 (1976), Патент Венгрии 9715 (1975), Патент Испании 373802 (1973));

2) Каталитические методы: применяются, например Na₂(PdCl₄) Bieganowsky R., Klar G. Chemiker-Zeitung, 106(5), 235 (1982)) или Pd под давлением (Патент Венгрии 153741 (1967));

3) Химические, где в качестве восстанавливающих реагентов применены метабисульфиты щелочных металлов (Патент Китая 1323746 (2001), Патент Франции 2480755 (1981), двухлористое железо (Патент Голландии 6607040 (1966)), цинк (Патент Великобритании 1084847 (1967), боргидрид натрия (Патент Германии 2261551 (1973)), азотнокислое серебро в щелочной среде (Патент Франции 2128923 (1972)).

Химические методы восстановления витамина В₁₂ в оксикобаламин имеют следующие недостатки:

- при применении солей двухвалентного железа или метабисульфита щелочных металлов - нестабильность этих реагентов при хранении, необходимость постоянного контроля за их качеством, в случае метабисульфита еще и необходимость превращения промежуточного сульфитокобаламина в оксикобаламин с использованием дополнительных, неудобных в работе реагентов, например иода;

- при применении железного порошка - медленное и неполное протекание реакции с одновременным значительным разрушением продукта реакции;

при реакции с азотнокислым серебром - необходимость постоянного соблюдения в процессе реакции величины рН в очень узком интервале (равной 10) и регенерации израсходованного серебра.

Недостатком каталитических методов является необходимость использования дорогостоящих металлов или их солей, недостатком фотохимических методов является, в частности, их трудоемкость.

Наиболее близким к настоящему изобретению является электрохимический метод получения оксикобаламина восстановлением цианокобаламина (Kenyberez Th.M., Mark H.B. Analytical Letters, 7(1), 1-8 (1974) (прототип). Восстановление последнего с концентрацией 10^-3 М проводят на ртутном катоде при контролируемом потенциале, составляющем - 1,2 В (н.к.э.), в азотнокислом растворе при комнатной температуре. Для обеспечения полноты реакции восстановления цианокобаламина используют соли серебра, связывающие CN^- - анионы, что смещает процесс в сторону образования целевого продукта. Недостатками указанного способа получения оксикобаламина являются: потенциостатический режим восстановления исключает его промышленную реализацию, использование токсичного ртутного катода и дорогостоящих солей серебра и низкая концентрация (1,35 г/л) исходного цианокобаламина. Кроме того, выход оксикобаламина по веществу не приводится.

Задачей настоящего изобретения является разработка технологичного способа получения оксикобаламина, отвечающего по качественным показателям требованиям к фармацевтическим препаратам (ВФС 42-660-99).

Для осуществления заявляемого способа электрохимическое восстановление цианокобаламина проводят в мембранном электролизере на титановом катоде в кислом водном растворе при перемешивании. Электровосстановление проводят в гальваностатическом режиме при плотности тока 5,0-15 А/дм² и температуре 28-40°С, а выделение оксикобаламина из реакционного раствора проводят осаждением из водно-ацетоновой смеси при охлаждении. Образующуюся в процессе восстановления синильную кислоту удаляют барботажем азотом с последующей ее нейтрализацией известным способом.

Выбор катодного материала определялся наибольшей эффективностью процесса восстановления и коррозионной стойкостью в условиях электролиза. Этим требованиям в большей степени удовлетворяет титан ВТ1-0.

При температуре ниже 28°С уменьшение выхода оксикобаламина по веществу до 60,0%, вероятно, обусловлено снижением растворимости исходного цианокобаламина, а также трудностями отдувки образующейся синильной кислоты, что исключает возможность полной конверсии цианокобаламина из-за обратимости реакции.

Повышение температуры выше 40°С также приводит к существенному снижению выхода целевого продукта до 63,5%, очевидно, из-за его термической неустойчивости. Кроме того, полученный гидрохлорид оксикобаламина не соответствует по качественным показателям требованиям к фармацевтическим препаратам.

Повышение плотности тока выше 15,0 А/дм² осложняет поддержание температурного режима процесса восстановления и может приводить к более глубокому восстановлению Со⁺³, а при плотностях тока ниже 5,0 А/дм наблюдается уменьшение выхода оксикобаламина по веществу до 60,0%, вероятно, из-за низкого потенциала, реализуемого в этих условиях на титаном катоде и недостаточного для восстановления Со⁺³ в Со⁺².

Таким образом, предложен метод получения оксикобаламина, заключающийся в электрохимическом восстановлении Co³⁺ цианокобаламина с концентрацией 22,0 г/л до Со²⁺ в водном растворе соляной кислоты на титановом катоде, последующем окислении Со²⁺ до Со³⁺ с одновременным образованием оксикобаламина и выделении целевого продукта осаждением из водно-ацетоновой смеси при охлаждении, с выходом 80,0-90,0%.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

В электролизер с разделенным катодным и анодным пространствами катионообменной мембраной МК-40 загружают: в катодное пространство - 90 мл 0,1 н водного раствора соляной кислоты и 2,0 г цианокобаламина (витамин В₁₂, производство - Китай); в анодное - 20 мл 10%-ного раствора серной кислоты. В качестве катодного материала используют титан ВТ1-0, а анодного - платинированный титан.

Католит нагревают при перемешивании магнитной мешалкой до температуры 28°С, пропускают ток плотностью 5,0 А/дм² и подают азот в католит для отдувки (барботажа) синильной кислоты. Последняя поглощается раствором гидроксида натрия, а образующийся цианид натрия обезвреживается известными методами.

Окончание реакции определяют по отсутствию на ТСХ (пластина «Silufol», элюент: смесь этанол - вода или ацетон - вода, 1:1) в пробе реакционной массы пятна, соответствующего по R_f исходному цианокобаламину, раствор которого также наносится на пластину в качестве свидетеля. Продолжительность процесса электровосстановления цианокобаламина составляет 5,0 часов. После электролиза кислый раствор оксикобаламина с рН 1,4 подвергают окислению при комнатной температуре, барботируя сжатый воздух в течение 30-35 мин, затем фильтруют на воронке Бюхнера и выделяют целевой продукт из раствора разбавлением холодным ацетоном при перемешивании, после чего помещают на сутки в холодильник. Выпавший осадок гидрохлорида оксикобаламина отфильтровывают, промывают на фильтре ацетоном, отжимают и высушивают на фильтре. Получают 1,68 г (82,3%) препарата, λ_max которого составляет 274, 351 и 525 нм, а отношение оптических плотностей D_274±2/D_351±2 и D_525±3/D_351±2 - 0,83 и 0,35 соответственно, что отвечает по качественным показателям требованиям к фармацевтическим препаратам. Ацетон из фильтратов регенерируют (до 90%) отгонкой при атмосферном давлении и вновь используют при очистке и выделении оксикобаламина.

Пример 2

Процесс восстановления и выделение образующегося гидрохлорида оксикобаламина проводят аналогично примеру 1, но при плотности тока 15,0 А/дм² и температуре 40°С. Продолжительность процесса электровосстановления составляет 1,5 часа. При этом получают 1,8 г (88,2%) препарата с λ_mах 274, 351 и 526 нм и отношением оптических плотностей D_274±2/D_351±2 и D_525±3/D_351±2 - 0,83 и 0,34, соответственно, что отвечает требованиям к фармацевтическим препаратам.

Пример 3

Процесс проводят аналогично примеру 2, но при плотности тока 10,0 А/дм² и температуре 30°С, продолжительность процесса электровосстановления составляет 2,85 часа. При этом получают 1,82 г (89,2%) препарата с λ_mах 273, 351 и 526 нм и отношением оптических плотностей D_274±2/D_351±2 и D_525±3/D_351±2 - 0,83 и 0,34, соответственно, что отвечает требованиям к фармацевтическим препаратам.

Пример 4

Процесс проводят аналогично примеру 2, но при плотности тока 10,0 А/дм и температуре 50°С продолжительность процесса электровосстановления составляет 2,8 часа. При этом получают 1,3 г (63,7%) препарата с λ_mах 276, 351 и 527 нм и отношением оптических плотностей D_274±2/D_351±2 и D_525±3/D_351±2 - 0,89 и 0,34, соответственно, что не отвечает требованиям к фармацевтическим препаратам.

Оценка биоэквивалентности оксикобаламина, полученного по предлагаемой технологии

В биологических системах in vitro и in vivo оценены: специфическая цитотоксическая активность (in vitro), противоопухолевая эффективность (in vivo) и токсичность (in vivo) оксикобаламина, полученного по предлагаемой технологии, в сравнении с официнальным оксикобаломином (ФСП 42-660-99) в составе бинарной каталитической системы (БКС) «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» (Ок + Ак).

1. Цитотоксическая активность in vitro.

Исследования проводили на культуре опухолевых клеток человека Нер-2 (карцинома гортаноглотки человека). В качестве растворителя использовали 0,9% раствор натрия хлорида. Концентрация исходных растворов оксикобаламина 1 mM, АК - 300 mМ. Через 24 часа инкубации клеток с препаратами оценивали число жизнеспособных клеток колориметрическим методом, используя МТТ-тест.

Уровень ингибирования роста культуры вычисляли по формуле:

ИР (%)=[(П_к-П_о)/П_к]×100%,

где ИР - ингибирование роста культуры, в процентах;

П_о и П_к - число жизнеспособных клеток, выраженное в единицах оптической плотности, соответственно, в опытных (с препаратами) и контрольных (без препаратов) пробах.

Биологически значимым эффектом считали ингибирование роста культуры на 50% (ИК₅₀).

Результаты исследования: БКС «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» на основе субстанции полученного Ок и фармакопейной субстанции характеризуются одинаковой цитотоксической активностью in vitro (ИК₅₀, мкМ, равен 15,9±0,8 и 16,3±1,1, соответственно).

2. Противоопухолевая эффективность in vivo.

Исследования проводили на мышах с опухолью Эрлиха (АОЭ). Оксикобаламин и аскорбиновую кислоту вводили однократно внутрибрюшинно в дозах, равных 100 мг/кг и 382 мг/кг, соответственно.

Противоопухолевый эффект оценивали по средней продолжительности жизни (СПЖ) и увеличению продолжительности жизни (УПЖ) мышей, получавших химиотерапевтическое лечение, вычисленных по формуле:

УПЖ(%)=[(СПЖ_опыт-СПЖ_{контроль})/СПЖ_{контроль}]×100%,

где СПЖ_опыт - СПЖ мышей в опытных группах, а СПЖ_{контроль} - в контрольной группе.

Значимым биологическим эффектом считали УПЖ на 25% и торможение роста опухоли на 50%.

Как видно из данных табл.1, БКС «Ок + Ак» на основе субстанции полученного Ок и фармакопейной субстанции у мышей с АОЭ характеризуются одинаковой противоопухолевой активностью. Так, УПЖ мышей, получавших лечение БКС «Ок + Ак» на основе полученного Ок, составило величину, равную 62%, а на основе фармакопейного Ок - 74%.

Таблица 1 Противоопухолевая эффективность БКС «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота» у животных с асцитной опухолью Эрлиха (АОЭ)
№		Дозы Ок/Ак (мг/кг)	Молярное соотношение Ок/Ак	СПЖ (сутки)	УПЖ (%)
гр.	Воздействие
Оксикобаламин, полученный по предлагаемой технологии
1	Ок	100/0	-	18,00±1,00	-3
2	Ак	0/382	-	19,00±0,52	2
3	Ок + Ак	100/382	1:30	30.25±1,25	62
Оксикобаламин фармакопейный (ФСП 42-660-99)
4	Ок	100/0	-	19,25±2,35	3
5	Ак	0/382	-	19,53±1,41	6
6	Ок + Ак	100/382	1:30	32,40±2,33	74
7	0,9% раствор	Nad	-	18.60±0,44	-

3. Оценка токсических свойств.

Оценена «острая» токсичность на мышах полученного оксикобаламина как индивидуально, так и в составе бинарной каталитической системы в сравнении с фармакопейным оксикобаламином (ФСП 42-660-99) при однократном и многократном (ежедневно в течение 5 дней) внутривенном введении. Растворы субстанции готовили ex tempore в изотоническом (0,9%) растворе хлористого натрия и вводили внутривенно в дозах, равных 175 мг/кг и 100 мг/кг. Аскорбиновую кислоту вводили внутрибрюшинно в дозах, соответствующих молярному соотношению Ок: Ак, равному 1:10. Критерий оценки - гибель животных от токсичности, которая не должна превышать 10%.

Таблица 2 «Острая» токсичность субстанции оксикобаламина, полученного по предлагаемой технологии фармакопейного оксикобаламина индивидуально и в составе БКС «Оксикобаламин + Аскорбиновая кислота»
Доза оксикобаламина, мг/кг, режим введения	Доза Ак, мг/кг	Гибель, %	Внешние признаки интоксикации
Оксикобаламин, полученный по предлагаемой технологии
100; ежедневно в течение 5 дней	-	0	Без особенностей
100; ежедневно в течение 5 дней	127 ежедневно в течение 5 дней	0	Гиподинамия, заторможенность
175; однократно	-	0	Без особенностей
175; однократно	222; однократно	0	Гиподинамия, заторможенность
Оксикобаламин фармакопейный (ФСП 42-660-99)
100; ежедневно в течение 5 дней	-	0	Без особенностей
100; ежедневно в течение 5 дней	127 ежедневно в течение 5 дней	0	Гиподинамия, заторможенность
175; однократно	-	0	Без особенностей
175; однократно	222; однократно	0	Гиподинамия, заторможенность

Как видно из данных табл.2, однократное и многократное внутривенное введение введение БКС на основе оксикобаламина, как полученного по предлагаемой технологии, так и фармакопейной субстанции, в исследованных дозах - 175 мг/кг (по Ок, однократно) и 100 мг/кг (ежедневно в течение 5 дней, суммарная доза - 500 мг/кг)) удовлетворительно переносилось животными и не приводило к их гибели от токсичности.

Исследования биоэквивалентности оксикобаламина показали, что исследуемая и фармакопейная субстанция Ок характеризуются одинаковыми биологическими свойствами - цитотоксической активностью in vitro, противоопухолевой эффективностью in vivo и токсичностью.

Таким образом, разработан технологичный способ получения оксикобаламина, обеспечивающий получение его с высоким выходом и с показателями качества (как физико-химическими, так и биологическими), соответствующими требованиям ВФС на оксикобаламин субстанцию (ВФС 42-660-99).

Способ получения оксикобаламина электрохимическим восстановлением Со³⁺ цианокобаламина до Со²⁺ цианокобаламина и последующим окислением последнего кислородом воздуха с образованием оксикобаламина, отличающийся тем, что восстановление проводят в мембранном электролизере на титановом катоде в гальваностатическом режиме при плотности тока 5,0-15 А/дм² в водном растворе соляной кислоты и температуре 28-40°С, а образующийся оксикобаламин выделяют осаждением из водно-ацетоновой смеси при охлаждении.